黃羽肉雞屠宰過程中胴體表面腐敗菌的變化

石金明，王曉明，李凌云，董華發(fā)，劉雅夫,

（1.廣東愛健康生物科技有限公司，廣東清遠 511873；2.溫氏食品集團股份有限公司，廣東云浮 527400）

雞肉具有低脂肪、高蛋白優(yōu)點，鮮美細嫩的肉質(zhì)使其受到消費者的青睞[1]。2021 年我國雞肉產(chǎn)量為1470 萬噸，位居世界第二[2]。在我國禽肉消費市場主要有兩大品類，即白羽肉雞及黃羽肉雞。白羽肉雞產(chǎn)業(yè)是中國畜禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中規(guī)?；B(yǎng)殖程度最高的產(chǎn)業(yè)，經(jīng)過多年產(chǎn)業(yè)發(fā)展與技術(shù)升級，白羽肉雞屠宰可實現(xiàn)自動化流水線作業(yè)，每小時屠宰產(chǎn)能可達1 萬只以上，市場流通產(chǎn)品以冰鮮分割品及調(diào)理品為主。黃羽肉雞又稱國雞主要以我國地方品種為主，市場流通主要以毛雞為主，黃羽肉雞體重較白羽肉雞小且均勻度差，未能像白羽肉雞一樣實現(xiàn)自動化流水線屠宰作業(yè)，屠宰關鍵工序掏膛主要依賴人工，屠宰水平差異導致黃羽肉雞屠宰加工產(chǎn)業(yè)在發(fā)展過程中會比白羽肉雞產(chǎn)業(yè)存在更多痛點。目前，我國部分城市的主城區(qū)開始限制活禽交易，主張家禽“集中屠宰，冷鮮上市”[3]。在理想情況下，雞的肌肉組織中不存在微生物，然而在屠宰過程中，會不可避免地從各種污染源（如皮膚、羽毛、糞便、刀具、臺面、操作工人的手等）帶入微生物到肉雞胴體及其分割產(chǎn)品中[4-5]。集中屠宰過程中因屠宰量大，且部分屠宰場環(huán)境比較落后，很容易造成微生物的交叉污染[3]。冷鮮雞肉加工過程溫度相對較低，使得大部分微生物粘附于其胴體表面，易導致其腐敗變質(zhì)，縮短其貨架期，甚至引發(fā)食品安全問題[6]。比起貯藏溫度，生產(chǎn)過程中良好的操作和預冷方式對貨架期的延長更具關健作用[7]。湯飛[8]從安徽省宣城地區(qū)所產(chǎn)雞肉中分離出大腸菌群，假單胞菌，乳酸菌，金黃色葡萄球菌，沙門氏菌等。王光宇[9]發(fā)現(xiàn)雞肉上的腐敗菌主要有假單胞菌和氣單胞菌。Laconi 等[10]從雞肉中分離出空腸彎曲桿菌和大腸彎曲桿菌。

關于雞肉中菌種的分離鑒定主要有兩種方法，傳統(tǒng)培養(yǎng)基鑒定法和高通量測序鑒定法[11]。傳統(tǒng)培養(yǎng)基鑒定法指的是將稀釋后的菌液均勻涂布在各種特異性選擇性培養(yǎng)基上，然后通過肉眼觀察，挑選出單菌落并置于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后純化分離并提取DNA[12]。僅僅憑肉眼去觀察和挑取菌落，主觀性比較強，很容易遺漏部分菌株[12-13]。高通量測序技術(shù)指的是不需要通過培養(yǎng)細菌，就能準確的分析出樣品中微生物的多樣性。它可以在短時間內(nèi)生成數(shù)千個序列，還能覆蓋復雜的和低豐度的微生物，因此該技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)一些傳統(tǒng)培養(yǎng)基鑒定方法中無法檢測出的微生物[14]。目前，高通量測序技術(shù)已被廣泛應用于食品加工、土壤、水質(zhì)和腸道菌群等相關樣品的微生物多樣性分析[15]。

前期的研究大多以白羽肉雞為實驗原料，因此，本試驗以黃羽雞為研究對象，利用平板傾注法及Illumina MiSeq 高通量測序測定高效地確定黃羽肉雞宰過程中加工環(huán)境和胴體表面腐敗菌的多樣性，研究了屠宰至加工的各個過程中雞肉的表面，以及其可能接觸到的各個臺面的細菌。旨在分析黃羽肉雞屠宰加工環(huán)節(jié)的肉雞胴體菌群組成，將為黃羽肉雞屠宰企業(yè)提高肉雞屠宰衛(wèi)生品質(zhì)、延長貯藏期奠定堅實的理論基礎，為黃羽肉雞屠宰技術(shù)提升和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供研究數(shù)據(jù)和研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃羽雞 溫氏食品集團股份有限公司；營養(yǎng)瓊脂（Nutrient Agar）北京路橋技術(shù)有限責任公司；氯化鈉 國藥集團化學試劑有限公司 NextSeq 500 高通量測序儀 美國illumina 公司；TG16-WS 型臺式高速離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；LRH-250-HS 型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 沈陽亮衡天平儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集 為了分析黃羽雞屠宰過程各工藝中胴體及所接觸臺面的菌群組成，選取屠宰加工過程的黃羽雞為試驗樣品，并對所接觸的臺面進行擦拭以獲得黃羽雞接觸臺面的菌相。本文在屠宰工藝流程取樣點（打毛后（DM）；凈膛后（JH）；凈膛消毒后（CH）；預冷后（YH）；次氯酸電解水處理后（DH）；分級后成品（BZ）；對照（CN））每個點隨機選取三只去毛掏膛后的黃羽雞進行微生物檢測。在接觸面（凈膛工人手套（JS）、分級秤的表面（BC）、分級車間臺面（BT）、分級車間工人手套（BS）、預冷池內(nèi)表面（YB）、預冷池內(nèi)角（YJ））取樣進行微生物檢測，測定在不同工藝點的胴體和接觸面所取的樣品的菌落總數(shù)及假單胞菌數(shù)。同時將洗菌后菌懸液離心獲得菌泥并保存于-80 ℃，用于菌群多樣性分析。

1.2.2 屠宰工藝流程點測試菌液制備 在屠宰工藝流程的不同取樣點隨機選取黃羽肉雞3 只。將稱重后的每只黃羽肉雞胴體與同質(zhì)量無菌生理鹽水加入到無菌取樣袋，室溫條件下200 r/min 振蕩10 min。然后吸取1 mL 菌懸液加入9 mL 滅菌生理鹽水中進行十倍梯度稀釋，制備測試菌液。

1.2.3 加工環(huán)境表面測試菌液制備 選擇加工環(huán)境取樣點與肉雞胴體直接接觸的暴露面為取樣點，將棉簽在5 cm×5 cm 的取樣器范圍內(nèi)擦拭，取樣后置入裝有225 mL 無菌水的均質(zhì)袋中，室溫條件下200 r/min 振蕩10 min。重復取樣三次。振蕩混勻后，對菌懸液十倍稀釋制備測試菌液。

1.2.4 菌落總數(shù)的測定 參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》測定菌落總數(shù)，對30～300 CFU 之間的平板進行計數(shù)[16-17]。

1.2.5 高通量測序 將上述不同屠宰工藝點及接觸表面獲得的菌液在4 ℃離心10 min（2000 r/min）進行第一次離心，然后吸取上清液于4 ℃、12000 r/min離心10 min 進行第二次離心，將第二次獲得菌泥并放入冰箱中，-80 ℃保存。選取引物338F（5’-ACT CCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACT ACNNGGG TATCTAAT-3’）對細菌的V3-V4 區(qū)域進行擴增。利用Illumina Miseq 高通量測序平臺進行樣品的測序。將相似性高于97%的測序樣品中的物種進行分類單元操作（operational taxonomic units，OTU）[18]。然后，將所測得的OTU 與Silva 數(shù)據(jù)庫里的信息進行比對，獲得相應的物種多樣性信息。并計算分析alpha 多樣性中的各個指數(shù)（Chao1、Observed_species、PD_whole_tree 及 Shannon）。利 用UniFrac 算法對系統(tǒng)進化的信息進行比較各個樣品間微生物菌群的差異性，并進行Beta 多樣性分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 進行統(tǒng)計，利用SPSS 19.0 軟件進行顯著性分析，P＜0.05 為差異顯著。使用Origin 2018C 進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 屠宰過程中肉雞胴體表面菌數(shù)變化

屠宰過程中各工藝點的黃羽雞胴體總菌數(shù)變化如圖1 所示。由圖1 所示，在黃羽雞屠宰流程中，經(jīng)打毛后黃羽肉雞胴體的菌落總數(shù)為4.43 lg（CFU/g），凈膛后菌落總數(shù)為4.87 lg（CFU/g），這可能是因為凈膛過程存在外源操作及腸道菌群污染的幾率。凈膛后胴體經(jīng)過次氯酸鈉溶液清洗后，菌落總數(shù)降為4.28 lg（CFU/g），經(jīng)預冷后菌落總數(shù)回升至4.58 lg（CFU/g），說明預冷槽成為黃羽雞胴體菌落總數(shù)增長的第二個污染點。經(jīng)分級篩選后，胴體菌落總數(shù)再次上升至4.63 lg（CFU/g）。由圖1 可知，凈膛、預冷及分級篩選是黃羽肉雞菌數(shù)增長的主要污染源，在屠宰過程中需關注以上工序衛(wèi)生操作及微生物控制。

圖1 黃羽雞胴體菌落總數(shù)Fig.1 Distribution of the total viable bacteria count in yellow feather chicken carcass

2.2 加工環(huán)境表面菌數(shù)變化

本試驗選擇凈膛工人手套、預冷槽內(nèi)表面和內(nèi)角、分級車間臺面及分級車間工人手套為取樣對象，分析其總菌數(shù)分布情況，結(jié)果如圖2。由圖2 可知，所有接觸表面中預冷池內(nèi)角總菌數(shù)最高，為5.42 lg（CFU/cm2）；分級秤表面次之為4.85 lg（CFU/cm2）；預冷槽內(nèi)角、凈膛工人手套、分級車間工人手套分別高達4.56、4.39、4.06 lg（CFU/cm2）。由此可知，凈膛工人手套、預冷槽、分級秤及分級車間工人手套成為影響黃羽雞總菌數(shù)變化在凈膛、預冷及分級篩選后工藝點主要的污染源。

圖2 設備表面菌落總數(shù)分布Fig.2 Distribution of the total viable bacteria counts in the equipment surface

2.3 Alpha 多樣性指數(shù)分析結(jié)果

Alpha 多樣性指數(shù)是指特定環(huán)境內(nèi)多樣性，主要由Chao1、Observed_species、PD_whole_tree 及Shannon 反應物種豐度、均勻度以及測序深度[19-20]。由圖3 可知，分級秤的表面（BC）的Chao1、Shannon 指數(shù)高于其他組，再次說明分級秤表面菌群豐度和多樣性是各工藝點最高。這一結(jié)果與成品菌相豐度和多樣性相一致。

圖3 菌群Alpha 多樣性指數(shù)箱圖Fig.3 Box plots for alpha diversity indexes of microflora

2.4 菌群分布聚類分析

2.4.1 基于科分類水平的分析 由圖4 可知，打毛后（DM）、凈膛后（JH）、凈膛消毒后（CH）黃羽雞胴體優(yōu)勢菌主要為鏈球菌科（Streptococcaceae），腸桿菌科（Enterobacteriaceae）次之，氣單胞菌科（Aeromonadaceae）僅次于腸桿菌科。凈膛后經(jīng)瞬時清洗消毒后腸桿菌科所占比例大幅下降。黃羽雞經(jīng)預冷槽預冷后氣單胞菌科豐度大幅增加。說明預冷槽中環(huán)境溫度及其他條件更適宜于氣單胞菌科生長。進入電解水減菌槽后，氣單胞菌科和鏈球菌科豐度大幅下降，說明次氯酸對這兩類菌具有較好抑制作用。莫拉氏菌科（Moraxellaceae）成為黃羽雞減菌后的優(yōu)勢菌群，氣單胞菌科次之。經(jīng)過分級秤分級后黃羽雞胴體菌群中莫拉氏菌科豐度再次增加，說明分級秤表面污染優(yōu)勢菌群主要是莫拉氏菌科。并通過對分級秤表面菌群多樣性的分析，也證實分級秤表面的優(yōu)勢菌主要為莫拉氏菌科?；谝陨峡茖俜治?，屠宰過程微生物控制需關注不同科屬菌類特性，控制屠宰條件定向消減微生物。

圖4 基于科水平的物種組成分析柱狀圖Fig.4 Bacterial community distribution at the family level

2.4.2 基于屬分類水平的分析 熱圖通過不同顏色深淺的變化來反映二維矩陣或表格中的原始數(shù)據(jù)信息[19]，如圖5 所示，屠宰7 個工藝點黃羽雞胴體菌群多樣性以及分級秤表面和預冷池內(nèi)部菌群多樣性結(jié)果。打毛后（DM）、凈膛消毒后（CH）、預冷后（YH）、電解水處理后（DH）黃羽雞胴體優(yōu)勢菌主要為鏈球菌屬，大腸桿菌屬、氣單胞菌屬。分級秤的表面（BC）、分級車間臺面（BZ）優(yōu)勢菌主要為不動桿菌屬、巨球菌屬和嗜冷桿菌屬。

圖5 菌屬分類學熱圖Fig.5 Taxonomy heat map of bacteria

由圖6 可知，打毛后（DM）、凈膛后（JH）、凈膛消毒后（CH）黃羽雞胴體優(yōu)勢菌主要為鏈球菌屬（Streptococcus），大腸桿菌屬（Escherichia）和氣單胞菌屬（Aeromonas）次之。凈膛后經(jīng)瞬時清洗消毒對大腸桿菌科減菌效果顯著。黃羽雞經(jīng)預冷槽預冷后氣單胞菌屬豐度大幅增加，鏈球菌屬次之。經(jīng)額外添加次氯酸電解水減菌后，氣單胞菌屬和鏈球菌屬豐度大幅下降，說明次氯酸電解水減菌效果較好。經(jīng)過分級秤分級后黃羽雞胴體菌群中不動桿菌屬（Acinetobacter）成為主要優(yōu)勢菌，巨球菌屬（Macrococcus）次之。并通過對分級秤表面菌群多樣性的分析，也證實分級秤表面的優(yōu)勢菌主要為不動桿菌屬、巨球菌屬和嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）。以上檢測數(shù)據(jù)表明，分級過程需針對性控制接觸面微生物，目前黃羽肉雞屠宰減菌技術(shù)主要依賴預冷環(huán)節(jié)次氯酸電解水進行減菌，需針對性研究附加減菌環(huán)節(jié)及屠宰分級過程接觸面衛(wèi)生控制方法。

圖6 基于屬水平的物種組成分析柱狀圖Fig.6 Bacterial community distribution at the genus level

3 討論

微生物是導致雞肉腐敗的主要因素。肉雞在屠宰加工的過程中所接觸的各個表面都將可能成為肉雞胴體的污染源。因此，通過分析肉雞胴體屠宰過程中所接觸的各個表面的微生物菌群結(jié)構(gòu)，從而為企業(yè)中雞肉的保鮮防腐提供理論基礎是非常必要的。肉雞胴體、處理水和設備之間的交叉污染會增加肉雞胴體的微生物污染水平[21]。本試驗研究結(jié)果表明分級秤的表面（BC）的微生物的豐富度最高，這主要因為分級稱會接觸到不同的肉雞胴體，這大大增加了雞肉上微生物相互污染的機會；預冷池內(nèi)表面（YB）和預冷池內(nèi)角（YJ）的微生物生物的豐富度較低，這主要原因是屠宰預冷水中通常會加入一定含量的次氯酸電解水，這對微生物會有殺滅作用，可以有效地減少微生物的菌群數(shù)量，降低微生物的物種豐富度，抑制雞肉胴體上腐敗菌的生長[22]，黃羽雞經(jīng)預冷槽預冷后氣單胞菌科豐度大幅增加，說明預冷槽中環(huán)境溫度及其他條件更適宜于氣單胞菌科生長；凈膛操作會增加微生物污染，這可能是因為凈膛過程存在外源操作及腸道菌群污染的幾率在凈膛后經(jīng)瞬時清洗消毒后腸桿菌科所占比例大幅下降。本試驗測試了次氯酸電解水在屠宰后對黃羽肉雞雞胴體減菌效果，試驗結(jié)果表明經(jīng)額外添加次氯酸電解水減菌后，氣單胞菌屬和鏈球菌屬豐度大幅下降，說明次氯酸電解水減菌效果較好。任晉東等[23]報道消毒劑可以顯著地抑制雞肉上腐敗菌的生長，并不對雞肉的感官品質(zhì)產(chǎn)生不利的影響。韓千慧等[24]報道酸性電解水能有效地降低醬鹵鴨制品在冷涼及貯藏過程中的微生物的數(shù)量。針對以上從屬的水平上看，鏈球菌屬（Streptococcus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、氣單胞菌屬（Aeromonas）等是肉雞胴體在各個不同處理環(huán)節(jié)中都會存在的菌種。戴寶玲等[3]報道通過高通測序發(fā)現(xiàn)雞肉屠宰場空氣中含有不動桿菌屬（Acinetobacter）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）和埃希菌屬（Escherichia）等菌屬。桂國弘等[25]報道雞肉的儲藏過程中的優(yōu)勢菌屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、腸球菌屬（Enterococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、大腸桿菌屬（Escherichia），本研究結(jié)果與之相類似。

4 結(jié)論

綜合本試驗研究結(jié)果，凈膛、預冷及分級篩選工序是黃羽肉雞菌數(shù)增長的主要污染來源工序，分級秤、分級車間工人手套、預冷槽及凈膛工人手套為以上三個工序中污染來源接觸面，且分級秤及分級車間工人手套所污染菌群是黃羽雞胴體菌群的主要來源，促使黃羽雞胴體表面總菌數(shù)增長率高達24.13%，經(jīng)過分級秤及分級車間工人手后黃羽雞菌落總數(shù)顯著增加至4.63 lg（CFU/g）（P＜0.05），黃羽肉雞屠宰企業(yè)在屠宰過程中需關注以上三個工序衛(wèi)生操作及接觸面微生物控制，對分級秤、分級車間工人手套、預冷槽及凈膛工人手套進行定期消毒將有助于黃羽雞生鮮肉制品的保鮮和貯藏。打毛后（DM）、凈膛后（JH）、凈膛消毒后（CH）黃羽雞胴體優(yōu)勢菌主要為鏈球菌屬（Streptococcus），大腸桿菌屬（Escherichia）和氣單胞菌屬（Aeromonas）次之。凈膛后經(jīng)瞬時清洗消毒對大腸桿菌科減菌效果顯著。黃羽雞經(jīng)預冷槽預冷后氣單胞菌屬豐度大幅增加，鏈球菌屬次之。經(jīng)過分級秤分級后黃羽雞胴體菌群中不動桿菌屬（Acinetobacter）為主要優(yōu)勢菌，巨球菌屬（Macrococcus）次之。額外添加次氯酸電解水減菌后，黃羽肉雞胴體表明氣單胞菌屬和鏈球菌屬豐度大幅下降，說明次氯酸電解水減菌效果較好。本試驗通過微生物分析發(fā)現(xiàn)了黃羽肉雞屠宰過程中的主要污染源及不同環(huán)節(jié)微生物優(yōu)勢菌屬，并證明次氯酸電解水有良好的殺菌效果，未針對性研究不同菌屬減菌方法，也未能找到在分級挑選后集成流水線殺菌方法，后續(xù)相關研究工作者需關注屠宰工藝優(yōu)化及關鍵污染環(huán)節(jié)殺菌集成方法，繼續(xù)提升黃羽肉雞屠宰水平。