腺病毒P53抑制SDF-1/CXCR4信號(hào)軸增強(qiáng)裸鼠胰腺癌移植瘤放療敏感性

吳灶璇 王桂良 徐林芳 邱萍 李興 文劍波 龔敏

[摘要] 目的 研究重組人腺病毒P53（rHAd-P53）抑制基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）/C-X-C基序趨化因子受體4（CXCR4）信號(hào)軸增強(qiáng)裸鼠胰腺癌移植瘤放療敏感性的效果。 方法 選用人胰腺癌細(xì)胞構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，按隨機(jī)數(shù)字表法將48只裸鼠分為空白組、125I粒子治療組、rHAd-P53治療組及rHAd-P53+125I粒子治療組。測量治療前后移植瘤體積、瘤重、凋亡指數(shù)、SDF-1和CXCR4表達(dá)。 結(jié)果 與空白組比較，rHAd-P53治療組的體積增量比、瘤重、增殖指數(shù)、SDF-1mRNA和蛋白、CXCR4 mRNA和蛋白均顯著性降低，而凋亡指數(shù)顯著性升高，125I粒子治療組或rHAd-P53+125I粒子治療組的體積增量比、瘤重、增殖指數(shù)均顯著性降低，而抑瘤率、凋亡指數(shù)、SDF-1 mRNA和蛋白、CXCR4 mRNA和蛋白均顯著性升高;rHAd-P53+125I粒子治療組的體積增量比、瘤重、增殖指數(shù)、SDF-1 mRNA和蛋白、CXCR4 mRNA和蛋白降低最多，而抑瘤率和凋亡指數(shù)升高最多。 結(jié)論 rHAd-P53和125I粒子均能誘導(dǎo)裸鼠胰腺癌移植瘤凋亡，rHAd-P53能抑制SDF-1和CXCR4的表達(dá)而增強(qiáng)125I粒子放療敏感性。

[關(guān)鍵詞] 胰腺癌;125I粒子;腺病毒P53;SDF-1;CXCR4

[中圖分類號(hào)] R735.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2022）10-0016-04

[Abstract] Objective To study the effect of recombinant human adenovirus-P53 （rHAd-P53） on inhibiting the signal axis of stromal cell derived factor -1（SDF-1）/C-X-C motif chemokine receptor 4（CXCR4） and enhancing the radiosensitivity of nude mice with pancreatic xenograft tumors. Methods The transplanted tumor model of nude mice was established by using human pancreatic cancer cells， and 48 nude mice were randomly divided into the blank group， rHAd-P53 group， iodine 125 particle group and rHAd-P53+ iodine 125 particle group. The volume and weight of transplanted tumors， apoptosis index， SDF-1 and CXCR4 expression were measured before and after treatment. Results Compared with the blank group， the incremental ratio of volume， tumor weight，proliferation index， SDF-1mRNA and protein， CXCR4mRNA and protein in rHAd-P53 group were significantly decreased， while the apoptosis index was significantly increased. The incremental ratio of volume， tumor weight and proliferation index in iodine 125 particle group or rHAd-P53+ iodine 125 particle group were significantly decreased， while the tumor inhibition rate， apoptosis index and SDF-1mRNA and protein， CXCR4 mRNA and protein of rHAd-P53+ iodine 125 particle group were significantly increased. The incremental ratio of volume， tumor weight， proliferation index， SDF-1 mRNA and protein， CXCR4 mRNA and protein of rHAd-P53+iodine 125 particle group decreased the most， while the tumor inhibition rate and apoptosis index increased the most. Conclusion rHAd-P53 and iodine 125 particle can induce apoptosis of pancreatic xenograft tumors in nude mice. rHAd-P53 can inhibit the expressions of SDF-1 and CXCR4 and enhance the sensitivity of iodine 125 particle radiotherapy.

[Key words] Pancreatic cancer; Iodine 125 particle; Adenovirus P53; SDF-1; CXCR47446B079-CD28-4F0C-9935-95246411BD8B

胰腺癌是惡性程度極高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，預(yù)后差，整體5年生存率僅為6%[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)生長因子在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，SDF-1是胰腺癌微環(huán)境中一種重要的趨化因子，可激活多條下游信號(hào)傳導(dǎo)通路，參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展演變進(jìn)程，調(diào)控造血干細(xì)胞遷移及歸巢、腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[2]。125I粒子局部放療能有效治療胰腺癌[3]，rHAd-P53能有效調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡、抑制放療抵抗相關(guān)基因，從而提高放療的敏感性[3]。本研究應(yīng)用rHAd-P53和125I粒子治療裸鼠胰腺癌移植瘤，以觀察rHAd-P53和125I粒子單獨(dú)作用及聯(lián)合作用的效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)得到南方醫(yī)科大學(xué)附屬萍鄉(xiāng)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，符合國家有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)規(guī)范和管理?xiàng)l例。本研究時(shí)間為2019年12月至2020年12月，BALB/c-nu裸鼠（5～6周齡，體重18～22 g）購自江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物部[許可證號(hào)SYXK（贛）2008-2006）]，rHAd-P53（1×1012VP/支）購自深圳賽百諾公司，SDF-1蛋白一抗和CXCR4蛋白一抗、GAPDH蛋白一抗從美國Abcam公司購買，125I粒子（粒子活度為0.6 mCi）購自原子高科股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 裸鼠胰腺癌模型制備及治療方案? 取對(duì)數(shù)生長的人胰腺癌PANC-1細(xì)胞（美國ATCC公司）6×107/ml細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，取0.1 ml接種于裸鼠右腋下，制備皮下移植瘤模型。當(dāng)瘤體直徑達(dá)10～15 mm左右時(shí)開始實(shí)驗(yàn)，將裸鼠隨機(jī)分為空白組、rHAd-P53治療組、125I粒子治療組及;rHAd-P53+125I粒子治療組，每組各12只?？瞻捉M：裸鼠胰腺癌移植瘤內(nèi)注射0.9%氯化鈉注射液0.1 ml，隔天注射1次，共注射6 d。rHAd-P53治療組：給裸鼠胰腺癌移植瘤內(nèi)注射rHAd-P53 1×1010VP，隔天1次，共6 d。125I粒子治療組：18 G穿刺針在距腫瘤邊緣10 mm處穿破皮膚，將一粒125I粒子（0.6 mCi）置入穿刺針，改用圓頭針芯后將125I粒子推入腫瘤組織內(nèi)。rHAd-P53+125I粒子治療組：用穿刺針將1顆125I粒子置入瘤體中央，繼之給裸鼠瘤內(nèi)注射rHAd-P53 1×1010VP，隔天1次，共6 d。

1.2.2 腫瘤體積計(jì)算? 體積計(jì)算公式：體積=0.52×長徑×短徑×短徑;抑瘤率（inhibitory rate，IR）=[（空白組瘤體重-治療組瘤體重）/空白組瘤體重]×100%。體積增量比=[（治療后體積-治療前體積）/治療前體積]×100%。

1.2.3 細(xì)胞增殖和凋亡情況觀察? 采用免疫組織化學(xué)方法檢測Ki-67蛋白的表達(dá)，用以計(jì)算腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù); 每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（400×），分別計(jì)算腫瘤細(xì)胞總數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù)，從而得出增殖指數(shù)（proliferation index，PI）。PI%=[陽性細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù)]×100%。TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡，得出凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI），AI%=[凋亡細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù)]×100%。

1.2.4 Real-time PCP檢測SDF-1和CXCR4的表達(dá)? 設(shè)計(jì)基因引物序列（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以β-actin為內(nèi)對(duì)照，配制20 μl的多聚酶鏈反應(yīng)體系：加入上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl SYBR Enzyme 10 μl，cDNA 1 μl，無酶水8 μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 10 min，95℃變性30 s，60℃延伸 1 min，共40 個(gè)循環(huán)。計(jì)算SDF-1和CXCR4的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 Western blot免疫印跡法檢測SDF-1蛋白和CXCR4蛋白的表達(dá)情況? 提取組織總蛋白，以10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺膠電泳1 h，使用轉(zhuǎn)移電泳裝置，在 4℃、300 mA恒流條件下電轉(zhuǎn) 150 min，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用含5%脫脂牛奶的TBST 溶液室溫封閉1 h，加入一抗（兔抗SDF-1抗體或兔抗CXCR4抗體），4℃孵育過夜;TBST洗膜3次，每次10 min，加入熒光二抗，室溫避光孵育1 h，洗膜后滴加適量混勻的超靈敏化學(xué)發(fā)光（enhanced chemi luminescence，ECL）液，放置在化學(xué)顯色儀中進(jìn)行曝光顯像。使用Image J軟件分析計(jì)算各條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)對(duì)照GAPDH蛋白條帶的比值分析目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布且方差齊，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD法和SNK法。計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，兩組間或多組間比較均采用χ2檢驗(yàn)（Chi-Squared test），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組裸鼠移植瘤生長速度比較

四組裸鼠移植瘤體積生長速度趨勢為：空白組>rHAd-P53治療組> 125I粒子治療組>rHAd-P53+125I粒子治療組。見圖1。

2.2 四組裸鼠移植瘤體積增量比和抑瘤率比較

對(duì)治療后第30天體積增量比分析，空白組（6.7±0.3）>rHAd-P53治療組（3.8±0.2）>125I粒子治療組（2.0±0.2）>rHAd-P53+125I粒子治療組（0.9±0.1）;空白組、rHAd-P53治療組、125I粒子治療組、rHAd-P53+ 125I粒子治療組瘤重分別為（2.6±0.2）g、（2.0±0.1）g、（1.4±0.1）g、（0.8±0.1）g;抑瘤率分析，rHAd-P53治療組（21.2%）<125I粒子治療組（46.8%）

2.3 HE染色檢測胰腺癌細(xì)胞凋亡

空白組凋亡不明顯、rHAd-P53治療組和125I粒子治療組及rHAd-P53+125I粒子治療組凋亡細(xì)胞增多。凋亡細(xì)胞分析，rHAd-P53治療組或125I粒子治療組或rHAd-P53+125I粒子治療組較空白組顯著性增多，rHAd-P53+125I粒子治療組較125I粒子治療組增多。見封三圖1。

2.4 四組裸鼠治療后增殖指數(shù)與凋亡指數(shù)情況比較

對(duì)治療后增殖指數(shù)比較，rHAd-P53治療組或125I粒子治療組或rHAd-P53+125I粒子治療組較空白組顯著性降低，rHAd-P53+125I粒子治療組最低;治療后凋亡指數(shù)比較，rHAd-P53治療組或125I粒子治療組或rHAd-P53+125I粒子治療組較空白組顯著性增加，rHAd-P53+125I粒子治療組最高。見封三圖2。

2.5 四組裸鼠腫瘤組織中SDF-1mRNA和蛋白表達(dá)量比較

對(duì)SDF-1 mRNA和蛋白表達(dá)量分析，rHAd-P53治療組較空白組顯著性降低，125I粒子治療組或rHAd-P53+125I粒子治療組較空白組顯著性升高，125I粒子治療組或rHAd-P53+125I粒子治療組較rHAd-P53治療組顯著性升高，rHAd-P53+125I粒子治療組較125I粒子治療組顯著性降低。見圖2。

2.6 四組裸鼠腫瘤組織中CXCR4 mRNA和蛋白表達(dá)量比較

對(duì)CXCR4 mRNA和蛋白表達(dá)量分析，rHAd-P53治療組較空白組顯著性降低，125I粒子治療組或rHAd-P53+125I粒子治療組較空白組顯著性升高，125I粒子治療組或rHAd-P53+125I粒子治療組較rHAd-P53組顯著性升高，rHAd-P53+125I粒子治療組較125I粒子治療組顯著性降低。見圖3。

3 討論

胰腺癌惡性程度高、手術(shù)機(jī)會(huì)少，化療和體外放療的療效均不理想[5]。碘125粒子能釋放γ射線、破壞DNA雙鏈結(jié)構(gòu)從而殺滅或抑制腫瘤細(xì)胞生長[6]。SDF-1與其受體CXCR4結(jié)合形成SDF-1/CXCR4軸，參與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲、血管生成等過程[7]。rHAd-P53是一種抑癌基因，與放療聯(lián)用后能增強(qiáng)放療的敏感性[8-12]。

本研究中，采用裸鼠胰腺癌移植瘤模型作為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)與空白組比較，rHAd-P53組的體積增量比、瘤重、增殖指數(shù)、SDF-1 mRNA和蛋白、CXCR4 mRNA和蛋白均顯著性降低，而凋亡指數(shù)顯著性升高，125I粒子治療組或rHAd-P53+125I粒子治療組的體積增量比、瘤重、增殖指數(shù)均顯著性降低，而抑瘤率、凋亡指數(shù)、SDF-1 mRNA和蛋白、CXCR4 mRNA和蛋白均顯著性升高[13-15];與rHAd-P53治療組比較，125I粒子治療組或rHAd-P53+125I粒子治療組的體積增量比、瘤重、增殖指數(shù)均顯著性降低，而抑瘤率、凋亡指數(shù)、SDF-1 mRNA和蛋白、CXCR4 mRNA和蛋白顯著性升高;與125I粒子治療組比較，rHAd-P53+125I粒子治療組的體積增量比、瘤重、增殖指數(shù)、SDF-1 mRNA和蛋白、CXCR4 mRNA和蛋白均顯著性降低，而抑瘤率和凋亡指數(shù)顯著性升高，說明125I粒子和rHAd-P53均能促進(jìn)裸鼠胰腺癌移植瘤癌細(xì)胞凋亡，125I粒子+rHAd-P53聯(lián)用后，效果增加[16-18]。由于125I粒子可引起腫瘤細(xì)胞死亡以及腫瘤微環(huán)境的炎癥，在發(fā)揮癌細(xì)胞殺傷作用的過程中，細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路被激活、抗凋亡蛋白反饋性表達(dá)升高，導(dǎo)致放療抵抗，其中SDF-1是一個(gè)典型的促增殖和抗凋亡蛋白，能與受體CXCR4結(jié)合激活下游信號(hào)通路，導(dǎo)致一系列效應(yīng)蛋白發(fā)揮促增殖和抗凋亡作用，本研究證明rHAd-P53能抑制SDF-1和CXCR4的表達(dá)而增強(qiáng)125I粒子放療的敏感性。

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（收稿日期：2021-04-08）7446B079-CD28-4F0C-9935-95246411BD8B