脂肪乳改善布比卡因致大鼠心臟毒性機(jī)制的研究

張淑娟,孟令群,黃翠影,韓慶波,蔡立松,李 軍*

1.唐山市開灤總醫(yī)院手麻科,唐山 063000;2.唐山市婦幼保健院兒內(nèi)科,唐山 063000

布比卡因(bupivacaine,BPV)是臨床上常用的一種長(zhǎng)效酰胺類局部麻醉藥,具有高效、長(zhǎng)效、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)[1]。但BPV局部吸收過(guò)量或因操作不慎誤入血管會(huì)導(dǎo)致血漿藥物濃度迅速升高,一旦超過(guò)機(jī)體耐受能力,就會(huì)引起致命的心臟中毒反應(yīng),甚至導(dǎo)致心臟停搏[2]。腎上腺素是治療心血管系統(tǒng)功能衰竭的首選藥物,但其無(wú)法糾正由BPV引起的心臟功能抑制,反而會(huì)加重臨床患者的中毒癥狀[3]。脂肪乳(lipid emulsion,LE)是能量和脂肪酸的供體,其對(duì)臟器的保護(hù)作用越來(lái)越受到學(xué)者們的關(guān)注,有研究表明其能夠有效治療由局部麻醉藥引起的全身毒性[4]。近年來(lái),有臨床個(gè)案和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,LE對(duì)BPV所致的心臟毒性具有良好的救治作用[5-6]。PARTOWNAVID P等[7]認(rèn)為,LE減輕BPV所致的心臟毒性可能與脂肪酸氧化以及抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔的開放有關(guān)。本研究旨在探究LE改善BPV致大鼠心臟毒性的機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Ti2型倒置顯微鏡(日本Nikon公司);SEN27103型電子刺激器(美國(guó)IonOptix公司);Allegra TM 1E-80K型高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);心電圖儀(BL-420 F型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),成都泰盟科技有限公司);Tanon 2500型多功能凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

1.2 試藥

質(zhì)量濃度為0.234 g·mL-1的LE注射液(華瑞制藥有限公司);質(zhì)量濃度為5 g·L-1的鹽酸布比卡因注射液(蕪湖康奇制藥有限公司);生理鹽水(四川科倫藥業(yè)股份有限公司);應(yīng)激指標(biāo)與心肌酶相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所);BCA蛋白濃度試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);B淋巴細(xì)胞瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl2)、Bcl2相關(guān)X蛋白(Bcl2 associated X protein,Bax)、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p38、p-ERK1/2、p-JNK、p-p38和GAPDH一抗(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);HRP標(biāo)記IgG二抗(英國(guó)Abcam公司)。

1.3 動(dòng)物

50只成年雄性SD大鼠,體質(zhì)量280～350 g,由醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào)SCXK(蘇)2018-0315。飼養(yǎng)條件和流程均符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》,在適宜的條件下[溫度(21±2) ℃,濕度45%～65%,12 h光/暗循環(huán)]進(jìn)行飼養(yǎng),大鼠自由飲水和進(jìn)食。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過(guò)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批。

2 方法

2.1 分組及實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽?/h3>

將30只大鼠分為3組,空白對(duì)照組、布比卡因?qū)φ战M和布比卡因+脂肪乳組?？瞻讓?duì)照組不做任何處理;用布比卡因?qū)φ战M和布比卡因+脂肪乳組構(gòu)建心臟毒性模型。對(duì)用于造模的大鼠,緩慢腹腔注射質(zhì)量濃度為100 g·L-1的水合氯醛(3 mL·kg-1)進(jìn)行麻醉,將大鼠以仰臥位固定于手術(shù)操作臺(tái)上,用3根針式電極針分別插入大鼠左、右上肢及左下肢皮下,監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖(electrocardiogram,ECG)。刮凈大鼠左頸部體毛,消毒鋪巾,斜行切開皮膚1～2 cm,鈍性分離皮下組織和肌肉,使其左頸總動(dòng)脈暴露,阻斷近心端血管,并置入24 G套管針穿刺動(dòng)脈,置入導(dǎo)管,連接壓力傳感器,用于監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓(mean arterialpressure,MAP)。刮凈大鼠右頸部和大腿根部體毛,消毒鋪巾,斜行切開皮膚1～2 cm,鈍性分離皮下組織和肌肉,使其右頸內(nèi)動(dòng)脈、股靜脈暴露,置入24 G套管針,用于給藥。大鼠經(jīng)20 s靜脈注射質(zhì)量濃度為5 g·L-1的布比卡因30 mg·kg-1誘發(fā)心臟停搏,以構(gòu)建局麻藥致大鼠心臟毒性模型。復(fù)蘇時(shí),布比卡因+脂肪乳組大鼠靜脈注射質(zhì)量濃度為0.234 g·mL-1的脂肪乳劑5 mL·kg-1,布比卡因?qū)φ战M靜脈注射生理鹽水負(fù)荷量5 mL·kg-1,隨后均以1 mL·kg-1·min-1的速度靜脈輸注3 min。于大鼠自主循環(huán)恢復(fù)120 min時(shí)將其處死,取左心臟組織。

2.2 各組大鼠心電圖測(cè)定

緩慢腹腔注射質(zhì)量濃度為100 g·L-1的水合氯醛(3 mL·kg-1)麻醉大鼠,將大鼠以仰臥位固定于手術(shù)操作臺(tái)上,將心電圖儀針狀電極與大鼠連接,記錄各組大鼠的心電圖。

2.3 心臟毒性大鼠心肌組織病理學(xué)形態(tài)評(píng)估

心肌組織標(biāo)本用質(zhì)量濃度為100 g·L-1的中性福爾馬林固定,用石蠟包埋,5 μm厚度切片,用蘇木精和伊紅染色,通過(guò)HE染色切片觀察心肌組織病理變化,由2名資深的組織病理工作者隨機(jī)盲評(píng)。

2.4 應(yīng)激指標(biāo)與心肌酶相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

處死各組大鼠前,進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血,分離血清,用試劑盒檢測(cè)血清氧化應(yīng)激指標(biāo)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性,丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、NADPH氧化酶-2(NADPH oxidase 2,NOX-2)和一氧化氮水平及心肌酶相關(guān)指標(biāo)肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase MB,CK-MB)、心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin-T,cTn-T)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)和腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)的水平。

2.5 Western blot檢測(cè)心肌組織凋亡相關(guān)蛋白與絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

取適量心肌組織加入RIPA裂解,置于冰上振蕩40 min,4 ℃12 000 r·min-1離心10 min,取上清,用BCA法檢測(cè)樣品蛋白濃度,定量至50～70 μg;經(jīng)SDS-PAGE電泳,并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,加入質(zhì)量濃度為50 g·L-1脫脂牛奶,封閉1.5 h,分別加入一抗稀釋液[Bcl2(1∶1 000)、Bax(1∶2 000)、cleaved caspase-3(1∶2 000)、cleaved caspase-9(1∶2 000)、ERK1/2(1∶2 000)、JNK(1∶1 000)、p38(1∶1 000)、p-ERK1/2(1∶250)、p-JNK(1∶1 000)、p-p38(1∶1 000)和GAPDH(1∶10 000)],4 ℃孵育過(guò)夜,加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育1.5 h,滴加ECL發(fā)光液,反應(yīng)30 s,用多功能凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè),并用Image J軟件計(jì)算灰度值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 LE對(duì)BPV致心臟毒性大鼠心電圖的影響

與空白對(duì)照組比較,布比卡因?qū)φ战M大鼠的心電圖出現(xiàn)明顯異常,表現(xiàn)為ST段改變,給予LE處理后,大鼠心電圖異常明顯改善。結(jié)果見圖1。

注:A.空白對(duì)照組;B.布比卡因?qū)φ战M;C.布比卡因+脂肪乳組。

3.2 LE對(duì)BPV致心臟毒性大鼠心肌組織病理學(xué)的影響

空白對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,心肌纖維排列整齊,心肌細(xì)胞未出現(xiàn)萎縮或肥大;布比卡因?qū)φ战M大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯肥大、壞死,損傷嚴(yán)重,心肌纖維排列紊亂,出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);給予LE處理后,大鼠心肌細(xì)胞肥大、壞死明顯減輕,心肌纖維排列較整齊,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。結(jié)果見圖2。

注:A.空白對(duì)照組;B.布比卡因?qū)φ战M;C.布比卡因+脂肪乳組;*表示廣泛分離和破壞的壞死心肌纖維區(qū)域。

3.3 LE對(duì)BPV致心臟毒性大鼠心肌酶相關(guān)指標(biāo)的影響

與空白對(duì)照組比較,布比卡因?qū)φ战M大鼠血清CK-MB、cTn-T、LDH和BNP的水平明顯升高(P<0.05);與布比卡因?qū)φ战M相比,布比卡因+脂肪乳組大鼠血清CK-MB、cTn-T、LDH和BNP的水平明顯降低(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠心肌酶相關(guān)指標(biāo)比較

3.4 LE對(duì)BPV致心臟毒性大鼠應(yīng)激指標(biāo)的影響

與空白對(duì)照組比較,布比卡因?qū)φ战M大鼠血清SOD活性、GSH水平明顯降低(P<0.05),MDA、NOX-2和一氧化氮水平明顯升高(P<0.05);與布比卡因?qū)φ战M相比,布比卡因+脂肪乳組大鼠血清SOD活性、GSH水平明顯升高(P<0.05),MDA、NOX-2和一氧化氮水平明顯降低(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠應(yīng)激指標(biāo)比較

3.5 LE對(duì)BPV致心臟毒性大鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較,布比卡因?qū)φ战M大鼠心肌組織Bcl2蛋白的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);給予LE處理后,Bcl2蛋白的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。結(jié)果見圖3。

注:A.凋亡相關(guān)蛋白Western blot檢測(cè)結(jié)果;B.凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較,與空白對(duì)照組比較,*P<0.05;與布比卡因?qū)φ战M比較,#P<0.05。

3.6 LE對(duì)BPV致心臟毒性大鼠心肌組織MAPK信號(hào)通路的影響

與空白對(duì)照組相比,布比卡因?qū)φ战M大鼠心肌組織ERK1/2、JNK和p38的磷酸化水平升高(P<0.05);給予LE處理后,ERK1/2、JNK和p-38的磷酸化水平明顯降低(P<0.05)。結(jié)果見圖4。

注:A～C.p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK、JNK、p-p38和p38 Western blot檢測(cè)結(jié)果;D～F.p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK、JNK、p-p38和p38蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較,與空白對(duì)照組比較,*P<0.05;與布比卡因?qū)φ战M比較,#P<0.05。

4 討論

BPV一旦誤入血管將會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的不良反應(yīng),尤其是對(duì)心臟和大腦的影響更大[8]。BPV致心臟毒性可引起心臟停搏,目前認(rèn)為BPV引起心臟驟停的機(jī)制主要有兩點(diǎn):第一,通過(guò)影響心臟電傳導(dǎo)引起室性心率失常;第二,通過(guò)抑制線粒體產(chǎn)生ATP,從而抑制心肌能量代謝過(guò)程[9-10]。因此尋找一種治療BPV致心臟毒性的有效方法具有重要的臨床意義。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及離體心臟模型實(shí)驗(yàn)[11-12]結(jié)果表明,LE治療可降低BPV誘導(dǎo)所致的細(xì)胞死亡,促進(jìn)心臟功能的恢復(fù)。有臨床個(gè)案報(bào)道,LE能夠復(fù)蘇酰胺類局部麻醉藥物中毒導(dǎo)致的心臟停搏[13]。但目前LE救治局部麻醉藥物所致心臟毒性的確切機(jī)制尚不完全清楚。本研究通過(guò)靜脈注射質(zhì)量濃度為5 g·L-1的BPV誘發(fā)心臟停搏,構(gòu)建大鼠心臟毒性模型,結(jié)果表明,BPV致心臟毒性大鼠的心電圖發(fā)生明顯異常,心肌組織出現(xiàn)明顯損傷,血清CK-MB、cTn-T、LDH和BNP的水平明顯升高,提示BPV致大鼠心臟毒性模型建立成功。為探討LE對(duì)BPV致心臟毒性大鼠的影響,通過(guò)靜脈注射質(zhì)量濃度為0.234 g·mL-1的LE進(jìn)行復(fù)蘇,結(jié)果顯示,大鼠心電圖異常及心肌組織損傷明顯改善,血清CK-MB、cTn-T、LDH和BNP的水平明顯降低,提示LE對(duì)BPV致心臟毒性具有緩解作用,可明顯改善大鼠心肌功能。CK-MB、cTn-T、LDH和BNP是用于診斷再灌注損傷和心肌缺血的重要標(biāo)志物,OUYANG B等[14]的研究結(jié)果亦表明,CK-MB、cTn-T和LDH的水平降低提示心臟功能好轉(zhuǎn)。

研究證實(shí),BPV致心臟毒性的潛在機(jī)制與心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激密切相關(guān)[15-16]。SOD是一種重要的抗氧化酶,能夠催化超氧自由基還原為過(guò)氧化氫;GSH可直接清除活性氧,間接作為抗氧化酶的輔助因子,SOD、GSH均屬于機(jī)體酶類抗氧化系統(tǒng)[17]。MDA含量能夠提示組織脂質(zhì)過(guò)氧化程度,從而反映細(xì)胞受損程度[18]。NOX-2主要分布于心肌細(xì)胞,其水平上升提示心肌組織氧化應(yīng)激增強(qiáng)[19]。在心肌細(xì)胞中,一氧化氮可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的收縮功能,但其含量過(guò)多則生成過(guò)氧硝酸鹽對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性[20]。本研究結(jié)果顯示,LE可使大鼠血清SOD活性、GSH水平升高,MDA、NOX-2和一氧化氮水平降低,提示LE能夠減輕BPV所致的心肌應(yīng)激損傷。YANG L等[21]通過(guò)觀察LE對(duì)BVP致H9C2心肌細(xì)胞毒性的作用發(fā)現(xiàn),BPV可明顯提高H9C2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平,并引起線粒體功能障礙,LE可顯著逆轉(zhuǎn)由BVP導(dǎo)致的H9C2心肌細(xì)胞毒性。

線粒體對(duì)于細(xì)胞凋亡有著極其重要的作用,其中bcl-2蛋白家族是主要的凋亡調(diào)控因子,包括促凋亡蛋白Bax、caspase-3和抗凋亡蛋白Bcl2,凋亡過(guò)程中Bcl2的表達(dá)下調(diào),Bax和caspase-3的表達(dá)上調(diào)[22]。Bax通過(guò)增加線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的活性,促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放,從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡;而Bcl2通過(guò)影響心肌細(xì)胞線粒體的通透性,抑制細(xì)胞凋亡,從而保護(hù)線粒體的結(jié)構(gòu)和功能[23]。caspase是凋亡過(guò)程中必不可少的部分,線粒體釋放細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),并活化caspase-9,進(jìn)而激活caspase-3,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[24]。本研究中,與空白對(duì)照組比較,布比卡因?qū)φ战M大鼠心肌組織中Bcl2蛋白的表達(dá)水平明顯降低,Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白的表達(dá)水平明顯升高,反映了凋亡在BPV致大鼠心臟毒性中的作用。給予LE處理后,Bcl2蛋白的表達(dá)水平明顯升高,Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白的表達(dá)水平明顯降低,表明LE在BPV致心臟毒性大鼠中發(fā)揮抗凋亡作用,從而保護(hù)心肌細(xì)胞的完整性,最終減輕心肌損傷。林婷婷等[25]研究發(fā)現(xiàn),LE減輕大鼠BPV心臟毒性的機(jī)制可能與抑制線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān),本研究的結(jié)果與之相符。

MAPKs家族是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,除了調(diào)控炎癥介質(zhì)之外,還可參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生理過(guò)程的調(diào)控[26]。MAPK信號(hào)通路涉及ERK1/2、JNK、p38 3條亞通路。有研究表明,活性氧可通過(guò)激活JNK和p38MAPK,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[27]。既往的研究顯示,MAPK信號(hào)通路參與BPV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程[28]。本研究的結(jié)果也證實(shí)MAPK信號(hào)通路在BPV致大鼠心臟毒性中的作用。而給予LE處理后,顯著抑制BPV誘導(dǎo)的MAPKs活化,提示LE的心臟保護(hù)作用可能與調(diào)控MAPK信號(hào)通路有關(guān)。這與PEREIRA S等[29]的研究結(jié)果一致,輸注脂質(zhì)可減輕肥胖相關(guān)疾病引起的肝臟胰島素抵抗,這可能與抑制p38MAPK信號(hào)通路有關(guān)。但LE對(duì)BPV致大鼠心臟毒性的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述,LE可改善BPV致大鼠心臟毒性,減輕心肌應(yīng)激損傷,其機(jī)制可能與調(diào)控MAPK信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。