白藜蘆醇苷對(duì)IgA腎病大鼠炎性因子及腎功能的影響

于建軍,王 慧,員文靜,曲礦云,徐亞沛

1.黃河三門峽醫(yī)院腎內(nèi)科,三門峽 472000;2.黃河三門峽醫(yī)院急診科,三門峽 472000;3.鄭州市第三人民醫(yī)院腎內(nèi)科,鄭州 450000

IgA腎病是一種常見的原發(fā)性腎小球腎炎疾病,主要特征為多聚IgA分子及其免疫復(fù)合物在腎小球系膜沉積[1]。炎性反應(yīng)與IgA腎病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6和IL-1β等炎癥因子可促進(jìn)IgA的沉積[2]。白藜蘆醇苷是廣泛存在于植物內(nèi)的一種多酚類化合物,具有抗氧化、抗炎等作用[3-4]。研究表明,白藜蘆醇苷可通過減輕炎性反應(yīng)、減少血清中肌酐和血尿素氮的含量,從而防止腎缺血再灌注損傷的發(fā)生[5]。本研究用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證白藜蘆醇苷對(duì)IgA腎病大鼠腎的保護(hù)作用,以及對(duì)炎性反應(yīng)的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Axio Vert.A1型光學(xué)顯微鏡[卡爾蔡司光學(xué)(中國(guó))有限公司];MultiskanTMFC型酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司);AU5800型生化分析儀(貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)有限公司);化學(xué)發(fā)光成像儀(美國(guó)Invitorgen公司)。

1.2 試藥

白藜蘆醇苷(批號(hào)190126,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);TNF-α、IL-6和IL-1βELISA試劑盒(批號(hào)分別為190315、190221、190417,廈門慧嘉生物科技有限公司);葡萄球菌腸毒素B(批號(hào)SYA041,北京百奧萊博科技有限公司);FITC標(biāo)記的IgA抗體(批號(hào)190323,北京邁瑞達(dá)科技有限公司);兔抗大鼠Notch1、Jagged1一抗和山羊抗兔二抗(批號(hào)分別為ab167441、ab7771、ab109489,美國(guó)Abcam公司)。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠48只,8周齡,體質(zhì)量(220±10) g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。所有大鼠均飼養(yǎng)于溫度為(25±2) ℃、濕度為50%～60%的SPF環(huán)境中,高壓滅菌的水和飼料隨意飲食。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)鄭州市第三人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心批準(zhǔn)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和建模

將48只雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組:空白對(duì)照組、IgA腎病模型組、白藜蘆醇苷組和氯沙坦組,每組12只。參照文獻(xiàn)中的方法[6]建立IgA腎病模型。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,IgA腎病模型組、白藜蘆醇苷組和氯沙坦組大鼠灌服牛血清白蛋白100 mg·kg-1·d-1。6周后,尾靜脈注射經(jīng)生理鹽水稀釋的牛血清白蛋白10 mg·kg-1,每周1次,連續(xù)注射3次。自第8周起,尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素B 0.4 mg·kg-1,每周1次,連續(xù)注射3次。自第9周起,白藜蘆醇苷組以20 mg·kg-1·d-1白藜蘆醇灌胃,氯沙坦組以16.8 mg·kg-1·d-1氯沙坦灌胃,2種藥品均用生理鹽水溶解后灌入。空白對(duì)照組和IgA腎病模型組灌入等體積的生理鹽水,連續(xù)處理8周。

2.2 24 h尿蛋白檢測(cè)

末次干預(yù)后,收集所有大鼠24 h的尿液,記錄尿量。采用尿蛋白試劑盒(比色法)檢測(cè)尿蛋白的濃度。24 h尿蛋白=尿蛋白濃度×24 h尿量。

2.3 ELISA檢測(cè)血清中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平以及血肌酐、尿素氮的含量

各組大鼠灌胃8周后,用戊巴比妥鈉麻醉,腹主動(dòng)脈采血8 mL,37 ℃水浴30 min后,以3 000 r·min-1離心5 min,分離上清液,保存于-20 ℃。IL-1β、IL-6和TNF-α的檢測(cè)根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作,將對(duì)照品梯度稀釋后,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,依次加入100 μL樣品,孔板覆膜后置于37 ℃孵育。孵育1 h后,棄去上清液,依次加入抗體工作液和酶結(jié)合液,37 ℃孵育30 min。加入顯色液,避光孵育10 min,加入終止液,用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)。血肌酐、尿素氮的含量用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 HE染色觀察腎組織病理學(xué)變化

取血后,剝離腎臟,取每組6只大鼠的腎臟放入福爾馬林中固定24 h。經(jīng)過常規(guī)脫水、浸蠟、包埋和切片(厚度4 μm)后,進(jìn)行HE染色。于光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠腎組織的病理學(xué)變化。

2.5 免疫熒光法檢測(cè)腎組織中IgA沉淀情況

腎切片用磷酸鹽緩沖生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)漂洗3次,每次3 min,滴加經(jīng)異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標(biāo)記的IgA抗體(1∶50),37 ℃孵育1 h后,用PBS漂洗3次,每次5 min,用甘油封片。于熒光顯微鏡下觀察IgA沉淀情況。

2.6 Western blot檢測(cè)腎組織中Notch信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平

將各組剩余6只大鼠的腎組織制成勻漿(90 Hz,5 min),加入放射免疫沉淀測(cè)定(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)緩沖液和苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonylfluoride or phenylmethylsulfonyl fluorid,PMSF)抑制蛋白降解液(100∶1)將樣本裂解后提取各組總蛋白。用BCA試劑檢測(cè)蛋白質(zhì)的總濃度,將各組總蛋白的濃度調(diào)為一致后,將其于100 ℃進(jìn)行變性后保存于-20 ℃。用SDS-PAGE電泳分離總蛋白后,將其轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜。用質(zhì)量濃度為50 g·L-1的脫脂牛奶封閉2 h,用TBST洗滌3次,每次10 min后,將其放入對(duì)應(yīng)的一抗(Notch1、Jagged1和GAPDH)和一抗稀釋混懸液(1∶1 000)中,4 ℃孵育過夜。再用TBST洗滌3次,放入二抗和二抗稀釋液(1∶4 000)混懸液中,室溫孵育2 h。用TBST洗滌3次,每次10 min,將超敏發(fā)光液ECL滴在PVDF膜上,放入化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行蛋白顯影。用Image J軟件分析結(jié)果,以GAPDH為內(nèi)參對(duì)蛋白表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠24 h尿蛋白的比較

與空白對(duì)照組[(37.89±1.94) μg]比較,IgA腎病模型組24 h尿蛋白[(225.37±4.84) μg]顯著增加(P<0.05)。與IgA腎病模型組比較,白藜蘆醇苷組[(84.37±2.51) μg]和氯沙坦組[(72.27±1.81) μg]24 h尿蛋白顯著降低(P<0.05)。氯沙坦組24 h尿蛋白與白藜蘆醇苷組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.2 各組大鼠血清炎性因子的比較

IgA腎病模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)。白藜蘆醇苷組和氯沙坦組IL-1β、IL-6和TNF-α的水平均顯著低于IgA腎病模型組(P<0.05);氯沙坦組IL-1β、IL-6和TNF-α的水平與白藜蘆醇苷組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表1。

表1 大鼠血清炎性因子含量的比較

3.3 各組大鼠腎功能指標(biāo)的比較

IgA腎病模型組大鼠血清中血肌酐、尿素氮的含量均明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)。白藜蘆醇苷組和氯沙坦組血肌酐、尿素氮的含量均顯著低于IgA腎病模型組(P<0.05);氯沙坦組血肌酐、尿素氮含量與白藜蘆醇苷組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表2。

表2 大鼠血肌酐、尿素氮含量的比較

3.4 各組大鼠腎組織病理學(xué)的比較

HE染色結(jié)果見圖1。由圖1可見,空白對(duì)照組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰,系膜細(xì)胞和基質(zhì)未出現(xiàn)增生現(xiàn)象。IgA腎病模型組大鼠腎組織腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)發(fā)生彌漫性增生,局灶性系膜細(xì)胞增生,腎小管灶狀萎縮,伴有纖維化。

注:A.空白對(duì)照組;B.IgA腎病模型組;C.白藜蘆醇苷組;D.氯沙坦組。

白藜蘆醇苷組和氯沙坦組腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)彌漫性增生情況減輕,局灶性系膜細(xì)胞增生較少,無纖維化。

3.5 各組大鼠組織IgA沉積的比較

空白對(duì)照組大鼠腎小球系膜區(qū)無明顯IgA免疫復(fù)合物沉積。IgA腎病模型組、白藜蘆醇苷組和氯沙坦組均可見IgA免疫復(fù)合物沉積,IgA腎病模型組熒光強(qiáng)度顯著高于白藜蘆醇苷組和氯沙坦組。結(jié)果見圖2。

注:A.空白對(duì)照組;B.IgA腎病模型組;C.白藜蘆醇苷組;D.氯沙坦組。

3.6 各組大鼠腎組織Notch信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平的比較

Western blot結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組比較,IgA腎病模型組Notch1、Jagged1蛋白的表達(dá)量顯著上升(P<0.05);與IgA腎病模型組比較,白藜蘆醇苷組和氯沙坦組Notch1、Jagged1蛋白的表達(dá)量顯著降低(P<0.05);白藜蘆醇苷組與氯沙坦組Notch1、Jagged1蛋白的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見圖3。

注:A.Western blot檢測(cè)4組大鼠Notch1、Jagged1蛋白的表達(dá)量;B.4組大鼠Notch1、Jagged1蛋白表達(dá)量統(tǒng)計(jì)。與空白對(duì)照組比較,*P<0.05;與IgA腎病模型組比較,#P<0.05。

4 討論

IgA腎病是臨床常見的原發(fā)性腎小球疾病,發(fā)病率占原發(fā)性腎小球疾病的26%～34%[7]。IgA腎病的主要病理機(jī)制是腎小球系膜區(qū)IgA免疫復(fù)合物沉積,腎小球系膜細(xì)胞增殖導(dǎo)致腎功能損害,從而使腎功能指標(biāo)出現(xiàn)異常(血肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白增加)[8]。研究表明,炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α參與腎病的發(fā)生和發(fā)展,主要是由于炎性因子刺激血管內(nèi)皮因子的分泌,使腎小球系膜細(xì)胞增生,增加腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性,加重腎功能的損傷,影響氮質(zhì)代謝廢物的排泄,使肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白水平升高[9-11]。

白藜蘆醇苷是具有抗氧化功能的多酚類化合物[12]。白藜蘆醇苷可使肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白的水平下降,從而延緩糖尿病腎病的進(jìn)展[13]。研究表明,白藜蘆醇苷能夠減輕炎性反應(yīng),防止腎缺血再灌注損傷的發(fā)生[14],但白藜蘆醇苷對(duì)IgA腎病的作用機(jī)制尚不清楚?；诖?本研究探究白藜蘆醇苷對(duì)IgA腎病大鼠腎功能的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,用白藜蘆醇苷干預(yù)IgA腎病大鼠模型后,腎病大鼠腎功能指標(biāo)肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白含量顯著降低。HE染色和IgA結(jié)果顯示,白藜蘆醇苷可以減輕IgA腎病大鼠腎組織的損傷,并減少IgA的沉積。藜蘆醇苷組大鼠肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白的含量以及IgA沉淀與氯沙坦組無明顯差異,提示白藜蘆醇苷與氯沙坦一樣,具有修復(fù)腎功能的作用。

炎性反應(yīng)會(huì)引起機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),直接損傷腎小管內(nèi)皮細(xì)胞,導(dǎo)致腎小球微血管損傷,促進(jìn)系膜區(qū)異常蛋白的沉積,從而加重腎功能損傷[15-16]。白藜蘆醇苷可以降低IgA腎病大鼠炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平,且與氯沙坦組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了進(jìn)一步探究白藜蘆醇苷對(duì)IgA腎病大鼠作用的機(jī)制,本研究檢測(cè)了IgA腎病大鼠腎組織中Notch信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平。Notch信號(hào)通路與腎病關(guān)系密切,其表達(dá)水平異常會(huì)引起腎間質(zhì)纖維化和致硬化[17-18]。研究顯示,Notch1可以通過促進(jìn)Jagged1的表達(dá),激活炎性因子的分泌,導(dǎo)致IgA腎病的加重[19-20]。本研究結(jié)果顯示,白藜蘆醇苷通過抑制IgA腎病大鼠腎組織中Notch信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白Notch1、Jagged1的表達(dá)水平,減輕炎癥反應(yīng)。

綜上所述,白藜蘆醇苷可抑制Notch信號(hào)通路,抑制炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá),減輕腎組織中IgA的沉積,并降低肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白的含量,從而發(fā)揮對(duì)腎功能的修復(fù)作用。本研究?jī)H討論了白藜蘆醇苷在IgA腎病大鼠體內(nèi)的影響,未來將探究白藜蘆醇苷在體外實(shí)驗(yàn)中的作用,進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)論。