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    一個靈芝新品種的選育與分子鑒定*

    2022-06-08 11:48:58叢倩倩唐麗娜李秀梅安秀榮
    中國食用菌 2022年5期
    關(guān)鍵詞:單核三萜親本

    叢倩倩,崔 曉,唐麗娜,李秀梅,安秀榮

    (泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,山東 泰安 271000)

    靈芝(Ganoderma lingzhi)屬真菌界(Fungi)擔(dān)子菌亞門(Basidiomycota)傘菌綱(Agaricomycetes)多孔菌目(Polyporales)靈芝科(Ganodermataceae)靈芝屬(Ganoderma),是一種名貴的藥用真菌,具有抗腫瘤、護(hù)肝、抗病毒、抑菌、抗氧化等多種藥效[1-5],被稱為“仙草”。

    近年來,隨著靈芝藥用功效被不斷發(fā)現(xiàn),人們對靈芝及其產(chǎn)品的需求量大幅增加,靈芝產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化發(fā)展迅速[6-7]。我國是靈芝出口大國,但栽培品種大多由國外引進(jìn)或野生菌株分離得到,具有自主知識產(chǎn)權(quán)的品種較少[8]。這不僅對我國靈芝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展構(gòu)成威脅,還會對其他國家的品種產(chǎn)生依賴性,同時也浪費了我國豐富的靈芝種質(zhì)資源。此外,大多育種的目標(biāo)更注重產(chǎn)量因素而忽視了功能性指標(biāo),導(dǎo)致有效成分含量高的品種較少,且菌種退化的現(xiàn)象比較嚴(yán)重,這些問題均制約了我國靈芝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[9]。因此,選育具有自主知識產(chǎn)權(quán)且有效成分含量高的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)新品種,提高品種的功能性,對滿足國民營養(yǎng)健康需求,加快推進(jìn)供給側(cè)結(jié)構(gòu)優(yōu)化和品種換代改良具有重大意義,是促進(jìn)我國靈芝產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要基礎(chǔ)。

    以國家認(rèn)定品種泰山赤靈芝1號(TL-1)和野生靈芝菌株4895作為親本,通過原生質(zhì)體單核化雜交育種技術(shù)開展靈芝新品種的選育工作,旨在為靈芝生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的新菌株,提升產(chǎn)品的市場競爭力。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    親本菌株TL-1、4895于泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所保藏。TL-1為國家認(rèn)定品種,子實體多糖含量較高,綜合農(nóng)藝性狀較好;4895由采自泰山的野生靈芝菌株馴化而來,其子實體三萜含量較高。

    1.2 親本原生質(zhì)體的制備與再生

    分別制備2個親本的原生質(zhì)體,用液體再生培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后涂布于固體再生培養(yǎng)基平板上,至長出再生菌落[10-11]。

    1.3 單核菌株的篩選及交配型測定

    從親本原生質(zhì)體再生平板上挑取菌落小、生長緩慢的單菌落,分別轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基中,待菌落長至3 cm~5 cm時,挑取邊緣菌絲鏡檢,無鎖狀聯(lián)合的即為單核菌株。隨機選取一株單核菌株作為標(biāo)準(zhǔn)菌株,將其他單核菌株分別與該標(biāo)準(zhǔn)菌株接種到同一個PDA培養(yǎng)基平板上進(jìn)行對峙培養(yǎng),當(dāng)2個菌株的菌絲相互接觸后,挑取交接處菌絲鏡檢。有鎖狀聯(lián)合則說明這2個單核菌株為不同的交配型;無鎖狀聯(lián)合則說明兩者不親和,為相同的交配型。

    1.4 雜交菌株的選育過程

    用直徑0.5 cm的金屬打孔器分別將具有不同交配型的2個單核菌株接種到同一個PDA培養(yǎng)基平板上,兩者相距2 cm,25℃恒溫箱對峙培養(yǎng)7 d;待菌絲相互接觸后,挑取交接處的菌絲鏡檢,有鎖狀聯(lián)合則說明雜交成功;將雜交成功組合進(jìn)行拮抗反應(yīng)驗證,共獲得雜交菌株5個。2018年,將5個雜交菌株分別進(jìn)行栽培比較試驗,發(fā)現(xiàn)編號為TL-3的雜交菌株菌蓋中等偏大且厚,形態(tài)較飽滿,產(chǎn)量、子實體有效成分含量均高于親本菌株TL-1。2019年至2021年,進(jìn)行了連續(xù)3年的栽培試驗,發(fā)現(xiàn)TL-3菌株遺傳穩(wěn)定性較好,綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良,具有較高的應(yīng)用推廣價值。

    1.5 優(yōu)良菌株的ISSR分子標(biāo)記鑒定

    分別提取親本菌株TL-1、4895和雜交菌株TL-3的菌絲體基因組DNA[12],參考NY/T 1730-2009食用菌菌種真實性鑒定ISSR法[13]中推薦的28條引物分別對供試菌株進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,根據(jù)擴(kuò)增條帶的穩(wěn)定性和多態(tài)性篩選出適合用于ISSR分析的引物。從篩選出的適宜引物中挑選擴(kuò)增效果較好的引物作為ISSR分子標(biāo)記驗證優(yōu)良雜交菌株的引物。

    1.6 優(yōu)良菌株的菌絲生長特征分析

    取大小約0.5 cm×0.5 cm的親本和雜交株的菌絲塊,分別接種于3個PDA平板培養(yǎng)基上,置于25℃恒溫箱中避光培養(yǎng)5 d;觀察親本和雜交株的菌落形態(tài),并測量菌絲的生長速度,每個處理3次重復(fù)。

    1.7 優(yōu)良菌株的綜合農(nóng)藝性狀分析

    發(fā)菌期,觀察和記錄親本和雜交菌株的栽培袋菌絲生長情況。子實體生長期,拍照記錄不同生長時期的子實體形態(tài)特征。待菌蓋邊緣白色生長點消失,菌蓋背面開始彈射霧狀紅褐色孢子時,開始采收。采收后,親本和雜交菌株各取30個靈芝子實體,分別測量菌蓋長直徑、菌蓋厚度、菌柄長度;將子實體曬干,統(tǒng)計產(chǎn)量并計算生物學(xué)效率,生物學(xué)效率為子實體干重(g)與培養(yǎng)料干重(g)之比乘以100%,每個處理3次重復(fù)。

    1.8 優(yōu)良菌株的有效成分含量檢測

    各取10個曬干的靈芝子實體,分別檢測親本和雜交株子實體中多糖和三萜的含量[14-15],每個處理3次重復(fù)。

    1.9 數(shù)據(jù)分析

    采用DPS軟件對以上數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 親本原生質(zhì)體的制備與再生

    親本菌絲體通過溶壁酶降解除去細(xì)胞壁后,離心收集原生質(zhì)體,并在顯微鏡下分別拍照記錄原生質(zhì)體的形態(tài),見圖1。

    圖1 親本菌株TL-1及4895的原生質(zhì)體Fig.1 Protoplasts of parental strains TL-1 and 4895

    2.2 單核菌株的篩選及交配型測定

    通過鏡檢親本原生質(zhì)體再生菌落中鎖狀聯(lián)合的有無,可以篩選到2種交配型的單核菌株。篩選獲得TL-1單核菌株共21個,其中2種不同交配型單核體的比例為16∶5;篩選獲得4895單核菌株23個,其中僅獲得1種交配型單核體。

    2.3 優(yōu)良雜交菌株的鑒定

    對菌株進(jìn)行拮抗試驗,結(jié)果見圖2。

    圖2 親本菌株TL-1、4895及雜交株TL-3的拮抗現(xiàn)象Fig.2 Antagonism of parental strains TL-1,4895 and hybrid strain TL-3

    如圖2所示,雜交菌株TL-3與親本菌株TL-1、4895之間均存在明顯的拮抗現(xiàn)象,證明TL-3為真正的雜交株。

    菌株TL-1、4895和TL-3的ISSR擴(kuò)增圖譜見圖3。

    圖3 親本菌株TL-1、4895及雜交株TL-3的ISSR擴(kuò)增圖譜Fig.3 ISSR amplification map of parental strains TL-1,4895 and hybrid strain TL-3

    如圖3所示,ISSR分子標(biāo)記驗證中,引物P4、P9對雜交株和親本菌株的擴(kuò)增效果較好,親本菌株與雜交株間的特異性條帶較明顯。雜交株TL-3擴(kuò)增條帶中同時包含了親本菌株TL-1和4895的特異性條帶,從而在分子水平上進(jìn)一步證明了TL-3雜交株的真實性。

    2.4 優(yōu)良菌株的菌絲生長特性分析

    對親本菌株TL-1、4895及雜交株TL-3進(jìn)行培養(yǎng),其菌落形態(tài)見圖4,菌絲生長情況見表1。

    由圖4和表1可知,雜交菌株TL-3菌絲潔白,呈絨毛狀,濃密,長勢強壯。TL-3平板培養(yǎng)的菌絲生長速度介于2個親本之間,為0.74 cm·d-1,快于親本菌株4895,慢于親本菌株TL-1,與2個親本菌株相比差異極顯著(P<0.01)。

    表1 親本菌株TL-1、4895及雜交株TL-3的菌絲生長情況比較Tab.1 Comparison of mycelial growth between parental strains TL-1,4895 and hybrid strain TL-3

    圖4 親本菌株TL-1、4895及雜交株TL-3的菌落形態(tài)Fig.4 Mycelial morphology of parental strains TL-1,4895 and hybrid strain TL-3

    2.5 優(yōu)良菌株的綜合農(nóng)藝性狀分析

    統(tǒng)計親本菌株TL-1、4895及雜交株TL-3的農(nóng)藝性狀,結(jié)果見表2。

    由表2可知,TL-3栽培袋中菌絲的發(fā)菌速度為0.62 cm·d-1,介于2個親本之間;菌絲長勢強壯、濃密,發(fā)菌情況與雙親相比均無顯著性差異。菌蓋中等偏大,平均長直徑為10.33 cm,小于2個親本菌株,與親本TL-1之間有顯著性差異(P<0.05),與4895之間無顯著性差異。TL-3菌蓋厚度為2.79 cm,比雙親的菌蓋厚,與TL-1之間差異極顯著(P<0.01),與4895之間無顯著性差異。TL-3菌柄長度為2.06 cm,短于雙親,但無顯著性差異。TL-3平均單產(chǎn)和生物學(xué)效率比2個親本菌株高,與親本TL-1之間有顯著性差異(P<0.05),與4895之間無顯著性差異。

    表2 親本菌株TL-1、4895及雜交株TL-3的農(nóng)藝性狀比較Tab.2 Comparison of agronomic characters between parental strains TL-1,4895 and hybrid strain TL-3

    對比親本菌株TL-1、4895及雜交株TL-3不同生長時期的子實體形態(tài),結(jié)果見圖5(左側(cè)圖為正面,右側(cè)圖為背面)。

    圖5 親本菌株TL-1、4895及雜交株TL-3不同生長時期的子實體正反面形態(tài)Fig.5 Positive and negative morphology of fruit bodies of parental strains TL-1,4895 and hybrid strain TL-3 at different growth stages

    如圖5所示,TL-3子實體腎圓形,正面黃褐色到紅褐色,有光澤,表面有明顯的放射性縱脊和同心環(huán)紋,反面黃色,菌蓋邊緣較圓鈍;菌肉淡褐色;菌柄扁圓柱狀,光滑且亮,紅褐色至紫褐色。

    2.6 優(yōu)良菌株的有效成分含量檢測

    檢測親本菌株TL-1、4895及雜交株TL-3的多糖、三萜含量,結(jié)果見表3。

    表3 親本菌株TL-1、4895及雜交株TL-3子實體有效成分含量比較Tab.3 Comparison of effective components in fruit bodies of parental strains TL-1,4895 and hybrid strain TL-3

    由表3可知,雜交菌株TL-3子實體多糖含量為1.09%,均高于親本,比TL-1提高1.87%,比4895提高29.76%,與親本TL-1之間無顯著性差異,與親本4895之間有極顯著差異(P<0.01)。子實體三萜含量為0.22%,介于2個親本之間,比親本菌株TL-1提高37.5%,與2個親本之間均有極顯著性差異(P<0.01)。

    2.7 優(yōu)良菌株的遺傳穩(wěn)定性分析

    將雜交株TL-3進(jìn)行連續(xù)3年的栽培試驗,并記錄每年的栽培農(nóng)藝性狀,統(tǒng)計結(jié)果見表4。

    表4 雜交株TL-3的遺傳穩(wěn)定性分析Tab.4 Genetic stability analysis of hybrid strain TL-3

    由表4可知,雜交株TL-3菌絲生長速度為0.60 cm·d-1~0.65 cm·d-1,平均單產(chǎn)為 40.5 g/袋~43.7 g/袋,生物學(xué)效率>6%,子實體中多糖和三萜的含量分別為1.07%~1.13%和0.21%~0.27%。每年的栽培農(nóng)藝性狀之間及與初代之間在平均生長速度、平均單產(chǎn)、生物學(xué)效率、子實體多糖及三萜含量等方面基本一致,說明雜交菌株TL-3遺傳穩(wěn)定性較好。

    3 討論

    親本TL-1為國家認(rèn)定品種,其綜合農(nóng)藝性狀較好,子實體多糖含量較高,但三萜含量較低;且TL-1作為主栽品種之一,經(jīng)過連續(xù)多年的栽培,菌種退化現(xiàn)象比較嚴(yán)重。親本4895子實體片厚且三萜含量較高,但產(chǎn)量低。經(jīng)原生質(zhì)體單核化雜交選育的新品種TL-3較好地遺傳了雙親的優(yōu)良性狀,其出芝整齊、片厚、產(chǎn)量高、子實體多糖和三萜含量均較高,綜合農(nóng)藝性狀和功能性指標(biāo)均優(yōu)于國家認(rèn)定品種TL-1,具有較高的推廣應(yīng)用價值。此外,新品種的選育還有效解決了菌種退化問題,為生產(chǎn)企業(yè)替換老化、退化的品種提供了備選種質(zhì)資源,進(jìn)一步滿足了市場需求。

    通過分別提取親本和新品種的基因組DNA,利用ISSR法,從28條引物中篩選出2條擴(kuò)增效果較好的引物作為ISSR分子標(biāo)記驗證雜交菌株的引物。進(jìn)一步從分子水平上證明了新品種的真實性,為將來申報新品種權(quán)提供了依據(jù)。

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