非洛地平納米晶的固體化及大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

吳玉萍,李芳平,周 盾

1.武漢市紅十字會(huì)醫(yī)院中醫(yī)科,武漢 430015;2.武漢市紅十字會(huì)醫(yī)院藥劑科,武漢 430015;3.武漢市第一醫(yī)院中醫(yī)科,武漢 430015

非洛地平為二氫吡啶類鈣通道阻滯劑,通過選擇性擴(kuò)張小動(dòng)脈而達(dá)到降血壓作用[1],由于其溶解度較差(溶解度<0.5 μg·mL-1)[2],并且存在肝臟首過效應(yīng)[3],導(dǎo)致口服生物利用度較低(約為15%)[4]。目前已經(jīng)開發(fā)了幾種口服制劑來(lái)提高非洛地平的口服生物利用度,包括固體脂質(zhì)納米粒[5]、自乳化釋藥系統(tǒng)[6]、固體分散體[7]和介孔二氧化硅納米粒[8]等。納米晶是由藥物和穩(wěn)定劑(高分子聚合物和/或表面活性劑)構(gòu)成的粒徑小于1 μm(通常為200～500 nm)的膠體分散體[9],其在提高藥物溶出速率、改善藥物生物利用度、降低藥物毒性和不良反應(yīng)等方面具有顯著優(yōu)勢(shì)[10]。本研究采用介質(zhì)研磨法將非洛地平制備成納米晶,并通過流化床層積上藥技術(shù)將其固化到蔗糖丸芯上,制得非洛地平納米晶微丸[11],并通過大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)評(píng)價(jià)其口服生物利用度,為改善非洛地平的口服生物利用度提供一種有效方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DRS2000高速高剪切乳化分散機(jī)(德國(guó)IKA公司);DYNO-Mill Research Lab介質(zhì)研磨機(jī)(華爾寶機(jī)械有限公司);氧化鋯珠粒(直徑為0.4 mm,萍鄉(xiāng)市中歐新材料有限公司);Malvern Zetasizer Nano ZSE納米粒度電位儀(英國(guó)馬爾文公司);FEI Nova 400型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(美國(guó)FEI公司);RT600溶出度儀(深圳市銳拓儀器設(shè)備有限公司);Midi Glatt型流化床(德國(guó)格拉特有限公司);DSC3型差示掃描量熱儀(梅特勒-托利多國(guó)際有限公司)。

1.2 試藥

非洛地平(江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)股份有限公司,批號(hào)20200311,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%);聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP K30,德國(guó)巴斯夫有限公司);羥丙基纖維素SSL(HPC SSL,日本曹達(dá)株式會(huì)社);吐溫-80(Tween-80,湖南新綠方藥業(yè)有限公司);蔗糖丸芯(杭州高成生物營(yíng)養(yǎng)技術(shù)有限公司);維生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS,上海昌為醫(yī)藥輔料技術(shù)有限公司);去離子水(實(shí)驗(yàn)室自制);非洛地平片(規(guī)格:5 mg,阿斯利康制藥公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 非洛地平納米晶的制備

采用介質(zhì)研磨法制備非洛地平納米晶[12]。稱取HPC SSL 1 g和TPGS 0.1 g,加水至100 mL,攪拌至完全溶解;另稱取粒徑(D90)約為5～10 μm的非洛地平原料藥12.5 g,加入到上述溶液中,分散均勻后經(jīng)高速高剪切乳化機(jī)以10 000 r·min-1剪切分散10 min;將上述非洛地平混懸液加入到介質(zhì)研磨機(jī)中,并按照藥物溶液體積與研磨介質(zhì)體積比為1∶1加入直徑為0.4 mm的氧化鋯珠粒,設(shè)定研磨速度為2 500 r·min-1,研磨時(shí)間為4 h,即得到非洛地平納米晶。

2.2 非洛地平納米晶微丸的制備

以蔗糖丸芯為載體通過流化床層積上藥工藝將非洛地平納米晶負(fù)載到蔗糖丸芯表面。取新制備的非洛地平納米晶100 mL,加入PVP K30 4 g攪拌至完全溶解,即得到非洛地平納米晶載藥溶液,備用;稱取蔗糖丸芯400 g(丸芯直徑為20～40目),置于流化床中,預(yù)熱后進(jìn)行丸芯載藥;微丸層級(jí)上藥工藝參數(shù)為:進(jìn)風(fēng)溫度為45～50 ℃,物料溫度為35～38 ℃,風(fēng)機(jī)頻率為20～25 Hz,噴液速率為2～4 mL·min-1,霧化壓力為1.5～2.0 bar,工藝參數(shù)需根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)節(jié),直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束;將制備的非洛地平納米晶微丸在40 ℃烘箱中干燥過夜,備用。

2.3 納米晶微丸質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.3.1微丸層積上藥前、后質(zhì)量對(duì)比 取非洛地平納米晶微丸,加入去離子水,輕輕振搖后直至微丸完全消散,溶液中無(wú)肉眼可見顆粒,取上述溶液測(cè)定粒徑分布、PDI和Zeta電位,并與同一批非洛地平納米晶的粒徑分布、PDI和Zeta電位進(jìn)行比較。每份樣品測(cè)定3次,取平均值。結(jié)果見表1。

表1 非洛地平納米晶微丸層積上藥前后質(zhì)量對(duì)比

結(jié)果顯示,微丸層積上藥前后其粒徑、PDI和Zeta電位與載藥前相比幾乎無(wú)變化,說明微丸層積上藥工藝不會(huì)對(duì)非洛地平納米晶質(zhì)量產(chǎn)生影響[13]。

2.3.2掃描電鏡觀察 取少量經(jīng)去離子水適當(dāng)稀釋的非洛地平納米晶鋪展到錫箔紙表面,自然風(fēng)干,使用導(dǎo)電膠帶將樣品黏附到樣品臺(tái)上,真空條件下采用30 mA電流對(duì)樣品噴金,在掃描電鏡下觀察其微觀形態(tài),并拍攝照片,見圖1。由圖1可知,非洛地平納米晶呈不規(guī)則狀顆粒狀,其粒徑大部分在100～400 nm范圍內(nèi)分布。

圖1 非洛地平納米晶掃描電鏡圖

2.3.3差示掃描量熱法(DSC) 使用DSC法對(duì)非洛地平原料藥、穩(wěn)定劑、非洛地平原料藥與穩(wěn)定劑的物理混合物和非洛地平納米晶進(jìn)行熱分析,以評(píng)估非洛地平納米晶中藥物的存在形式[14]。精密稱取上述樣品各5～8 mg,分別置于鋁鍋中,密封,并在30 mL·min-1的氮?dú)饬飨乱? ℃·min-1的升溫速率將樣品從25 ℃加熱至200 ℃,同時(shí)以密封的空鋁鍋?zhàn)鳛閷?duì)照,結(jié)果見圖2。

圖2 原料藥(a)、穩(wěn)定劑(b)、物理混合物(c)和納米晶(d)的DSC圖

測(cè)定結(jié)果顯示,非洛地平原料藥和物理混合物均在147.5 ℃出現(xiàn)特征吸熱峰,而非洛地平納米晶在141.4 ℃出現(xiàn)了特征吸熱峰,與原料藥相比,納米晶的特征吸熱峰出現(xiàn)了輕微前移,熔點(diǎn)有所降低,這可能是由于非洛地平在研磨過程中降低了其內(nèi)聚能,導(dǎo)致其熔點(diǎn)降低[15]。

2.3.4體外溶出度比較 通過體外溶出實(shí)驗(yàn)比較非洛地平納米晶、納米晶微丸和非洛地平片的體外藥物溶出速率,參照《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)2020年版,攪拌槳轉(zhuǎn)速為50 r·min-1,pH1.2鹽酸溶液(吐溫-80質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1)作為溶出介質(zhì),體積為500 mL,水浴溫度為37 ℃±0.5 ℃,分別取非洛地平納米晶、納米晶微丸和非洛地平片(含藥物量均為5 mg)加入到溶出杯中,分別在5、10、15、30、45、60 min取出溶出介質(zhì)5 mL(同時(shí)補(bǔ)液),經(jīng)0.1 μm微孔濾膜過濾,濾液經(jīng)適當(dāng)稀釋后通過高效液相色譜(HPLC)法定量分析,結(jié)果見表2。

表2 非洛地平納米晶、納米晶微丸和非洛地平片的體外溶出度

結(jié)果顯示,與非洛地平片相比,非洛地平納米晶和納米晶微丸中的藥物溶出速度和程度均得到顯著提高。

2.4 大鼠藥動(dòng)學(xué)研究

2.4.1色譜條件 色譜柱為Phenomenex C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),保護(hù)柱為Phenomenex C18柱(4.0 mm×3.0 mm,5 μm),流動(dòng)相為乙腈-水(65∶35),檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm,柱溫為30 ℃,流速為1.0 mL·min-1,進(jìn)樣量為20 μL。

2.4.2血漿處理 用乙醚麻醉SD大鼠,使用毛細(xì)管經(jīng)大鼠眼眶后神經(jīng)叢采血,并收集到內(nèi)壁涂有肝素的離心管中離心,分離血漿,取大鼠血漿100 μL,加入質(zhì)量濃度為300 μg·mL-1的雙氯芬酸鈉水溶液10 μL作為內(nèi)標(biāo),渦旋振蕩30 s,加入乙腈190 μL,渦旋3 min,離心,沉淀出血漿蛋白,取上清液轉(zhuǎn)移到尖底離心管中,氮?dú)庀聯(lián)]干溶劑,殘留物用100 μL流動(dòng)相復(fù)溶,以10 000 r·min-1離心5 min,取上清液按照2.4.1項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)藥物含量,計(jì)算藥物質(zhì)量濃度。

2.4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法學(xué)驗(yàn)證 配制不同質(zhì)量濃度的非洛地平溶液,并分別精密移取20 μL加入到大鼠血漿100 μL中,再分別加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μL,渦旋混合,配制質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 μg·mL-1的非洛地平血漿樣品,按照2.4.2項(xiàng)下方法處理血漿樣品,采用2.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,以主藥峰面積(As)與內(nèi)標(biāo)物峰面積(Ai)之比作為縱坐標(biāo),以主藥質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo),得到線性回歸方程為:As/Ai=9.361C-0.216(r=0.998 7),線性關(guān)系良好。

另配制非洛地平質(zhì)量濃度分別為0.1、5.0、50.0 μg·mL-1的血漿樣品,各3份,加入內(nèi)標(biāo)溶液,渦旋混合,按照2.4.2項(xiàng)下方法處理血漿樣品,采用2.4.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,評(píng)價(jià)該方法的精密度和提取回收率。結(jié)果顯示,低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度非洛地平溶液的方法精密度RSD值分別為6.4%、4.9%、5.4%,提取回收率分別為95.7%、96.1%、98.9%,說明本方法重復(fù)性好,提取回收率高,可用于血漿樣品分析。

2.4.4動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 取12只SD大鼠,體質(zhì)量為(220±20) g,雌雄各半,實(shí)驗(yàn)前12 h內(nèi)禁食不禁水。將大鼠隨機(jī)分為2組,第一組大鼠灌胃給予非洛地平混懸液(分散介質(zhì)為PVP K30溶液),第二組大鼠灌胃給予非洛地平納米晶微丸,給藥劑量均為30 mg·kg-1,在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)(0.083、0.167、0.25、0.5、0.75、1、2、4、8、12、24 h)通過眼眶后神經(jīng)叢采血0.5 mL,并收集到肝素化離心管中,離心,分離血漿,于-18 ℃下冷凍保存,測(cè)定前將血樣在室溫環(huán)境下解凍,按照2.4.2項(xiàng)下方法處理血漿樣品,采用2.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,用3P87軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù),見表3,并繪制血藥質(zhì)量濃度時(shí)間曲線,見圖3。

表3 非洛地平納米晶微丸和非洛地平混懸液在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

圖3 非洛地平納米晶微丸和非洛地平混懸液的平均血藥質(zhì)量濃度與時(shí)間曲線

大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示,與非洛地平混懸液相比,非洛地平納米晶微丸Cmax顯著提高,為非洛地平混懸液的3.70倍;納米晶微丸的AUC(0～∞)是非洛地平混懸液的2.43倍,說明非洛地平納米晶微丸可顯著提高藥物的口服生物利用度。

3 討論

目前已有報(bào)道的納米晶固體化方式主要包括噴霧干燥法、噴霧冷凍干燥法、冷凍干燥法和微丸層積上藥法等[16]。其中,微丸層積上藥法對(duì)設(shè)備、工藝要求較簡(jiǎn)單,且易于操作,重復(fù)性良好,已在納米晶固體化的研究中獲得廣泛應(yīng)用,因此本研究以蔗糖丸芯為載體采用流化床層積上藥工藝將非洛地平納米晶固化成納米晶微丸。但在微丸層積上藥過程中,非洛地平納米晶會(huì)短暫地暴露在熱環(huán)境中,穩(wěn)定性降低,此外,隨著固化的進(jìn)行,穩(wěn)定劑最終會(huì)連同納米晶被固化在微丸表面,保護(hù)作用消失,這些因素都可能導(dǎo)致納米晶體的不可逆聚集[17]。本研究通過實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),非洛地平納米晶在層積上藥后,其平均粒徑、PDI、Zeta電位以及藥物溶出速率與上藥前相比幾乎無(wú)變化,說明微丸層積上藥工藝不會(huì)對(duì)非洛地平納米晶質(zhì)量產(chǎn)生影響。