基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討紅核婦潔洗液抗感染的作用機(jī)制*

饒鴻宇，李沛波，諶攀，史志恒，蘇薇薇

廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心/廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275

陰道感染，常表現(xiàn)為分泌物異常、瘙癢和異味等，是臨床最常見(jiàn)的婦科疾病之一，降低了女性的生活質(zhì)量。目前，臨床治療仍以抗生素為主，然而抗生素的長(zhǎng)期應(yīng)用增強(qiáng)了細(xì)菌的耐藥性，容易誘導(dǎo)耐藥菌的出現(xiàn)，另外抗菌藥物的大量使用還會(huì)破壞陰道菌群穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致疾病反復(fù)。傳統(tǒng)中藥經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐遴選，具有不良反應(yīng)小、耐藥率低等優(yōu)勢(shì)，具有良好的開(kāi)發(fā)前景，但由于其作用機(jī)制尚不明確，限制了其應(yīng)用。

紅核婦潔洗液收錄于《新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)中藥第33 冊(cè)》，是用山楂核制得的外用洗劑，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)白色念珠菌等生殖道致病菌均有良好的殺滅功效，可用于各種原因引起的女性陰道感染，還能用于預(yù)防產(chǎn)后感染和會(huì)陰傷口的消毒等［1-5］。本團(tuán)隊(duì)研究了紅核婦潔洗液的化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)了包括2，6-二甲氧基苯酚在內(nèi)的多個(gè)具有良好抑菌活性的酚類(lèi)化合物，但其他抗感染機(jī)制仍有待研究［6-8］。

中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整合了包括醫(yī)學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)在內(nèi)的多方面數(shù)據(jù)，運(yùn)用計(jì)算機(jī)技術(shù)建立預(yù)測(cè)模型，可以從分子、細(xì)胞、組織等多個(gè)層面預(yù)測(cè)藥物的作用機(jī)制，更好地揭示中藥的整體作用，為多組分中藥的機(jī)制研究提供了新的方向［9-12］。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，首次探討了紅核婦潔洗液預(yù)防和治療感染性疾病的作用機(jī)理，為紅核婦潔洗液的臨床應(yīng)用提供了支撐。

1 方 法

1.1 化學(xué)成分的收集

基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)，本團(tuán)隊(duì)對(duì)紅核婦潔洗液的物質(zhì)組成進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，共確證和指認(rèn)了包括酚類(lèi)和醛酮類(lèi)等在內(nèi)的92 個(gè)化合物，其中多個(gè)酚類(lèi)化合物展現(xiàn)出了良好的抗菌活性，揭示了紅核婦潔洗液的化學(xué)成分［6-7］。

1.2 交集靶點(diǎn)的確定及藥材-活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在DisGeNET（http：//www. disgenet. org/）中對(duì)“infection”進(jìn)行搜庫(kù)，得到與感染性疾病相關(guān)的靶基因名，同時(shí)將紅核婦潔洗液所有化合物的結(jié)構(gòu)導(dǎo)入TCMSP（http：//tcmspw. com/）、SwissTarget-Prediction（http：//www. swisstargetprediction. ch/）和CTD（https：//ctdbase. org/），明確紅核婦潔洗液的全部潛在靶標(biāo)基因［8］。搜集兩者的交集數(shù)據(jù)，并制作維恩圖，明確紅核婦潔洗液發(fā)揮抗感染功效的潛在靶基因。再運(yùn)用Cytoscape3.7.2對(duì)上述相關(guān)的靶點(diǎn)和對(duì)應(yīng)化合物進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化處理，同時(shí)研究該網(wǎng)絡(luò)的特征。

1.3 交集靶點(diǎn)通路分析和功能分析

為進(jìn)一步挖掘靶基因的功能，將“交集數(shù)據(jù)”導(dǎo)入DAVID v6.7（https：//david. ncifcrf. gov/），選定研究目標(biāo)為人種（homo sapiens），分析其通路信息（KEGG，kyoto encyclopedia of genes and genomes）和生物學(xué)功能（GO，gene ontology），闡明紅核婦潔洗液的作用機(jī)制［8］。

2 結(jié) 果

2.1 成分收集和靶點(diǎn)篩選

從DisGeNET 共獲得491個(gè)抗感染相關(guān)的靶點(diǎn)，與搜集到的1 056 個(gè)紅核婦潔洗液潛在作用靶點(diǎn)整合后，得到紅核婦潔洗液抗感染的相關(guān)靶點(diǎn)143個(gè)（圖1），用于后續(xù)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

圖1 紅核婦潔洗液成分潛在靶點(diǎn)與感染性疾病靶點(diǎn)Venn圖Fig.1 Venn diagram of HHFJL potential targets and infection disease targets

2.2 網(wǎng)絡(luò)分析

將藥材-成分-靶點(diǎn)構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape 進(jìn)行拓?fù)浞治?，發(fā)現(xiàn)該網(wǎng)絡(luò)共有227 個(gè)節(jié)點(diǎn)（包括84 個(gè)成分和143 個(gè)交集靶點(diǎn)），1 170 條邊（圖2）。在這些靶點(diǎn)中，Degree 排名靠前的靶點(diǎn)依次為PARP1、PTGS1、ESR1、IDO1、NOS2、ALOX5、EGFR、PTGS2、HDAC6、JAK1、PTPRC、PIK3CA、TLR9、MIF 和PTPN22，為紅核婦潔洗液潛在的作用靶點(diǎn)。Degree 排名靠前的成分依次是Eugenol（丁香酚）、2-methoxy-4-（1-propenyl）-Phenol（異丁香酚）、2-methoxy-Phenol（愈創(chuàng)木酚）、Catechol（鄰苯二酚）和3-methyl-1，2-Benzenediol（3-甲氧基鄰苯二酚），是紅核婦潔洗液發(fā)揮功效的潛在化合物。

圖2 藥材-成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 The herb-component-key target network

2.3 交集靶點(diǎn)通路分析和功能分析

由圖3 可見(jiàn)，KEGG 分析（P< 0.05）共篩選出包括TNF 信號(hào)通路、TLR 信號(hào)通路、NF-kappa B 信號(hào)通路和NOD-like 受體信號(hào)通路等信號(hào)通路合計(jì)107條（P值越小，富集程度越高）。GO功能分析則關(guān)聯(lián)到715 個(gè)條目（P<0.05），其中與脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路、凋亡過(guò)程負(fù)調(diào)控、炎癥反應(yīng)、缺氧反應(yīng)等生物過(guò)程相關(guān)的條目有570個(gè)，與酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等分子功能相關(guān)條目有93 個(gè)，與細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、細(xì)胞外空間、細(xì)胞表面等細(xì)胞組成相關(guān)條目有52個(gè)（圖4）。

圖3 紅核婦潔洗液交集靶點(diǎn)KEGG通路富集分析結(jié)果Fig.3 Pathway enrichment analysis of the key targets

圖4 紅核婦潔洗液交集靶點(diǎn)GO富集分析結(jié)果Fig.4 GO enrichment analysis of the key targets

3 討 論

縱觀人類(lèi)疾病發(fā)展史，感染性疾病是造成人類(lèi)流行病的主要原因之一。隨著青霉素的問(wèn)世，抗菌藥在一線抗感染過(guò)程中一直扮演著十分重要的角色。然而抗菌藥的大量使用加劇了細(xì)菌的耐藥趨勢(shì)，部分菌株的耐藥率已超過(guò)60%，甚至出現(xiàn)了對(duì)多種抗生素都具有耐藥性的“超級(jí)細(xì)菌”，給公共醫(yī)療系統(tǒng)造成了巨大的負(fù)擔(dān)［13］。傳統(tǒng)中藥經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐遴選，具有扎實(shí)的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)，但其體外抑菌能力距離現(xiàn)代醫(yī)學(xué)界定的抗感染藥物標(biāo)準(zhǔn)尚存在著差距。由此可見(jiàn)，傳統(tǒng)的最小抑菌濃度評(píng)價(jià)體系在評(píng)估中藥抗感染功效時(shí)存在局限性，必須運(yùn)用更加合理評(píng)判體系去分析中藥的抗感染功效。

多項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)紅核婦潔洗液可用于治療需氧菌性陰道炎、霉菌性陰道炎、非特異性陰道炎和陰道瘙癢等多種婦科感染性疾?。?-3］。體外研究數(shù)據(jù)則表明紅核婦潔洗液原液能抑制紅色毛癬菌、犬小孢子菌和念珠菌等多種皮膚淺表真菌的生長(zhǎng)，同時(shí)紅核婦潔洗液中的2，6-二甲氧基苯酚和5-叔丁基鄰苯三酚等物質(zhì)還可以有效殺滅陰道加德納氏菌、白色念珠菌和大腸桿菌等生殖道致病菌［4-6］。由此可見(jiàn)，紅核婦潔洗液可抑制多種微生物的生長(zhǎng)，有利于感染性疾病的治療和傷口的消毒等。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)解析了紅核洗液抗感染的有效成分，發(fā)現(xiàn)在92 個(gè)化合物中，包括愈創(chuàng)木酚、2，6-二甲氧基苯酚和5-叔丁基鄰苯三酚等64個(gè)化合物均與10 個(gè)以上靶點(diǎn)相關(guān)，其中排名最高的是丁香酚，為55 個(gè)。丁香酚可作用于細(xì)胞質(zhì)膜表面，影響細(xì)胞膜的通透性和流通性，導(dǎo)致致病菌與宿主細(xì)胞的黏附減少，降低病原菌的致病性，還能影響細(xì)胞內(nèi)容物的轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)鉀離子和ATP的流失；此外，丁香酚還能激活細(xì)胞內(nèi)的活性氧，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，促使細(xì)菌和真菌的細(xì)胞凋亡［14-15］。Patrícia 等［16］對(duì)酚類(lèi)化合物的抗菌活性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)愈創(chuàng)木酚對(duì)銅綠假單胞菌、大腸桿菌和金葡菌等均展現(xiàn)出良好的抑制功效。Yang 等［17］發(fā)現(xiàn)2，6-二甲氧基苯酚具有良好的抗菌和抗氧化活性，可應(yīng)用于滅菌制劑的開(kāi)發(fā)。楊梅等［18］運(yùn)用DPPH 實(shí)驗(yàn)研究艾葉燃燒物的抗氧化活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中的5-叔丁基鄰苯三酚可以清除自由基，具有良好的抗氧化能力。由此可見(jiàn)，紅核洗液中的丁香酚、愈創(chuàng)木酚和2，6-二甲氧基苯酚等在對(duì)抗病原菌入侵、抑制病原菌生長(zhǎng)和清除體內(nèi)自由基等方面發(fā)揮了良好的功效，可以減輕機(jī)體的感染癥狀。

在“成分-靶點(diǎn)”研究中，本研究發(fā)現(xiàn)了紅核婦潔洗液的潛在作用靶點(diǎn)中有43 個(gè)靶基因與10 個(gè)以上化合物相關(guān)，占30.07%，評(píng)分高低依次為PARP1、PTGS1、ESR1 和IDO1 等。PRAP1 是一種與DNA 損傷和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的DNA 修復(fù)酶，諸多研究表明PARP1 在病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用［19-20］。Wang 等［21］發(fā)現(xiàn)PARP1 還可以抑制IRF1 的轉(zhuǎn)錄，影響Jurkat 細(xì)胞對(duì)感染的免疫應(yīng)答。PTGS 是催化前列腺素合成的關(guān)鍵酶之一，大量研究表明PTGS1（又名COX1）在機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中扮演著十分重要的角色［22-24］。ESR1 可介導(dǎo)雌激素反應(yīng)，有研究發(fā)現(xiàn)ESR1 的激活與ZIKV 病毒的復(fù)制和登革熱病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬具有一定的相關(guān)性［25-26］。此外，Laura 等［27］發(fā)現(xiàn)ESR1 還可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞遷移至陰道腔，對(duì)抗白色念珠菌等致病菌的入侵，降低陰道感染的風(fēng)險(xiǎn)。Noa 等［28］對(duì)沙眼衣原體感染進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)IDO1 可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)，且該調(diào)節(jié)作用不受干擾素分泌的影響。因此，紅核婦潔洗液可從抑制細(xì)菌、病毒感染和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等途徑改善機(jī)體狀態(tài)，發(fā)揮抗感染作用。

在對(duì)紅核婦潔洗液作用的靶基因分析過(guò)程中，本研究發(fā)現(xiàn)包括脂多糖信號(hào)通路、NF-kappa B 信號(hào)通路、炎癥反應(yīng)和缺氧反應(yīng)等多個(gè)信號(hào)通路和生物過(guò)程可能與紅核婦潔洗液的抗感染治療密不可分。做為革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁重要的組成成分，脂多糖可通過(guò)激活TLR4 誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，促進(jìn)下游的NF-κB 和IRF3 等多條信號(hào)通路的活化，加重機(jī)體的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)［29］。TNF 家族是與炎癥刺激緊密相連的細(xì)胞因子，被激活的TNFR可以促進(jìn)IL-1、IL-6 和IL-10 等細(xì)胞因子的釋放，還能激活與細(xì)胞凋亡相關(guān)的MAPK-JNK 和NF-κB 等多條信號(hào)通路，激活磷脂酶A2 和5-脂氧合酶等多個(gè)蛋白，加重機(jī)體的炎癥反應(yīng)［30］。有研究表明藥物和細(xì)胞可通過(guò)影響LPS 和TNF 信號(hào)通路等，降低TNF-α、IL-1β 和IL-6 等細(xì)胞因子的含量，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)機(jī)體的恢復(fù)［31-33］。與此同時(shí)，Yu等［34］發(fā)現(xiàn)能量代謝異?？捎绊懢奘杉?xì)胞分化，加重機(jī)體感染癥狀。此外，Arnab 等［35］指出白色念珠菌等病原菌可通過(guò)調(diào)節(jié)局部免疫，適應(yīng)缺氧環(huán)境，完成定植，增加感染復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。因此，紅核婦潔洗液可通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，改善細(xì)胞缺氧等方面，促進(jìn)感染患者的痊愈。

綜上所述，紅核婦潔洗液可通過(guò)多靶點(diǎn)多通路抑制病原菌的入侵和繁殖，還能調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、減輕炎癥反應(yīng)、緩解氧化應(yīng)激損傷等，促進(jìn)感染癥狀的消退和患者的痊愈。本研究剖析了紅核婦潔洗液的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，為紅核婦潔洗液在治療感染性疾病方面的應(yīng)用提供了合理的解釋。