基于HPLC-MS與Cocktail探針?biāo)幬锓ㄑ芯课逦蹲犹崛∥飳Υ笫驝YP450酶的影響

李 莉,童黃錦,汪麗君,蘇聯(lián)麟,陸兔林*,李 昱

1.亳州市食品藥品檢驗中心,亳州 236800;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,南京 210028;3.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,南京 210023

藥物進入機體后,以肝臟為中心,進行轉(zhuǎn)化和代謝。在肝臟細胞中,除了少部分藥物代謝酶位于細胞核、細胞質(zhì)、細胞膜及線粒體外,絕大部分藥物的代謝轉(zhuǎn)化由位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的微粒體酶系進行調(diào)控。其中,細胞色素P450酶(CYP450酶)作為重要的Ⅰ相代謝酶[1],參與機體90%以上的藥物代謝。藥物對CYP450酶的誘導(dǎo)和抑制作用,對代謝藥物在體內(nèi)作用的過程、時間及藥效的發(fā)揮具有重要作用。在種類方面,CYP450酶系包括CYP1、CYP2、CYP3 3個家族的9種主要亞型酶,具體包括CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CY2C9、CYPZC19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4[2-7],在肝細胞中分別占CYP450酶總量的8.9%、5.0%、7.2%、4.7%、12.8%、6.8%、20.0%、7.0%、30.2%[6-9]。

Cocktail探針?biāo)幬锓础半u尾酒”探針?biāo)幬锓?即給予特定的探針?biāo)幬锖鬁y定探針?biāo)幬镌图捌浯x產(chǎn)物,以此來反映該探針底物所對應(yīng)的CYP450亞型酶的活性。近年來,探針?biāo)幬锓ㄒ驯粡V泛應(yīng)用于研究藥物對CYP450酶活性的影響、藥物代謝途徑、藥物相互作用、優(yōu)化臨床給藥方案等方面,尤其在中西藥合用領(lǐng)域中的應(yīng)用尤為廣泛。通過定量分析探針?biāo)幬镌图跋嚓P(guān)代謝物,從而反映CYP450亞型酶的活性,探究所給藥物對CYP450酶的影響,最終確定中西藥間可能的相互作用機制。該方法對測定藥物代謝酶活性、評價藥物間相互作用、研究藥物代謝酶活性與疾病之間關(guān)系以及遺傳或非遺傳因素對代謝酶活性的影響具有重要意義[5,10]。

五味子為木蘭科植物五味子[Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.]的干燥成熟果實,具有益氣生津、收斂固澀等功效[11]。五味子的化學(xué)成分主要有揮發(fā)油、木脂素、有機酸、多糖、氨基酸、無機元素等[12]?，F(xiàn)代研究表明,五味子醇提部位的木脂素類成分具有較好的抗炎、抗氧化作用。陳倩等[13]研究了五味子水提物對CYP3A類酶活性的影響,結(jié)果顯示五味子水提物在整體上對CYP3A具有先抑制后誘導(dǎo)的雙重調(diào)節(jié)作用,并確定了五味子中發(fā)揮誘導(dǎo)和抑制作用的相關(guān)成分。此外,胡芳[14]研究不同給藥次數(shù)的生五味子、醋五味子對CYP1A2、CYP3A4、CYP2E1 3個CYP450亞型酶活性的影響,發(fā)現(xiàn)單次給藥后,生五味子、醋五味子對CYP3A4和CYP2E1酶的活性發(fā)揮誘導(dǎo)作用,對CYPA2的活性發(fā)揮抑制作用;多次給藥后,生五味子、醋五味子對CYP2E1酶的活性發(fā)揮抑制作用,對CYP3A4和CYPA1A2酶的活性基本無影響。本研究采用Cocktail探針?biāo)幬锓ńY(jié)合高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,HPLC-MS),以香豆素(CYP2A6)、安非他酮(CYP2B6)、紫杉醇(CYP2C8)、甲苯磺丁脲(CY2C9)、奧美拉唑(CYP2C19)、美托洛爾(CYP2D6)為探針底物,對6種重要的亞型酶的活性(CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CY2C9、CYP2C19、CYP2D6)進行研究,全面、客觀地評價五味子提取物對CYP450酶活性的影響,為進一步研究五味子降酶保肝的作用機制奠定理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1200-6120B型HPLC-MS(包括G1322A真空脫氣機、G1312B雙元泵、G1367DA自動進樣器、G1316柱溫箱、ESI等,美國Agilent公司);Milli-Q Gradient A10型超純水器(Millipore,Bedford,MA,USA);KQ-500B型超聲清洗器(昆山超聲儀器有限公司);MS105DU型電子天平(十萬分之一,瑞士Mettler Toledo公司);ALLEGRA X-22型冷凍離心機(德國貝爾曼庫爾特公司);恒溫磁力攪拌器(榮華儀器制造有限公司);HGC-96A型氮吹儀(中國上海禾工科學(xué)儀器有限公司);XW-80A型微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司);HP-01型無油真空泵(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試藥

奧美拉唑(編號LOT#Y13O6C4251)、甲苯磺丁脲(編號LOT#40715)、香豆素(編號LOT#TM0520CA14)、紫杉醇(編號LOT#T1006F4090)、地西泮(編號LOT#A16O6L4576),質(zhì)量分數(shù)均在98%以上,均購自上海源葉生物科技有限公司;鹽酸安非他酮(編號LOT#100671-200301)、大黃酸(編號LOT#0757-9804),質(zhì)量分數(shù)均在98%以上,均購自中國食品藥品檢定研究院;美托洛爾(編號LOT#10084-201303,質(zhì)量分數(shù)為99%,中國食品藥品檢定研究院);甲醇(色譜級,山東禹王實業(yè)有限公司);乙腈(色譜級,美國Merck公司);其他試劑均為分析純;水為超純水。

1.3 動物

SD健康大鼠,清潔級,雄性,體質(zhì)量180～200 g,許可證編號SCXK(滬)2014-0006,購自上海杰思捷實驗室動物有限公司。實驗前于南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)1周,以適應(yīng)實驗室環(huán)境,給予標(biāo)準(zhǔn)光照周期(14 h光照、10 h黑暗),實驗室飼養(yǎng)溫度維持在20～25 ℃,相對濕度控制在60%～70%,給予普通飼料,自由飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行實驗。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制及血漿的采集

2.1.1對照品與混合對照品溶液的配制 單個探針儲備液的配制:分別精密稱取適量的香豆素、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、奧美拉唑、鹽酸安非他酮、紫杉醇對照品,置于2 mL量瓶中,分別用甲醇溶解,定容,搖勻,即得單個對照品儲備液,置于4 ℃冰箱中保存,備用?；旌蠈φ掌啡芤旱呐渲?精密吸取上述單個對照品的儲備液各適量,置于25 mL量瓶中,用甲醇定容至刻度,配制成甲苯磺丁脲質(zhì)量濃度為120.12 μg·mL-1、奧美拉唑質(zhì)量濃度為138.4 μg·mL-1、氯唑沙宗質(zhì)量濃度為102.2 μg·mL-1、香豆素質(zhì)量濃度為205.76 μg·mL-1、鹽酸安非他酮質(zhì)量濃度為101.44 μg·mL-1、紫杉醇質(zhì)量濃度為197.4 μg·mL-1的混合對照品溶液,置于4 ℃冰箱中保存,備用。

分別精密吸取上述混合對照品溶液8.0、6.0、4.0、2.5、1.0、0.5、0.2、0.1 mL,置于25 mL量瓶中,加甲醇稀釋、定容至刻度,得到一系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液(甲苯磺丁脲質(zhì)量濃度:96.096 0、72.072 0、48.048 0、30.030 0、12.012 0、6.006 0、2.402 4、1.201 2 μg·mL-1;奧美拉唑質(zhì)量濃度:110.720 0、83.040 0、55.360 0、34.600 0、13.840 0、6.920 0、2.768 0、1.384 0μg·mL-1;氯唑沙宗質(zhì)量濃度:81.760 0、61.320 0、40.880 0、25.550 0、10.220 0、5.110 0、2.044 0、1.022 0 μg·mL-1;香豆素質(zhì)量濃度:164.608 0、123.456 0、82.304 0、51.440 0、20.576 0、10.288 0、4.115 2、2.057 6 μg·mL-1;鹽酸安非他酮質(zhì)量濃度:81.152 0、60.864 0、40.576 0、25.360 0、10.144 0、5.072 0、2.028 8、1.014 4 μg·mL-1;紫杉醇質(zhì)量濃度:157.920 0、118.440 0、78.960 0、49.350 0、19.740 0、9.870 0、3.948 0、1.974 0 μg·mL-1),置于4 ℃冰箱中保存,備用。

2.1.2內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取地西泮對照品5.15 mg,置于5 mL量瓶中,加甲醇溶解,定容至刻度,搖勻,作為地西泮儲備液(質(zhì)量濃度1.03 mg·mL-1),置于4 ℃保存。

精密量取地西泮儲備液1.00 mL,置于25 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,即得質(zhì)量濃度為41.2 μg·mL-1的地西泮內(nèi)標(biāo)液,置于4 ℃保存,備用。

精密稱取大黃酸對照品5.05 mg,置于5 mL量瓶中,加甲醇溶解,定容至刻度,搖勻,作為大黃酸儲備液(質(zhì)量濃度1.01 mg·mL-1),置于4 ℃保存,備用。

精密量取大黃酸儲備液1.0 mL,置于25 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,即得質(zhì)量濃度為40.4 μg·mL-1的大黃酸內(nèi)標(biāo)液,置于4 ℃保存,備用。

2.1.3Cocktail探針溶液的配制 精密稱取香豆素、鹽酸安非他酮、甲苯磺丁脲、奧美拉唑、氯唑沙宗、紫杉醇各25 mg,加入5 mL·L-1CMC-Na溶液研磨均勻,制成混懸液,即得(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

2.1.4空白血漿樣品的采集 取空白大鼠眼內(nèi)眥靜脈血約1 mL,置于含有肝素鈉1.5 mL的離心管中,以14 000 r·min-1離心10 min,收集血漿,置于-80 ℃保存,備用。

2.1.5含藥血漿樣品的采集 空白大鼠給予混合探針?biāo)幬锖? h左右,取大鼠眼內(nèi)眥靜脈血約1 mL,置于含有肝素鈉1.5 mL的離心管中,以14 000 r·min-1離心10 min,收集上層血漿,置于-80 ℃保存,備用。

2.2 色譜及質(zhì)譜條件

2.2.1色譜條件 采用Merck牌Purospher?STAR LP RP-18 endcapped (Hibar?RT 250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱。流動相:0.01 mol·L-1的乙酸銨(A)-甲醇(B)。梯度洗脫:0～15 min,20%～40%B;15～30 min,40%～55%B;30～40 min,55%～58%B;40～50 min,58%～70%B;50～58 min,70%～80%B;58～60 min,20%B)。流速:1 mL·min-1。采用190～400 nm全波長掃描后選取最佳波長進行檢測,最終確定的檢測波長為甲苯磺丁脲、地西泮(IS+)、紫杉醇、大黃酸(IS-)230 nm,鹽酸安非他酮250 nm,香豆素275 nm,氯唑沙宗280 nm,奧美拉唑302 nm。柱溫:25 ℃。進樣量:10 μL。

2.2.2質(zhì)譜條件 離子化方式:電噴霧離子化(electrospray ionization,ESI);離子極性:選用正(positive)、負(negative)離子同時檢測;檢測模式:選擇性反應(yīng)離子監(jiān)測(selective reaction ion monitoring,SIM);干燥氣流速:80 mL·min-1;干燥氣溫度:350 ℃;毛細管電壓:3 000 V;霧化器壓力:35 psi;碰撞電壓(fragmentor voltage)及定量分析離子質(zhì)荷比(m/z)見表1。

表1 6種CYP450探針?biāo)幬锖蛢?nèi)參物的質(zhì)譜參數(shù)

2.3 血漿樣品溶液處理

精密吸取空白大鼠血漿上清液100 μL,置于離心管中,加入混合對照品溶液10 μL(甲苯磺丁脲的質(zhì)量濃度為96.096 μg·mL-1、奧美拉唑的質(zhì)量濃度為110.72 μg·mL-1、氯唑沙宗的質(zhì)量濃度為81.76 μg·mL-1、香豆素的質(zhì)量濃度為164.608 μg·mL-1、鹽酸安非他酮的質(zhì)量濃度為81.152 μg·mL-1、紫杉醇的質(zhì)量濃度為157.92 μg·mL-1,下同),地西泮內(nèi)標(biāo)液10 μL(質(zhì)量濃度為41.2 μg·mL-1,下同)和大黃酸內(nèi)標(biāo)液10 μL(質(zhì)量濃度為40.4 μg·mL-1,下同),混合均勻后,加入乙腈450 μL,渦旋振蕩3 min,以14 000 r·min-1離心20 min,取上清400 μL;剩余部分加0.3 mol·L-1的鹽酸10 μL,再加乙腈450 μL,渦旋振蕩3 min,以14 000 r·min-1離心20 min,取上清400 μL,用氮氣吹干后,加入不加鹽酸處理的上清液,繼續(xù)用氮氣吹干,用體積分數(shù)50%乙腈100 μL溶解,進樣10 μL進行分析。

2.4 質(zhì)控樣品溶液的配制

吸取混合對照品母液適量,用甲醇稀釋為高、中、低3種不同質(zhì)量濃度的對照品溶液。從-20 ℃中取出大鼠空白血漿,室溫解凍后,取100 μL置于離心管中若干份,分別加入低、中、高質(zhì)量濃度混合對照品溶液10 μL,加入內(nèi)標(biāo)液10 μL,混合均勻,分別得到低質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品(QCL)、中質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品(QCM)、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品(QCH)3個質(zhì)量濃度的混合質(zhì)控樣品溶液,置于4 ℃冰箱中保存,備用。

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1專屬性 分別吸取6個不同大鼠的空白血漿、對照樣品溶液以及給藥后的含藥血漿各100 mL,按照2.2.1項下的方法進行處理后,進樣分析。結(jié)果表明,在選定的色譜及質(zhì)譜條件下,各探針?biāo)幬锏谋Ａ魰r間分別約為24.35 min(香豆素)、29.60 min(甲苯磺丁脲)、31.53 min(氯唑沙宗)、35.13 min[大黃酸(IS-)]、37.00 min(奧美拉唑)、43.85 min(鹽酸安非他酮)、50.90 min[地西泮(IS+)]、56.42 min(紫杉醇),相互之間無干擾,峰形良好,且與周圍峰的分離度均大于1.5,血漿中的內(nèi)源性雜質(zhì)對探針?biāo)幬锏臏y定無影響,具有良好的特異性和分離度。結(jié)果見圖1、圖2。

注:A.大鼠空白血漿;B.大鼠空白血漿加探針底物和內(nèi)標(biāo);C.大鼠含藥血漿;1.香豆素;2.甲苯磺丁脲;3.氯唑沙宗;4.大黃酸(IS-);5.奧美拉唑;6.鹽酸安非他酮;7.地西泮(IS+);8.紫杉醇。

注:A.空白血漿;B.空白血漿中的探針?biāo)幬锛皟?nèi)標(biāo);C.給藥2.5 h后血漿中的探針?biāo)幬锛皟?nèi)標(biāo);1.香豆素;2.甲苯磺丁脲;3.氯唑沙宗;4.大黃酸(IS-);5.奧美拉唑;6.鹽酸安非他酮;7.地西泮(IS+);8.紫杉醇。

2.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 從-20 ℃冰箱中取出大鼠空白血漿,室溫解凍后,取100 μL置于離心管中若干份,分別加入已稀釋的不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液10 μL,加入內(nèi)標(biāo)液地西泮和大黃酸各10 μL,混合均勻,按照2.1.1項下方法進行處理后,分別制成香豆素質(zhì)量濃度分別為0.205 8、0.411 5、1.028 8、2.057 6、5.144 0、8.230 4、12.345 6、16.460 8 μg·mL-1;奧美拉唑質(zhì)量濃度分別為0.138 4、0.276 8、0.692 0、1.384 0、3.460 0、5.536 0、8.304 0、11.072 0 μg·mL-1;鹽酸安非他酮質(zhì)量濃度分別為0.101 4、0.202 9、0.507 2、1.014 4、2.536 0、4.057 6、6.086 4、8.115 2 μg·mL-1;紫杉醇質(zhì)量濃度分別為0.197 4、0.394 8、0.987 0、1.974 0、4.935 0、7.896 0、11.844 0、15.792 0 μg·mL-1;甲苯磺丁脲質(zhì)量濃度分別為0.120 1、0.240 2、0.600 6、1.201 2、3.003 0、4.804 8、7.207 2、9.609 6 μg·mL-1;氯唑沙宗質(zhì)量濃度分別為0.102 2、0.204 4、0.511 0、1.022 0、2.555 0、4.088 0、6.132 0、8.176 0 μg·mL-1的溶液。每個質(zhì)量濃度平行3份。進樣10 μL分析。記錄色譜圖,以峰面積(As)與內(nèi)標(biāo)峰面積(Ai)之比(As/Ai)為縱坐標(biāo)(y)、對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),進行線性回歸分析。結(jié)果見表2。表明各探針?biāo)幬镌跇?biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 大鼠血漿中各探針?biāo)幬锏木€性關(guān)系結(jié)果

2.5.3精密度 從-20 ℃取出大鼠空白血漿,室溫解凍后,取100 μL置于離心管中若干份,按照2.4項下的方法對樣品進行處理,得QCH、QCM、QCL 3個質(zhì)量濃度的混合質(zhì)控樣品,每個質(zhì)量濃度的樣品平行5份?？疾旆椒ǖ呐鷥?nèi)精密度與批間精密度。每次進樣10 μL進行HPLC分析,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算后續(xù)測定樣品的質(zhì)量濃度,結(jié)果見表3。

表3 血漿中各探針?biāo)幬锏木芏葘嶒灲Y(jié)果

結(jié)果表明,甲苯磺丁脲、奧美拉唑、氯唑沙宗、香豆素、鹽酸安非他酮及紫杉醇3個質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品的批內(nèi)精密度和批間精密度均小于15%,符合《生物樣品測定指導(dǎo)原則》中的要求。

2.5.4穩(wěn)定性 從-20 ℃中取出大鼠空白血漿,室溫解凍后,取100 μL置于離心管中若干份,按照2.4項下的方法對樣品進行處理,得QCH、QCM、QCL 3個質(zhì)量濃度的混合質(zhì)控樣品,每個質(zhì)量濃度的樣品平行5份?？疾熨|(zhì)控樣品在室溫下放置0、24 h,且經(jīng)過3次凍融循環(huán)以及-20 ℃存放30 d后的樣品穩(wěn)定性,每次進樣10 μL進行HPLC分析,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品的質(zhì)量濃度。結(jié)果見表4、表5。

表4 血漿中各探針?biāo)幬锏某胤€(wěn)定性實驗結(jié)果

表5 血漿中各探針?biāo)幬飪鋈诜€(wěn)定性實驗結(jié)果

結(jié)果表明,大鼠血漿中甲苯磺丁脲、奧美拉唑、氯唑沙宗、香豆素、鹽酸安非他酮及紫杉醇3個質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品的RSD值在室溫條件下質(zhì)量濃度變化均在15%以內(nèi);在反復(fù)凍融條件下質(zhì)量濃度變化均在15%以內(nèi);在冷凍條件下質(zhì)量濃度變化均在15%以內(nèi)。表明上述探針?biāo)幬镌谑覝胤胖谩⒎磸?fù)凍融、冷凍條件下均比較穩(wěn)定,《符合生物樣品測定指導(dǎo)原則》中的要求。

2.5.5準(zhǔn)確度 從-20 ℃中取出大鼠空白血漿,室溫解凍以后,取100 μL置于離心管中若干份,按照2.4項下的方法對樣品進行處理,得QCH、QCM、QCL 3個質(zhì)量濃度的混合質(zhì)控樣品,每個質(zhì)量濃度的樣品平行5份。進樣10 μL分析,記錄各探針及內(nèi)標(biāo)的峰面積,并計算各探針?biāo)幬锱c內(nèi)標(biāo)地西泮峰面積的比值(A)。另配制不經(jīng)血漿化處理的相應(yīng)質(zhì)量濃度的高、中、低混合對照品溶液,取10 μL直接進樣分析,記錄各探針及內(nèi)標(biāo)峰面積,并計算各探針?biāo)幬锱c內(nèi)標(biāo)地西泮峰面積的比值(B),利用(A/B)×100%計算各探針底物的提取回收率(絕對回收率);另外將A代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算藥物的質(zhì)量濃度,記為a,以質(zhì)控樣品表示的理論質(zhì)量濃度為b,利用(a/b)×100%計算各探針底物的方法回收率。結(jié)果見表6。

表6 血漿中各探針?biāo)幬锏臏?zhǔn)確度實驗結(jié)果

結(jié)果表明,大鼠血漿中甲苯磺丁脲、奧美拉唑、氯唑沙宗、香豆素、鹽酸安非他酮及紫杉醇3個質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品提取回收率為(85.72%±5.13%)～(99.47%±1.43%),且RSD值均在15%以內(nèi);質(zhì)控樣品方法回收率為(86.58%±2.98%)～(108.90%±8.23%),且RSD值均在15%以內(nèi),均符合《生物樣品分析方法測定指導(dǎo)原則》中的要求。

2.6 五味子對大鼠6種亞型酶的影響

2.6.1五味子提取物的制備 將五味子(100 g)在體積分數(shù)為85%的乙醇溶液中回流提取2次,每次2 h。合并提取物,在40 ℃條件下減壓濃縮。將該部分溶解在質(zhì)量濃度為1.0 g·mL-1的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液中,并給大鼠服用。

2.6.2動物分組及給藥 取12只SD大鼠,隨機分為2組,空白組和五味子組,每組6只,單次給予五味子提取液,劑量為3.5 g·kg-1;空白組給予同等劑量的質(zhì)量濃度為1.0 g·mL-1的CMC-Na溶液。5 min后給予30～50 mg·kg-1Cocktail混合探針溶液。分別于給探針?biāo)幥? min和給探針?biāo)幒?、9、15、20、30 min及1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、6、8、10、12、24 h,于SD大鼠眼內(nèi)眥靜脈叢取血約0.5～1 mL,置于肝素鈉采血管中,以14 000 r·min-1離心20 min,收集上層血漿,置于-80 ℃保存,備用。

2.6.4大鼠血漿中6種探針?biāo)幬锏难帩舛?時間曲線(藥-時曲線) 單次灌胃給予五味子醇提濃縮液前、后,測得甲苯磺丁脲、奧美拉唑、氯唑沙宗、香豆素、鹽酸安非他酮及紫杉醇的血藥質(zhì)量濃度,繪制該6種探針?biāo)幬锏乃?時曲線,見圖3。

注:A.香豆素;B.氯唑沙宗;C.甲苯磺丁脲;D.奧美拉唑;E.鹽酸安非他酮;F.紫杉醇。

2.6.5大鼠血漿中6種探針?biāo)幬锏乃巹訉W(xué)參數(shù) 6種探針?biāo)幬锏乃幋鷦恿W(xué)數(shù)據(jù)經(jīng)DAS 3.2處理,并用SPSS 26.0軟件分析生物半衰期(t1/2)、機體總消除率(CLz/F)、藥-時曲線下面積(AUC)、平均滯留時間(MRT)、達峰時間(tmax)、最大血藥質(zhì)量濃度(Cmax)。結(jié)果見表7。

表7 單次給予五味子后6種探針?biāo)幬锏乃巹訉W(xué)參數(shù)

表7(續(xù)) 單次給予五味子后6種探針?biāo)幬锏乃巹訉W(xué)參數(shù)

結(jié)果表明,香豆素的AUC(0→t)、AUC(0→∞)、Cmax、tmax顯著下降,CLz/F顯著上升;奧美拉唑的AUC(0→t)、AUC(0→∞)、Cmax、MRT(0→t)顯著上升;紫杉醇的AUC(0→t)、AUC(0→∞)、Cmax、MRT(0→t)、t1/2顯著上升;鹽酸安非他酮的AUC(0→t)、t1/2、tmax顯著下降;甲苯磺丁脲的AUC(0→t)、AUC(0→∞)、Cmax、t1/2、tmax顯著下降;氯唑沙宗的AUC(0→t)、AUC(0→∞)、Cmax、t1/2、tmax顯著上升,CLz/F顯著下降。

綜上所述,單次灌胃給予五味子提取物,可以抑制大鼠CYP1A2、CYP2D6、CYP2C19、CYP2C8和CYP2E1酶的活性,誘導(dǎo)CYP3A4、CYP2A6、CYP2B6和CYP2C19酶的活性。

3 討論

探針?biāo)幬锓ㄊ侵杆幬锝?jīng)過CYP450酶代謝后,測定代謝物和原型藥的比例或速率,來衡量CYP450酶代謝能力的方法。該方法己廣泛用于CYP450酶活性的研究,但每一種探針?biāo)幬镏荒苡糜谝环N同工酶的測定,故通常對CYP酶的作用是分開評估的(一次評估一種亞型)。這樣的常規(guī)方法既費時又費力,且成本很高。將2種及2種以上經(jīng)不同酶代謝的藥物同時給予的方法稱為Cocktail探針?biāo)幬锓?該方法最初用于評估藥物與代謝酶在體內(nèi)的相互作用,現(xiàn)在的應(yīng)用范圍則更加廣泛,可用于體內(nèi)、外測定CYP450酶的活性。Cocktail法的優(yōu)點在于多個代謝途徑的信息可在單個實驗過程中獲得,省時、經(jīng)濟,將個體間影響降至最低。

由于Cocktail法在研究藥物代謝方面的優(yōu)勢,將其廣泛用于中藥的代謝研究,對于促進中藥基礎(chǔ)理論的研究和中藥的現(xiàn)代化具有重要意義,同時對于中藥在臨床上的合理應(yīng)用,提高聯(lián)合用藥的安全性和有效性具有重要的意義。

本實驗采用了整體動物Cocktail探針?biāo)幬锓?聯(lián)用LC/MS分析技術(shù),通過比較香豆素、安非他酮、紫杉醇、甲苯磺丁脲、奧美拉唑、氯唑沙宗藥動參數(shù)的差異,研究了五味子對大鼠CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CY2C9、CYPZC19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4 9種亞型酶的作用,并通過比較活性差異,從而全面、客觀地評價五味子醇提取物對CYP450酶活性的影響,體現(xiàn)藥物相互作用在整個藥物代謝過程中的整體性,其結(jié)果比離體實驗更具有說服力。為探討五味子保肝作用的機制提供了科學(xué)的依據(jù),并對臨床用藥具有一定的指導(dǎo)作用。