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    適用于食用菌擔(dān)子結(jié)構(gòu)觀察的冷凍切片技術(shù)*

    2022-06-08 11:49:02余秋雨王守現(xiàn)
    中國(guó)食用菌 2022年5期
    關(guān)鍵詞:奧德擔(dān)子切片

    余秋雨,嚴(yán) 冬,劉 宇,王守現(xiàn),高 琪

    (1.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所,北京 100097;2.東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院,上海 201620)

    食用菌子實(shí)體的形成和發(fā)育機(jī)制是近年來食用菌領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。從細(xì)胞生物學(xué)層面對(duì)子實(shí)體結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察是研究子實(shí)體形成、發(fā)育最為有效和直觀的方法[1]。雜交育種是目前食用菌新品種選育的主要方法,明確擔(dān)孢子的核相和有性生活史是擔(dān)子菌開展雜交育種的基礎(chǔ)[2-3]。孢子內(nèi)的細(xì)胞核數(shù)直接影響擔(dān)子菌的有性生殖模式[4],解析擔(dān)子中細(xì)胞核的行為從而明確擔(dān)孢子中的核數(shù),不僅是研究擔(dān)子類食用菌有性生活史的基礎(chǔ),而且對(duì)開展食用菌新品種的育種工作來說也極有必要。

    便捷的連續(xù)切片及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位技術(shù),有助于通過細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)觀察食用菌擔(dān)子結(jié)構(gòu)及其細(xì)胞核變化規(guī)律。常用的切片方法有徒手切片法、石蠟切片法和冷凍切片法等。徒手切片法是進(jìn)行動(dòng)、植物組織顯微觀察時(shí)最實(shí)用的方法之一,其不需要專門的儀器設(shè)備和特殊化學(xué)試劑(脫水劑、包埋劑等)處理。但觀察效果與樣品處理后的軟硬程度和切片的形態(tài)密切相關(guān),且在制片過程中樣品的組織結(jié)構(gòu)易被破壞,難以得到薄而完整的切片[2]。例如常用的刀片壓切法,將樣品組織夾在兩塊刀片間壓切,得到的切片往往破損較多,有些含海綿組織較多的樣品,在海綿組織受壓復(fù)原時(shí)會(huì)因吸入空氣而使顯微視野下出現(xiàn)氣泡,嚴(yán)重影響觀察結(jié)果[5]。由此可見,該方法對(duì)操作者的技術(shù)要求較高。石蠟切片法已廣泛應(yīng)用于動(dòng)、植物組織的顯微觀察中,在大型真菌如雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)、黑木耳(Auricularia auricula)和橘黃裸傘(Gymnopilus spectabilis)等子實(shí)體的研究中也有應(yīng)用[6-8]。但石蠟切片法的步驟多、耗時(shí)長(zhǎng),所使用的試劑如二甲苯毒性較大,會(huì)對(duì)操作者的身體健康造成一定影響[9]。另外,在石蠟切片染色過程中食用菌材料不易著色[10],高溫融蠟這一操作極易導(dǎo)致樣品組織結(jié)構(gòu)和染色體的損傷,并且石蠟自發(fā)熒光的干擾會(huì)使其不適于熒光染色以進(jìn)行一些其他的免疫熒光染色觀察[11]。

    冷凍切片法,是將樣品組織置于低溫條件下,待其硬度達(dá)到一定要求時(shí)進(jìn)行切片。與常規(guī)的石蠟切片法相比,冷凍切片的制作過程無需脫水、透明和浸蠟等操作,不會(huì)因高溫融蠟而造成樣品組織的損傷,可保持樣品原有的形態(tài),常用于原位雜交、組織化學(xué)和免疫定位等研究[12-13]。李建霞等[12]以毛白楊的子房組織為例,優(yōu)化了直接包埋冷凍切片技術(shù)的冷箱溫度、冷臺(tái)溫度和冷凍時(shí)間,獲得了較好的切片,并在其他植物組織上驗(yàn)證了該方法的普適性。張力平[14]根據(jù)工作經(jīng)驗(yàn)和試驗(yàn),改良固定液成分,探索出一套適用于植物病原真菌的冷凍切片技術(shù)。姚娟妮等[15]將冷凍切片技術(shù)用于植物病原菌侵染的預(yù)檢。由于不同種類的樣品組織具有不同的性質(zhì)和特點(diǎn),相應(yīng)的冷凍切片制備方法也存在一定差異。食用菌的子實(shí)體和菌絲體較軟,尤其是子實(shí)體的菌褶部分較小、易碎且含水量高,常規(guī)切片耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜,不能滿足食用菌顯微結(jié)構(gòu)觀察的試驗(yàn)需求。鑒于冷凍切片具有操作便捷、用時(shí)短、組織完整性好等優(yōu)點(diǎn),對(duì)冷凍切片技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化,建立高效且適用于食用菌組織的冷凍切片技術(shù),以期為食用菌的分類鑒定、有性生活史研究和新品種的選育提供技術(shù)支撐。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    絲球小奧德蘑(Oudemansiella apalosarca)菌株JZB-2115055、香菇(Lentinula edodes)菌株JZB-2102217和平菇(Pleurotus ostreatus)菌株 JZB-2101390,由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所食用菌研究室提供。

    1.1.1 栽培料配方

    絲球小奧德蘑栽培料:棉籽殼50%、木屑30%、麩皮18%、石灰2%,含水量60%~65%;香菇栽培料:木屑78%、麩皮20%、石膏1%、葡萄糖1%,含水量50%~55%;平菇栽培料:棉籽殼39%、玉米芯39%、麩皮20%、石灰2%,含水量60%~65%。

    1.1.2 主要試劑與儀器

    海藻糖、甘油、蔗糖、0.1 mol·L-1KH2PO4、0.1 mol·L-1Na2HPO4·12H2O、 0.001 9 mol·L-1NaH2PO4·2H2O、0.008 1 mol·L-1Na2HPO4·12H2O,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;冷凍切片組織包埋劑,購(gòu)自Leica公司;4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI),購(gòu)自Sigma公司;戊二醛固定液(2.5%戊二醛),多聚甲醛固定液(4%多聚甲醛),購(gòu)自Solarbio公司。

    CM1950冷凍切片機(jī),Leica公司;IX71熒光倒置顯微鏡,Olympus公司。

    1.2 試驗(yàn)步驟

    1.2.1 固定

    用鑷子選取絲球小奧德蘑的菌褶組織,用0.1 mol·L-1磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗2次,加入含有不同成分的固定液,于4℃下固定,棄液體,得到固定好的樣品。對(duì)照組不加固定液。不同固定方式及分組見表1。

    表1 絲球小奧德磨的菌褶組織的不同固定方式Tab.1 The different fixation method for Oudemansiella apalosarca gill

    1.2.2 預(yù)處理

    將固定好的樣品用PBS清洗2次~3次后,設(shè)置5個(gè)分組(P1~P5)進(jìn)行預(yù)處理。P1:海藻糖5%、甘油10%,室溫孵育1 h;P2:海藻糖10%、甘油5%,室溫孵育1 h;P3:蔗糖20%和甘油10%,室溫孵育1 h;P4:分別按照30%、40%、50%、60%、70%的乙醇梯度水溶液順序進(jìn)行處理,各梯度均處理10 min;P5(CK):對(duì)照,不進(jìn)行預(yù)處理。P1~P4進(jìn)行預(yù)處理后棄去液體,得到預(yù)處理的樣品。

    1.2.3 包埋

    將樣品托放至樣品準(zhǔn)備臺(tái),-10℃預(yù)冷5 min,預(yù)冷后利用冷凍切片包埋劑進(jìn)行逐層包埋,直至樣品全部被包埋,在樣品臺(tái)上繼續(xù)冷凍直至包埋劑凝固。

    1.2.4 切片

    用冷凍切片機(jī)進(jìn)行切片。箱體和冷刀溫度設(shè)定為-20℃,將包埋好的樣品固定在樣品臺(tái)上,將樣品表面修飾平整后,設(shè)置6個(gè)分組(T1~T6)進(jìn)行切片。T1:切片厚度為4 μm;T2:切片厚度為6 μm;T3:切片厚度為8 μm;T4:切片厚度為 10 μm;T5:切片厚度為12 μm;T6:切片厚度為20 μm。

    1.2.5 制作顯微玻片

    切片完成后,用毛筆挑取切下來的材料放置于載玻片上,用ddH2O清洗2次,去除殘留的包埋劑,晾干得到干凈的載玻片。

    1.2.6 品紅染色試驗(yàn)

    向潔凈的載玻片上滴加品紅染液,將蓋玻片蓋于染色區(qū)域,在蓋玻片四周涂抹指甲油封片,將載玻片置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。

    1.2.7 熒光染色試驗(yàn)

    使用干凈的載玻片,在需染色區(qū)域滴加30 μL DAPI染色液,將蓋玻片蓋于染色區(qū)域,四周涂抹指甲油封片,冰盒內(nèi)靜置1 h。將載玻片置于熒光顯微鏡下,在激發(fā)波長(zhǎng)405nm、發(fā)射波長(zhǎng)488nm下進(jìn)行觀察。

    1.2.8 技術(shù)適配性驗(yàn)證

    采用改良后的冷凍切片技術(shù)分別對(duì)平菇子實(shí)體、香菇子實(shí)體和香菇菌絲體等材料進(jìn)行切片。在顯微鏡下觀察切片效果,驗(yàn)證該技術(shù)在食用菌領(lǐng)域的適配性,并優(yōu)化不同食用菌組織材料的最適切片厚度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 固定條件優(yōu)化結(jié)果

    各組樣品使用不同固定方法進(jìn)行固定,之后均添加海藻糖5%、甘油10%作為冷凍保護(hù)劑進(jìn)行相同預(yù)處理,統(tǒng)一設(shè)置切片厚度為12 μm。不同固定方式對(duì)切片的影響見圖1。

    圖1 不同固定方法下絲球小奧德蘑的冷凍切片F(xiàn)ig.1 Freezing microtome section of Oudemansiella apalosarca under different fixation methods

    如圖1所示,與固定后的樣品相比,對(duì)照組F5(CK)組織細(xì)胞破損嚴(yán)重,且擔(dān)子細(xì)胞輪廓不清晰,無法觀察到完整的細(xì)胞形態(tài)。經(jīng)過固定的樣品(F1~F4),細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)完整、清晰。與F1(戊二醛固定液固定)的樣品相比,F(xiàn)2(多聚甲醛固定液固定)的樣品有少部分組織仍易出現(xiàn)破損情況。F1固定20 min后,樣品的擔(dān)子細(xì)胞輪廓清晰且結(jié)構(gòu)完整,可滿足大部分光學(xué)染色和熒光染色需要。F3和F4切片結(jié)果顯示,菌褶組織固定時(shí)間超過1 440 min時(shí),組織可完全浸入固定液中,但都會(huì)對(duì)細(xì)胞組織造成嚴(yán)重破壞,影響組織的完整性。

    2.2 預(yù)處理?xiàng)l件優(yōu)化

    不同預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)切片的影響見圖2。

    如圖2所示,P5(CK)未經(jīng)預(yù)處理的組織細(xì)胞破碎,損傷嚴(yán)重。P4(酒精梯度脫水)的樣品,細(xì)胞內(nèi)失水嚴(yán)重,造成孢子大面積皺縮損傷。P3(蔗糖20%、甘油10%預(yù)處理)的樣品,其組織在一定程度上保持了完整性,但擔(dān)子細(xì)胞失水皺縮嚴(yán)重,細(xì)胞界限不清晰。P2(海藻糖10%、甘油5%預(yù)處理)的樣品,其擔(dān)子細(xì)胞界限清晰明顯,但海藻糖濃度過高仍會(huì)導(dǎo)致?lián)蛹?xì)胞失水皺縮。P1(海藻糖5%、甘油10%預(yù)處理)的樣品,其擔(dān)子細(xì)胞界限明顯清晰,無失水皺縮現(xiàn)象,便于顯微結(jié)構(gòu)觀察。

    圖2 不同預(yù)處理?xiàng)l件下絲球小奧德蘑的冷凍切片F(xiàn)ig.2 Freezing microtome section of Oudemansiella apalosarca under different pretreatment methods

    2.3 絲球小奧德蘑擔(dān)子觀察的最適切片厚度

    按照設(shè)定的不同切片厚度(T1~T6)進(jìn)行切片后,發(fā)現(xiàn)T1(切片厚度4 μm)和T2(切片厚度6 μm)的切片中部破損嚴(yán)重,有較大空隙,因此后續(xù)只對(duì)T3~T6的切片進(jìn)行品紅染色觀察,結(jié)果見圖3。

    圖3 不同厚度的絲球小奧德蘑冷凍切片F(xiàn)ig.3 Freezing microtome section of Oudemansiella apalosarca with different thicknesses

    如圖3所示,品紅染色后絲球小奧德蘑的擔(dān)子及菌絲輪廓更加清晰,便于觀察。對(duì)比觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn),T3~T5(切片厚度為 8 μm~12 μm)處理下觀察結(jié)果最為理想;切片厚度越薄,菌褶中心部菌絲組織越容易破碎;T6(切片厚度為20 μm)易出現(xiàn)多層擔(dān)子細(xì)胞現(xiàn)象。因此,觀察絲球小奧德蘑單個(gè)擔(dān)子細(xì)胞內(nèi)情況時(shí),最適切片厚度為8 μm;觀察整體菌褶組織情況時(shí),最適切片厚度為12 μm。

    2.4 熒光染色效果

    對(duì)絲球小奧德蘑冷凍切片進(jìn)行熒光染色,觀察結(jié)果見圖4。

    圖4 絲球小奧德蘑冷凍切片熒光染色Fig.4 Fluorescent staining of freezing microtome section of Oudemansiella apalosarca.

    如圖4所示,通過使用DAPI染色液進(jìn)行熒光染色,可清晰觀察到絲球小奧德蘑菌褶中完整的孢子、菌絲、擔(dān)子細(xì)胞組織結(jié)構(gòu),以及其中的細(xì)胞核,而且信噪比較高,表明該技術(shù)可以應(yīng)用于熒光染色核相分析。

    2.5 改良后冷凍切片技術(shù)在食用菌中適配性

    利用條件優(yōu)化的冷凍切片技術(shù),選取戊二醛為固定液,固定時(shí)間為20 min,添加海藻糖5%、甘油10%作為冷凍保護(hù)劑進(jìn)行預(yù)處理,對(duì)不同的食用菌品種及部位進(jìn)行切片,結(jié)果見圖5。

    如圖5所示,改良后的冷凍切片技術(shù)適用于平菇的子實(shí)體(圖5A)、香菇的子實(shí)體(圖5B)及菌絲體(圖5C)。由于不同種類的食用菌擔(dān)子大小及菌絲直徑存在差異,因此不同種類的食用菌最適切片厚度不同,其中成熟的平菇子實(shí)體菌褶中擔(dān)子觀察適宜切片厚度為6 μm~8 μm,可觀察到菌褶中菌絲和擔(dān)子完整形態(tài)結(jié)構(gòu)。成熟香菇子實(shí)體及次生菌絲體觀察的適宜切片厚度為4 μm~6 μm。

    3 討論與結(jié)論

    組織切片是從細(xì)胞生物學(xué)層面對(duì)食用菌子實(shí)體結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察研究的最為有效和直觀的方法之一[1]。常用的組織切片方法有徒手切片法、石蠟切片法和冷凍切片法等,其中徒手切片法對(duì)操作者的技術(shù)要求較高;石蠟切片法步驟多、耗時(shí)長(zhǎng),樣品組織結(jié)構(gòu)易受損[9]。冷凍切片法操作較簡(jiǎn)單、耗時(shí)短,可保持樣品原有的生活形態(tài),檢測(cè)結(jié)果較準(zhǔn)確,可用于原位雜交、組織化學(xué)和免疫定位等多種研究[12]。自1891年被確定為正式的診斷方法以來,冷凍切片成為臨床上幫助醫(yī)生確定疾病性質(zhì)的一種可靠手段,在疾病診斷中廣泛應(yīng)用[15]。近年來,冷凍切片技術(shù)被逐步應(yīng)用到植物研究中,多用于觀察植物器官結(jié)構(gòu),如高度木質(zhì)化材料、植物花器官、植物微管骨架以及植物組織化學(xué)方面[15]。謝佩松等[16]利用冰凍切片技術(shù),對(duì)草本植物水稻和麥冬的根、莖、葉進(jìn)行了冰凍切片,觀察其顯微結(jié)構(gòu)和木質(zhì)素的顯微化學(xué)定位,獲得了高質(zhì)量的圖片。朱登峰等[17]研究發(fā)現(xiàn),快速冷凍切片法處理的植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)保存較好,木質(zhì)素染色清晰,且操作方法簡(jiǎn)便、快速、有效。寧代鋒等[18]建立了一種直接包埋冷凍和適當(dāng)回溫相結(jié)合的方法,不僅可以制作出植物細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)保存完整的組織切片,而且避免了使用冰凍保護(hù)劑的弊端。

    目前對(duì)食用菌的切片觀察大多使用其他的切片法。萬佳寧等[11]運(yùn)用包埋切片法制備了草菇(Volvariella volvacea)子實(shí)體不同發(fā)育時(shí)期的菌褶切片,并運(yùn)用熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡清晰觀察到草菇擔(dān)子細(xì)胞中的核相以及在減數(shù)分裂中的變化等。王瑞娟等[9]運(yùn)用改良石蠟切片法制備了金針菇(Flammulina velutiper)子實(shí)體不同發(fā)育時(shí)期的切片,觀察其菌褶和菌柄的細(xì)胞結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)以檸檬烯為透明劑時(shí)金針菇子實(shí)體組織結(jié)構(gòu)清晰、完整、無皺縮。萬佳寧等[19]通過優(yōu)化石蠟切片方法對(duì)香菇子實(shí)體發(fā)育初期組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,結(jié)果表明Van-Clear為最適透明劑,以其制備的石蠟切片中香菇子實(shí)體各部分組織結(jié)構(gòu)清晰、完整、無皺縮變形。張鵬[8]通過石蠟制片法制片觀察木耳(Auricularia auricula)內(nèi)部結(jié)構(gòu)。酒連娣[20]運(yùn)用石蠟切片和徒手切片相結(jié)合的方法,對(duì)亞側(cè)耳(Panellus serotius)原基到成熟子實(shí)體各階段的材料進(jìn)行解剖研究。而使用冷凍切片技術(shù)對(duì)食用菌顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察的報(bào)道較少,分析其主要原因可能是食用菌組織,尤其是菌褶部分易碎且含水量高,常規(guī)的冷凍切片方法并不適用于食用菌組織切片。

    因此,此次針對(duì)食用菌的材料特點(diǎn)建立一種適用于食用菌擔(dān)子結(jié)構(gòu)觀察的冷凍切片技術(shù),經(jīng)驗(yàn)證可成功應(yīng)用于絲球小奧德蘑、平菇和香菇子實(shí)體。該冷凍切片技術(shù)條件為:選取戊二醛為固定液,固定20 min,添加海藻糖5%、甘油10%作為冷凍保護(hù)劑進(jìn)行預(yù)處理。切片厚度應(yīng)根據(jù)不同的食用菌品種稍加調(diào)整,絲球小奧德蘑子實(shí)體切片厚度的選擇范圍為8 μm~12 μm,平菇子實(shí)體切片厚度的選擇范圍為6 μm~8 μm,香菇子實(shí)體及菌絲體切片厚度的選擇范圍為4 μm~6 μm,此時(shí)有助于獲得質(zhì)量較高的組織切片。該技術(shù)具有無毒、快速、操作簡(jiǎn)便、切片厚度薄、可用于免疫研究等優(yōu)點(diǎn),可顯著提高食用菌組織切片的質(zhì)量,為食用菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察提供有力支持,為食用菌育種研究提供有效的方法保障。

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