北蟲草水提物對小鼠酒精性肝損傷保護(hù)作用及機(jī)制*

王千慧，劉 穎，鄭劍玲，黃竹青，卜 桐，曲思吉，叢莉匯，韓桃桃，齊 賀

（遼寧省基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所遼寧醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物技術(shù)教研室，遼寧 沈陽 110101）

北蟲草（Cordyceps militaris），又稱為北冬蟲夏草，屬于子囊菌門（Ascomycota）糞殼菌綱（Sordariomycetes）肉座菌目（Hypocreales）蟲草科（Cordycipitaceae）蟲草屬（Cordyceps）[6]。北蟲草中富含腺苷、蟲草素、蟲草酸、小分子肽等多種活性物質(zhì)，具有良好的免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、抗感染等藥理學(xué)作用[7-9]。

酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）是目前世界范圍內(nèi)最常見的慢性肝病，同時(shí)也是我國最常見的肝臟疾病之一，其誘因?yàn)榛颊唛L期大量飲酒[1]。ALD初期通常表現(xiàn)為脂肪肝，進(jìn)而發(fā)展成酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化；嚴(yán)重酗酒會(huì)誘發(fā)廣泛肝細(xì)胞壞死，甚至引起衰竭，嚴(yán)重危害身體健康[2-3]。ALD的發(fā)病機(jī)制包括導(dǎo)致肝臟脂肪變性、氧化應(yīng)激，乙醇代謝中間產(chǎn)物乙醛介導(dǎo)的毒性以及細(xì)胞因子和趨化因子誘導(dǎo)的炎癥等[4-5]。

本課題組在前期研究中已發(fā)現(xiàn)北蟲草水提物對小鼠酒精性胃損傷具有保護(hù)作用，在此基礎(chǔ)上，以提升機(jī)體抗氧化能力、促進(jìn)乙醇代謝，降低機(jī)體炎癥反應(yīng)等因素為切入點(diǎn)，進(jìn)一步探討北蟲草水提物對小鼠酒精性肝損傷保護(hù)作用及其機(jī)制，為拓展開發(fā)北蟲草相關(guān)產(chǎn)品提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF級昆明小鼠，8周齡～10周齡，體重25 g～30 g，試驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。雌雄各半分籠飼養(yǎng)，每日12 h光照，飲水自由。

1.2 試劑

超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒、丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）活性檢測試劑盒、乙醇脫氫酶（ADH）活性檢測試劑盒、乙醛脫氫酶（ALDH）活性檢測試劑盒，北京索萊寶生物科技有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒，南京建成科技有限公司；一抗、二抗及ECL發(fā)光試劑，武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 儀器

ST8R高速冷凍離心機(jī)，美國賽默飛世爾公司；LGJ-10N凍干機(jī)，北京亞星儀科科技發(fā)展有限公司；K6600-A酶標(biāo)儀，北京凱奧科技有限公司；Scientz-950E細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；Eclipse Ci-L正置白光拍照顯微鏡，日本尼康公司；BV-2垂直電泳儀、BT-2轉(zhuǎn)印電泳儀，武漢賽維爾生物科技有限公司；6300化學(xué)發(fā)光儀，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 北蟲草水提物制備方法

采用低溫、高溫提取相結(jié)合方法。低溫提取溫度為 45℃，料液比 1∶30，提取 3 h，4 000 r·min-1離心10 min，分離得到上清液Ⅰ；再對沉淀進(jìn)行高溫提取，溫度為80℃，料液比為1∶30，提取3.5 h后4 000 r·min-1離心10 min，得上清液Ⅱ；合并2次上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮，最后將濃縮液凍干得到粉末，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。使用時(shí)，用純化水進(jìn)行溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配[10]。

1.4.2 造模及給藥方法

將30只昆明小鼠隨機(jī)分成5組，每組雌雄各半。

陰性對照組：常規(guī)飼料，飲食自由，每日上午用蒸餾水（10 mL·kg-1）灌胃，3 h后再次采用蒸餾水（0.1 mL·kg-1）灌胃。

病理模型組：常規(guī)飼料，飲食自由，參照參考文獻(xiàn)[11-12]的造模方法和預(yù)試驗(yàn)情況，每日上午用35%酒精（10 mL·kg-1）灌胃，3 h后用蒸餾水（0.1 mL·kg-1））灌胃。

北蟲草給藥組（3組）：常規(guī)飼料，飲食自由，每日上午用35%酒精（10 mL·kg-1）灌胃，3 h后分別用 0.5 g·kg-1、1.0 g·kg-1和 2.0 g·kg-1北蟲草水提物進(jìn)行灌胃。

各組皆飼養(yǎng)14 d，末次灌胃后禁食不禁水，24 h后處死小鼠并立刻取材[10]。

1.4.3 小鼠血液樣本采集與血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶酶活性檢測

各組小鼠摘眼球取血，靜止2 h，3 500 r·min-1、4℃條件下離心15 min。取上清液，嚴(yán)格按照酶活性試劑說明書進(jìn)行檢測。

1.4.4 小鼠肝組織相關(guān)酶活性及丙二醛含量檢測

將各組小鼠肝組織按0.1 g·mL-1加入相應(yīng)提取液，于冰浴下勻漿，然后將勻漿液置于超聲波細(xì)胞粉碎儀中，功率200 W、超聲3 s，間隔10 s，重復(fù)30次破碎細(xì)胞。按各試劑盒說明書要求分別離心獲取各組小鼠肝組織上清液，分別測定各組小鼠肝組織上清液中超氧化物歧化酶SOD、乙醇脫氫酶ADH和乙醛脫氫酶ALDH活性及丙二醛MDA含量。

1.4.5 小鼠肝組織病理學(xué)檢查

小鼠肝臟用冷生理鹽水沖洗，剪取肝臟左葉用4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)方法制作石蠟切片，采用蘇木精-伊紅染色法HE（hematoxylin-eosin staining，HE）進(jìn)行染色并于光學(xué)顯微鏡下檢查組織病理學(xué)變化。

1.4.6 小鼠肝組織NF-κB和TNF-α蛋白表達(dá)水平

運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡法檢測小鼠肝組織NF-κB（大小為65 KD），和TNF-α蛋白表達(dá)水平。用RAPI裂解液處理小鼠肝組織勻漿液30 min，4 000 r·min-1離心10 min后取上清。采用二喹啉甲酸法BCA（bicinchoninic acid assay，BCA）蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，蛋白經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。采用脫脂奶粉封閉1 h后加入相應(yīng)一抗（NF-κB和TNF-α），4℃孵育過夜。次日洗滌、室溫孵育二抗2 h，用凝膠成像儀成像、進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

研究數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0分析，所得數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多樣本間均值差異采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

北蟲草水提物對酒精性肝損傷小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性影響試驗(yàn)結(jié)果（±s，n=6）見表1。

表1 北蟲草水提物對酒精性肝損傷小鼠血清ALT、AST活性影響Tab.1 Effects of Cordyceps militaris water extract on serum ALT and AST activities in mice with alcoholic liver injury

如表1所示，與對照組小鼠相比，病理模型組小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT和谷草轉(zhuǎn)氨酶AST活性均明顯升高；與病理模型組相比，各濃度北蟲草水提物均能不同程度的降低小鼠血清中ALT、AST活性，且AST活性呈現(xiàn)濃度依賴性。

北蟲草水提物對酒精肝損傷小鼠肝組織超氧化物歧化酶SOD活性和丙二醛MDA含量影響試驗(yàn)結(jié)果（±s，n=6）見表 2。

如表2所示，與對照組相比，模型組小鼠肝組織中SOD活性均明顯下降，而MDA含量明顯增高（P<0.01）；與模型組相比，各濃度組小鼠肝組織中的SOD活性增強(qiáng)，且存在濃度依賴性；同模型組相比，中濃度組和高濃度組小鼠肝組織中MDA含量明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而低濃度組則無明顯差異。

表2 北蟲草水提物對酒精性肝損傷小鼠肝組織SOD活性和MDA含量影響Tab.2 Effects of Cordyceps militaris water extract on SOD,GST and MDA of hepatic homogenate in mice of liver injury

北蟲草水提物對酒精肝損傷小鼠肝組織乙醇脫氫酶ADH和乙醛脫氫酶ALDH活性影響（±s，n=6）試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 北蟲草水提物對酒精性肝損傷小鼠肝組織ADH和ALDH活性影響Tab.3 Effects of Cordyceps militaris water extract on SOD,GST and MDA of hepatic homogenate in mice of liver injury

如表3所示，與對照組相比，模型組小鼠肝組織中ADH活性均升高（P<0.05）；與模型組相比，在分別給予北蟲草水提物后，小鼠肝組織中ADH、ALDH活性進(jìn)一步升高，且存在濃度依賴性。

200倍鏡下觀察各組小鼠肝臟組織病理學(xué)變化，小鼠肝組織石蠟切片HE染色結(jié)果見圖1。

圖1 北蟲草水提物對小鼠酒精肝損傷組織病理變化的影響Fig.1 Effect of Cordyceps militaris water extract on alcoholinduced histopathological change

由圖1可知，對照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列整齊，肝細(xì)胞胞質(zhì)豐富、形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；病理模型組小鼠肝組織廣泛可見肝細(xì)胞脂肪變性，胞質(zhì)內(nèi)可見大小不一的圓形脂肪空泡（黑箭頭），可見較多肝細(xì)胞水腫，胞質(zhì)疏松（白箭頭）；北蟲草水提物低濃度組與模型組小鼠相近，視野內(nèi)可見肝細(xì)胞脂肪空泡、細(xì)胞水腫、胞質(zhì)松散等情況，而中濃度組、高濃度組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)較為正常，雖可見散在脂滴，但肝索排列尚整齊，細(xì)胞形態(tài)較為正常，肝竇未見明顯擴(kuò)張或擠壓，未見明顯炎癥。

各組小鼠肝臟組織中核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和腫瘤壞死因子TNF-α蛋白表達(dá)含量變化見圖2。

如圖2所示，與對照組相比，模型組小鼠肝組織中 NF-κB和 TNF-α蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05）；與模型組相比，給予北蟲草水提物后，小鼠肝組織中NF-κB蛋白表達(dá)下調(diào)，其呈現(xiàn)濃度依賴性低濃度北蟲草水提物對TNF-α蛋白表達(dá)量無明顯影響，中濃度和高濃度北蟲草水提物可使TNF-α蛋白表達(dá)量有所下降（P<0.05）。

圖2 北蟲草水提物對小鼠酒精肝損傷組織中NF-κB和TNF-α蛋白表達(dá)影響Fig.2 Effect of Cordyceps militaris water extract on the expression of NF-κB and TNF-α protein in alcoholic liver injury in mice

3 討論

酗酒是導(dǎo)致人類疾病與殘疾的三大危險(xiǎn)因素之一，約有200余種疾病與過度飲酒相關(guān)，使癌癥風(fēng)險(xiǎn)上升[13]。肝臟是乙醇代謝的主要器官，乙醇代謝過程中，其本身及代謝產(chǎn)物如乙醇乙酸鹽、脂肪酸乙醇酯、乙醇蛋白復(fù)合物均會(huì)對肝組織造成直接或間接的毒性作用[14]。通過觀察病理切片可見：模型組小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯病理變化，肝索結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞界限、細(xì)胞核模糊不清，胞質(zhì)疏松，有明顯的脂肪空泡，同時(shí)出現(xiàn)炎癥和壞死區(qū)；北蟲草水提物給藥組鏡下可見肝臟出現(xiàn)病理變化，但病變程度均較模型組輕，肝索排列尚整齊，細(xì)胞邊界、細(xì)胞核較為清晰，細(xì)胞內(nèi)可見散在脂滴，有輕微炎癥和壞死區(qū)，表明北蟲草水提物具有肝臟保護(hù)作用。

ALT、AST是機(jī)體內(nèi)2種十分重要的轉(zhuǎn)氨酶，臨床上常用血清ALT、AST活性反映肝細(xì)胞損傷程度。研究中發(fā)現(xiàn)病理組小鼠血清ALT、AST活性明顯升高，表明短期攝入高濃度酒精對小鼠肝細(xì)胞及細(xì)胞線粒體造成損傷；當(dāng)給予不同濃度北蟲草水提物后，各組小鼠血清中ALT、AST活性明顯下降，同時(shí)各給藥組小鼠其肝細(xì)胞病理損傷程度均有所緩解，表明北蟲草水提物具有肝細(xì)胞保護(hù)作用。

機(jī)體氧化與抗氧化失衡時(shí)即產(chǎn)生氧化應(yīng)激，目前大量證據(jù)表明氧化應(yīng)激在酒精性肝損傷過程中發(fā)揮重要作用。乙醇經(jīng)ADH代謝過程會(huì)增加還原性輔酶ⅠNADH（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）水平，增加了呼吸連中電子流；同時(shí)也可激活微粒體乙醇氧化酶系統(tǒng)（MEOS）和還原型輔酶Ⅱ NADPH（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH），產(chǎn)生大量活性氧（reactiveoxygen species，ROS），因此酒精代謝導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷可產(chǎn)生一系列級聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞內(nèi)生物大分子和細(xì)胞器損傷、生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路改變、增加機(jī)體促炎細(xì)胞因子水平等[15-17]。SOD是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中最重要的酶類之一，對維持細(xì)胞與線粒體正常功能和結(jié)構(gòu)完整性中起到重要作用[18]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)鏈?zhǔn)浇K止階段的產(chǎn)物之一，其含量多少可直接反映機(jī)體產(chǎn)生自由基的情況和組織細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度。在研究中模型組小鼠肝組織中SOD活性較正常組小鼠明顯下降，而MDA含量卻顯著提升；當(dāng)分別給予不同濃度北蟲草水提物后，各組小鼠肝組織中SOD活性均有所升高，MDA含量均降低，表明短期大量攝入酒精可引起小鼠肝組織氧化應(yīng)激，機(jī)體抗氧化能力減弱、脂質(zhì)過氧化水平升高，但北蟲草水提物可有效提高小鼠肝組織中SOD活性，降低MDA含量，提升機(jī)體抗氧化劑清除ROS能力，降低機(jī)體脂質(zhì)過氧化水平，這也可能是北蟲草水提物拮抗小鼠酒精性肝損傷作用機(jī)制之一。

機(jī)體攝入酒精后，乙醇主要經(jīng)肝組織ADH介導(dǎo)先氧化生成乙醛[19]；少部分乙醇則通過微粒體乙醇氧化酶轉(zhuǎn)化成乙醛，乙醛經(jīng)ALDH氧化成乙酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，最終氧化成二氧化碳和水排出體外。因此當(dāng)肝臟中ADH活性下降時(shí)，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體乙醇蓄積，從而加重乙醇對肝、腦、腎等重要臟器的毒害作用[20-21]。研究中發(fā)現(xiàn)，給予酒精后，小鼠肝組織中ADH活性有所提高；當(dāng)給予北蟲草水提物后，各組小鼠ADH活性進(jìn)一步提高，表明北蟲草水提物可通過提高肝ADH活性，促進(jìn)乙醇代謝，降低乙醇對肝臟的損傷和刺激作用，進(jìn)而保護(hù)肝臟和其他重要臟器。

乙醛作為中間產(chǎn)物可直接觸發(fā)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)重塑和纖維化，同時(shí)還可直接刺激肝星狀細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)一步加重纖維化和炎癥作用，直接損傷肝組織[22-23]；此外乙醛還可與蛋白質(zhì)、DNA共價(jià)結(jié)合，導(dǎo)致肝細(xì)胞中產(chǎn)生MDA，進(jìn)一步加重肝損傷[24]。因此加速乙醛代謝對肝保護(hù)作用至關(guān)重要。研究中發(fā)現(xiàn)病理組小鼠肝組織中ALDH活性略微上升；當(dāng)給予北蟲草水提物后，各組小鼠肝組織中ALDH活性明顯升高，呈現(xiàn)濃度依賴性，表明北蟲草水提物可通過提高機(jī)體肝組織ALDH活性促進(jìn)乙醛代謝、降低乙醛對肝臟刺激和毒害作用，進(jìn)而保護(hù)肝組織。綜上，北蟲草水提物可通過增強(qiáng)肝臟ADH、ALDH活性，加速乙醇、乙醛代謝，降低其對肝細(xì)胞毒性作用和肝臟負(fù)荷，進(jìn)而發(fā)揮肝保護(hù)作用。

目前已有大量的研究表明NF-κB廣泛參與機(jī)體炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)等基因表達(dá)調(diào)控，是機(jī)體內(nèi)重要的炎癥轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[25-26]。正常情況下，其與抑制亞基IκB以復(fù)合物形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)受到細(xì)胞外信號(hào)刺激時(shí)，如氧化應(yīng)激刺激等信號(hào)，IκB被磷酸化并從復(fù)合物上解離下來，NF-κB迅速轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核中并與特定的κB序列結(jié)合，調(diào)控包括TNF-α和IL-6在內(nèi)的眾多炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[27-29]。

TNF-α是由機(jī)體內(nèi)多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生的具有重要生物活性的炎癥因子，目前與乙醇相關(guān)的肝組織疾病發(fā)病機(jī)制中，普遍認(rèn)為最后共同通路由TNF-α介導(dǎo)，且已有研究發(fā)現(xiàn)TNF-α在酒精性肝損傷患者中過表達(dá)[30-31]。Masaki等[32]研究發(fā)現(xiàn)，對酒精性肝損傷大鼠給予抗TNF-α抗體或敲除TNF-α受體基因后，大鼠肝臟未出現(xiàn)炎癥及壞死情況。機(jī)體飲酒后造成氧化應(yīng)激損傷，同時(shí)產(chǎn)生大量ROS，此時(shí)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB被激活，進(jìn)而激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白1/2（ERK1/2），早期生長反應(yīng)因子-1（Egr-1）和蛋白激酶P38途徑，促使細(xì)胞產(chǎn)生大量TNF-α[33-35]。而TNF-α則通過多種途徑誘導(dǎo)了肝細(xì)胞凋亡，包括死亡受體通路及線粒體通路。在研究中發(fā)現(xiàn)，病理組小鼠NF-κB和TNF-α蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，與病理組小鼠相比，北蟲草水提物各組小鼠NF-κB蛋白下調(diào)，且呈濃度依賴性；在中濃度、高濃度北蟲草水提物組中，小鼠TNF-α蛋白表達(dá)下調(diào)，表明北蟲草水提物可通過調(diào)控小鼠肝組織中NF-κB信號(hào)通路，抑制TNF-α釋放來避免肝細(xì)胞凋亡，保護(hù)肝組織。

綜上，北蟲草水提物具有良好的抗酒精所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激肝損傷作用，可幫助機(jī)體提高乙醇代謝能力，通過調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路，抑制TNF-α等炎癥因子釋放，從而發(fā)揮對酒精性肝損傷的保護(hù)作用。