青藤堿通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路改善大鼠踝關(guān)節(jié)炎的研究

何 龍,葛占洲,伍永權(quán),郭馬瓏

1.濮陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院骨五科,濮陽(yáng) 457000;2.河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院骨科,鄭州 450000

創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎常發(fā)生于踝關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié),是殘疾的重要原因之一[1]。目前由踝部骨折引起的創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎是常見(jiàn)的踝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎,在臨床上內(nèi)踝骨折脫位尤為常見(jiàn)[2]。目前治療踝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的主要方案為保守治療和手術(shù)治療[3]。青藤堿是清風(fēng)藤中主要的有效成分,具有鎮(zhèn)痛、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用。青藤堿在臨床主要用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)疾病等[4]。青藤堿可通過(guò)調(diào)節(jié)抗炎因子的表達(dá)、抑制炎癥反應(yīng),從而改善踝關(guān)節(jié)部位的病變[5]。研究表明,青藤堿通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號(hào)通路,發(fā)揮抗腫瘤作用[6]。課題組前期的研究發(fā)現(xiàn),青藤堿可抑制骨關(guān)節(jié)炎,對(duì)關(guān)節(jié)軟骨具有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)外力進(jìn)行大鼠踝關(guān)節(jié)脫位骨折構(gòu)建大鼠踝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型,以揭示青藤堿改善踝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

164-5056型電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司);Multiskan Sky酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司);Light Ccler Ly C480型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(瑞士羅氏公司);MoticBA 210型生物顯微鏡(北京汗盟紫星儀器儀表有限公司)。

1.2 試藥

青藤堿(麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司);細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP-13)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司);質(zhì)量濃度為4 g·mL-1的多聚甲醛(濟(jì)南百博生物技術(shù)股份有限公司);戊巴比妥鈉(上海信裕生物科技有限公司);番紅O(北京博潤(rùn)萊特科技有限公司);兔抗大鼠CC類(lèi)趨化因子配體2(CC-chemokine ligand 2,CCL2,貨號(hào)ab100777),Ⅱ型膠原蛋白(type Ⅱ collagen,COL Ⅱ,貨號(hào)ab188570),軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COMP,貨號(hào)ab260037),磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K,貨號(hào)ab154598),p-PI3K(貨號(hào)ab278545),蛋白激酶B(protein kinase B,Akt,貨號(hào)ab126433),p-Akt(貨號(hào)ab38449)和GAPDH(貨號(hào)ab8245)一抗和山羊抗兔IgG(貨號(hào)ab150077),均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;超敏發(fā)光液(北京四正柏生物科技有限公司)。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠50只,12周齡,體質(zhì)量(230±10) g,許可證號(hào)SCXK(京)2016-0011,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 分組和建模

隨機(jī)將50只SD大鼠分為5組:空白組、模型組、青藤堿高劑量組、青藤堿中劑量組和青藤堿低劑量組,每組10只。SD大鼠于動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,5組均用質(zhì)量濃度為3 mg·mL-1的戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉。用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液消毒雙側(cè)踝關(guān)節(jié)后,于內(nèi)踝處自下而上切開(kāi)皮膚,分離皮下筋膜,用1 mL注射器制做的拉鉤將肌腱向后側(cè)牽拉。將小骨鑿與角度固定器組合后置于脛骨遠(yuǎn)端,用中等力度將骨鑿敲入內(nèi)踝,明顯感覺(jué)到落空感后,即內(nèi)踝骨折。用3-0線縫合傷口后,將足部?jī)?nèi)翻造成脫位后,立即復(fù)位[7]。根據(jù)成人用藥劑量(青藤堿2 mL)用Meeh-Rubner公式計(jì)算人鼠等效劑量,設(shè)立青藤堿高(12.5 mg·kg-1)、中(8 mg·kg-1)、低劑量組(2 mg·kg-1)[8]。大鼠手術(shù)1 d后,空白組和模型組于踝關(guān)節(jié)注射0.1 mL生理鹽水,青藤堿低劑量組、青藤堿中劑量組和青藤堿高劑量組每天于踝關(guān)節(jié)分別注射青藤堿2、8、12.5 mg·kg-1,處理6周。

2.2 番紅O染色與評(píng)分

所有大鼠安樂(lè)死后,分別將每組大鼠 (n=5)的右側(cè)踝關(guān)節(jié)分離取出,于福爾馬林中固定48 h后,置于乙二胺四乙酸中脫鈣6周,再將每個(gè)踝關(guān)節(jié)正中冠狀切成2個(gè)部分,進(jìn)行常規(guī)脫水、浸蠟、包埋及切片后,進(jìn)行番紅O染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠踝關(guān)節(jié)的病理學(xué)變化。

2.3 ELISA檢測(cè)

分別向每組大鼠 (n=5)的右踝關(guān)節(jié)囊注入100 μL生理鹽水,將踝關(guān)節(jié)做5次屈伸運(yùn)動(dòng)后,用1 mL注射器吸出關(guān)節(jié)液,置于-80 ℃保存。檢測(cè)前,取出關(guān)節(jié)液以1 000 r·min-1離心30 min后,取上清液。上清液和PBS按照1∶1混合后,根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,將對(duì)照品梯度稀釋后,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,依次加入100 μL樣品,孔板覆膜后于37 ℃孵育1 h后,棄去上清液,依次加入抗體工作液和酶結(jié)合液,覆膜后于37 ℃孵育30 min。加入顯色液,避光孵育10 min,加入終止液,放入酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)450 nm處的A值。

2.4 real-time PCR檢測(cè)

用Trizol法分別提取各組大鼠左踝關(guān)節(jié)軟骨組織的總RNA。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(反轉(zhuǎn)錄條件:37 ℃ 60 min,85 ℃ 5 min)。隨后在ABI 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上,對(duì)包含cDNA、引物和SYBR-Green qPCR Master Mix的qRT-PCR混合物進(jìn)行real-time PCR。擴(kuò)增條件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 20 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 30 s,共計(jì)40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,以2-ct法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。real-time PCR引物序列見(jiàn)表1。

表1 real-time PCR引物序列

2.5 Western blot檢測(cè)

用RIPA對(duì)各組大鼠左踝關(guān)節(jié)的軟骨組織進(jìn)行裂解,提取總蛋白。用BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度后,于100 ℃條件下變性。SDS-PAGE電泳分離總蛋白后,轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride)。用質(zhì)量濃度50 g·L-1的脫脂牛奶封閉2 h,用Tris緩沖液和聚山梨醇酯20的混合物洗滌3次,每次10 min后,將其放入對(duì)應(yīng)的一抗(CCL2、COL Ⅱ、COMP、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt和GAPDH)和一抗稀釋混懸液(1∶1 000)中,4 ℃孵育過(guò)夜。再用Tris緩沖液和聚山梨醇酯20的混合物洗滌3次,放入二抗和二抗稀釋液(1∶4 000)混懸液中,室溫孵育2 h。用Tris緩沖液和聚山梨醇酯20的混合物洗滌3次,將發(fā)光液滴在膜上,顯影、定影。用Image J軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,以GAPDH為內(nèi)參對(duì)蛋白表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 青藤堿對(duì)踝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)病理形態(tài)的影響

各組大鼠踝關(guān)節(jié)的病理形態(tài)見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn),模型組、青藤堿高劑量組、青藤堿中劑量組和青藤堿低劑量組大鼠的脛骨遠(yuǎn)端及距骨軟骨表面均有不同程度的退化,如軟骨細(xì)胞的丟失、軟骨表面纖維化。與模型組比較,青藤堿高劑量組、青藤堿中劑量組和青藤堿低劑量組軟骨表面的病理改變均有一定程度的改善。

注:A.空白組;B.模型組;C.青藤堿高劑量組;D.青藤堿中劑量組;E.青藤堿低劑量組;AC.關(guān)節(jié)軟骨;SB.松質(zhì)骨;箭頭表示關(guān)節(jié)軟骨的厚度。

3.2 大鼠踝關(guān)節(jié)液中炎癥因子的表達(dá)水平

各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織中炎性因子IL-1β、MMP-13和TNF-α含量的比較見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn),與空白組比較,模型組IL-1β、MMP-13和TNF-α的表達(dá)水平顯著上升(P<0.05);與模型組比較,青藤堿高劑量組、青藤堿中劑量組和青藤堿低劑量組IL-1β、MMP-13和TNF-α的表達(dá)水平顯著上升(P<0.05);與青藤堿中劑量組比較,青藤堿高劑量組IL-1β、MMP-13和TNF-α的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),而青藤堿低劑量組的變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織中炎性因子IL-1β、MMP-13和TNF-α含量的比較

3.3 大鼠踝關(guān)節(jié)軟骨生物標(biāo)志物mRNA和蛋白的表達(dá)水平

real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組CCL2、COLⅡ、COMP蛋白和mRNA的表達(dá)量顯著上升(P<0.05);與模型組比較,青藤堿高劑量組、青藤堿中劑量組和青藤堿低劑量組CCL2、COLⅡ、COMP蛋白和mRNA的表達(dá)量顯著降低(P<0.05);與青藤堿中劑量組比較,青藤堿高劑量組CCL2、COLⅡ、COMP蛋白和mRNA的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而青藤堿低劑量組CCL2、COLⅡ、COMP蛋白和mRNA的表達(dá)量明顯上升(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖2、表3、表4。

表3 5組大鼠踝關(guān)節(jié)軟骨組織中CCL2、COL Ⅱ和COMP蛋白表達(dá)水平的比較

表4 5組大鼠踝關(guān)節(jié)軟骨組織中CCL2、COL Ⅱ和COMP mRNA表達(dá)量的比較

注:A.空白組;B.模型組;C.青藤堿高劑量組;D.青藤堿中劑量組;E.青藤堿低劑量組。

3.4 大鼠PI3K-Akt信號(hào)通路的變化

Western blot結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的蛋白比值顯著升高(P<0.05);與模型組比較,青藤堿高劑量組、青藤堿中劑量組和青藤堿低劑量組p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的蛋白比值顯著降低(P<0.05);與青藤堿中劑量組比較,青藤堿高劑量組和青藤堿低劑量組p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白比值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖3和表5。

表5 5組大鼠踝關(guān)節(jié)組織中p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白比值的比較

注:A.空白組;B.模型組;C.青藤堿高劑量組;D.青藤堿中劑量組;E.青藤堿低劑量組。

4 討論

骨關(guān)節(jié)炎是一種軟骨的慢性退行性疾病,常發(fā)生于膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié),同時(shí)出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨下骨硬化、骨質(zhì)增生等問(wèn)題[9-10]。踝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的臨床發(fā)病率較高,且多為繼發(fā)性,具有長(zhǎng)期重復(fù)性,主要癥狀為踝關(guān)節(jié)的疼痛和僵硬、關(guān)節(jié)腫脹和積液[11-12]。

目前構(gòu)建踝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型主要是通過(guò)切斷踝關(guān)節(jié)部分韌帶,而內(nèi)踝骨折及內(nèi)踝骨折伴脫位是導(dǎo)致踝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的主要原因[13],課題組前期建立了骨折伴脫位大鼠模型,結(jié)果顯示,模型組大鼠的踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)軟骨細(xì)胞丟失和基質(zhì)丟失,表面粗糙并且出現(xiàn)纖維樣改變,踝關(guān)節(jié)液中炎癥因子IL-1β、MMP-13和TNF-α的表達(dá)水平上升,并且CCL2、COL Ⅱ、COMP蛋白和mRNA的表達(dá)量也明顯升高,這與臨床報(bào)道的結(jié)果一致,故認(rèn)為踝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型構(gòu)建成功。

青藤堿是青風(fēng)藤的主要成分,具有抗炎、抑制免疫等作用,其最主要的優(yōu)勢(shì)是不良反應(yīng)較少、安全系數(shù)高、不產(chǎn)生藥物依賴(lài)性[14]。研究表明,青藤堿可以抑制關(guān)節(jié)液中MMP-13和COMP的表達(dá),從而緩解軟骨退變的進(jìn)程[15]。青藤堿可抑制膝關(guān)節(jié)炎的軟骨中自噬,抑制PI3K-Akt等炎癥信號(hào)通路,從而發(fā)揮抗炎作用[16]。研究表明,青藤堿具有強(qiáng)大的抗炎作用,并且毒性小,具有較大的開(kāi)發(fā)潛力。青藤堿抑制膝骨關(guān)節(jié)炎的作用已在實(shí)驗(yàn)研究中得到證實(shí)[17],炎性反應(yīng)是骨關(guān)節(jié)炎病理生理變化的重要特征,炎性因子的表達(dá)量增加是加速骨關(guān)節(jié)炎軟骨退化的重要因素。本研究的結(jié)果顯示,高、中、低劑量的青藤堿均可以改善踝關(guān)節(jié)的病理形態(tài),使軟骨細(xì)胞丟失量減少,并使纖維樣減輕。與模型組比較,青藤堿高、中、低劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)液中炎癥因子IL-1β、MMP-13和TNF-α的表達(dá)水平降低,同時(shí)軟骨中CCL2、COL Ⅱ、COMP蛋白和mRNA的表達(dá)量降低,與文獻(xiàn)報(bào)道的青藤堿的效果一致。文獻(xiàn)報(bào)道,PI3K-Akt信號(hào)通路與骨關(guān)節(jié)炎密切相關(guān),認(rèn)為其是抗炎和抗軟骨細(xì)胞凋亡的重要通路[18-19]。PI3K-Akt信號(hào)通路被激活后,加重骨關(guān)節(jié)炎的軟骨退化[20]。青藤堿高、中劑量可顯著抑制PI3K-Akt信號(hào)通路,從而下調(diào)CCL2、COL Ⅱ、COMP的表達(dá)水平。

綜上所述,青藤堿可抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo),抑制炎性因子IL-1β、MMP-13、TNF-α、CCL2、COLⅡ、COMP的表達(dá),從而改善踝關(guān)節(jié)的軟骨退化,為臨床治療踝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎提供參考。