土人參對鉛脅迫的生理響應(yīng)

董倩，李嫻

（福建技術(shù)師范學(xué)院a.近海流域環(huán)境測控治理福建省高校重點實驗室；b.食品與生物工程學(xué)院，福建福清 350300）

鉛（Pb）在自然界土壤和巖石中廣泛分布，土壤中鉛含量平均值在15～25 mg/kg 之間[1]，而我國土壤鉛背景值則接近或高于世界平均值上限.隨著我國工業(yè)化和城市化進(jìn)一步加快，使鉛不斷沉積到土壤中，工礦廢棄物、農(nóng)藥化肥、車輛含鉛尾氣以及有害生活垃圾（如廢棄電池、含鉛涂料）是城鄉(xiāng)鉛污染的主要源頭[2]，導(dǎo)致我國土壤質(zhì)量惡化更加嚴(yán)重.對人類而言，鉛是一種有害的重金屬元素[3]，可通過食物鏈進(jìn)入人體，影響新陳代謝、生長發(fā)育和身體健康[4].目前，植物修復(fù)技術(shù)在土壤重金屬污染治理中應(yīng)用最廣，具有綠色高效、低成本，不會破壞土壤環(huán)境和造成二次污染的優(yōu)點[5].土壤中重金屬脅迫下,植物體內(nèi)活性氧的增加，導(dǎo)致DNA、脂類、蛋白質(zhì)等過氧化，從而造成細(xì)胞損傷，生理代謝紊亂[6]，一般植物難以正常生長；鉛耐受植物則會通過提高抗氧化酶類活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量來提高自身抗性[7]，通過根部吸收和特定組織區(qū)域富集，以降低鉛活性來降低鉛的危害[8].因此，治理土壤鉛污染的重點和關(guān)鍵是篩選和種植鉛耐受植物[9]，尤其是篩選適宜的耐鉛園林觀賞植物，達(dá)到治理與美化環(huán)境的雙贏效果.因此，篩選對鉛脅迫環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng)的耐鉛園林觀賞植物，對環(huán)境修復(fù)和園林綠化都具有重要意義.

土人參為馬齒莧科土人參屬，多年生宿根草本植物，株高30 ～70 cm，葉片翠綠油亮，圓錐花序頂生或腋生，具長花序梗，花小而多，粉紅色或淡紫紅色，紅色蒴果近球形，似紅色的“小豆點”，整體看非常漂亮，花果期較長，園藝欣賞價值高.現(xiàn)廣泛分布于我國中、東部和西南部地區(qū)，具有耐熱、耐旱、耐貧瘠、病蟲害少、生長快和易栽培等特點.以往國內(nèi)外學(xué)者主要對其生物學(xué)特性[10]、栽培技術(shù)[11-12]、成分藥性和藥理展開研究[13-16].近期研究也主要集中在生理生化[17-18]、組織培養(yǎng)[19-20]和營養(yǎng)成分提取分析[21-23]等方面，但在其抗性生理尤其是在重金屬脅迫和耐受性方面的研究很少.僅仰路希[24]發(fā)現(xiàn)土人參對鎘有一定的累積能力，生理上表現(xiàn)“低促高抑”的現(xiàn)象，而土人參對鉛離子脅迫以及耐受性方面的研究還未見報道.探究鉛離子脅迫對土人參生理生化指標(biāo)的影響，確定土人參對鉛的耐受性，為其是否適于種植在鉛污染地區(qū)提供理論支撐.

1 材料與方法

1.1 供試材料準(zhǔn)備

稱取土人參種子（4℃干燥保存）約1 g，陽光晾曬2 h，摻入20 倍體積干細(xì)沙，拌勻后撒播于育苗盤面上（8 cm 厚濕潤育苗營養(yǎng)土），蓋1～2 mm 薄層細(xì)沙，蓋薄膜保濕，置于25℃的培養(yǎng)箱中兩周后出苗，揭膜后移至人工氣候室中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度26℃，14 h/10 h光暗周期，光照度為2000 Lx，室內(nèi)空氣濕度60%.待小苗長至高度3～4 cm（3 片真葉）時，挑選健壯苗移栽到21 孔穴的育苗穴盤中，繼續(xù)培養(yǎng)至苗高10 cm，再次移栽定植到裝有營養(yǎng)土的花盆（規(guī)格為1 L），室內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2個月后，挑選長勢一致的植株開展鉛脅迫盆栽實驗，培養(yǎng)條件不變.脅迫所用鉛供體為無水Pb(CH3CO2)2（國藥集團(tuán)），用去離子水分別配制各濃度鉛脅迫處理液.

1.2 鉛脅迫時間對土人參的影響

處理前3 d 停止給土人參苗澆水，處理時每盆緩慢澆入1.5 mmol/L 乙酸鉛溶液500 mL，對照組則用去離子水500 mL 澆灌.脅迫每兩天處理一組，每組5 盆；按處理的先后排序，分別為鉛脅迫10 d、8 d、6 d、4 d、2 d、0 d（對照），共設(shè)6 組，脅迫試驗進(jìn)行10 d，第11 天取樣測定各項生理指標(biāo)；脅迫期間只定量定時補(bǔ)充去離子水，不施肥.

1.3 鉛脅迫濃度對土人參的影響

處理前3 d 停止給土人參苗澆水，處理時每盆緩慢澆入相應(yīng)濃度的乙酸鉛溶液500 mL，對照組則用去離子水500 mL 澆灌.設(shè)置鉛脅迫濃度分別為0（對照）、0.8、1.5、2.3、3.1、3.8、4.6 mmol/L，共7 組處理，每組處理5 盆.脅迫期間只定量定時補(bǔ)充去離子水，不施肥.脅迫10 d 后取樣測定各項生理指標(biāo).

1.4 生理生化指標(biāo)測定

選擇土人參+3、+4 葉（生長點下數(shù)第3、4 片成熟葉）測定生理生化指標(biāo).用分光光度法測定葉綠素含量[25]，愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶(POD)酶活力和硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）含量[26].

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用 Excel 2013 和 SPSS 20.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Duncan's 進(jìn)行多重比較(α=0.05).

2 結(jié)果與分析

2.1 鉛脅迫時間對土人參的影響

2.1.1 鉛脅迫時間對土人參葉綠素含量的影響由表1 可知，用1.5 mmol/L 濃度的鉛脅迫0 ～10 d，土人參的葉綠素總含量變化幅度較小，最大變幅僅為9.43%，變化不顯著.葉綠素a（Chl a）含量呈先下降后上升的趨勢；葉綠素b（Chl b）則反之，呈先增后減的趨勢；Chl a / Chl b 比值在脅迫4 d 內(nèi)下降，6 d 后上升至對照水平，8 d 后再次下降，10 d 后又少量上升，差異顯著，未呈現(xiàn)單一的上升或下降趨勢.脅迫2～4 d，Chl a / Chl b 比值顯著下降，是由于Chl a 和Chl b 含量較對照發(fā)生顯著變化，Chl a 含量下降，Chl b 含量上升，Chl a /Chl b 比值達(dá)最?。?.69～0.89），表明土人參能對鉛脅迫做出快速響應(yīng)，Chl a / Chl b 比值對鉛脅迫比較敏感.任安芝等[27]認(rèn)為，因為重金屬首先破壞Chl a 的緣故，Chl a / Chl b 比值可作為衡量植物對重金屬脅迫相對變化敏感的一個生理指標(biāo).鉛脅迫后土人參Chl a / Chl b比值雖然發(fā)生較大的波動，但葉綠素總含量的變化卻不顯著，可能是該濃度的鉛脅迫對土人參并未造成很大的傷害，脅迫造成Chl a 水解和氧化，并沒有完全破壞降解，而是通過葉綠素循環(huán)又轉(zhuǎn)化為Chl b 和Chl a，使得Chl a 和Chl b 發(fā)生相互轉(zhuǎn)化[28]，Chl a / Chl b 比值出現(xiàn)波動變化.

表1 鉛脅迫時間對土人參葉綠素含量的影響

2.1.2 鉛脅迫時間對土人參POD 活性的影響

POD 活性在鉛脅迫的前4 d 相差不大，第6 天開始顯著上升，于第10 天達(dá)到最大值（22.6 U/g），為對照組（7.2 U/g）的3 倍，變化差異顯著（圖1）.結(jié)果表明鉛脅迫4 d后土人參的應(yīng)激響應(yīng)迅速，POD 活性快速提高，開啟抗氧化防御機(jī)制.POD 活性的維持和提高是植物耐受重金屬脅迫的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，有利于消除體內(nèi)活性氧，防止細(xì)胞膜受損.鉛脅迫6 d 后，由于POD 活性的提高，Chl a 轉(zhuǎn)化合成加快，Chl a / Chl b 比值又恢復(fù)到接近脅迫前的水平.

圖1 鉛脅迫時間對土人參POD 酶活性的影響

2.1.3 鉛脅迫時間對土人參MDA 含量的影響

MDA 是膜脂過氧化的產(chǎn)物[29].植物體內(nèi)MDA 的含量是衡量膜脂質(zhì)過氧化損傷的重要指標(biāo)，也是衡量植物對外界逆境抵御能力強(qiáng)弱的指標(biāo).鉛脅迫對植物體內(nèi)MDA 含量的影響在植物中的反應(yīng)較為相似[30-31]，但不同植物對鉛脅迫有不同的耐受性.

隨著鉛脅迫時間的延長，土人參葉片中MDA 含量呈先下降后緩慢上升的趨勢，10 d后顯著增加到最大值43.5 nmol/g（圖2）.結(jié)果表明鉛脅迫10 d 內(nèi)土人參膜脂發(fā)生過氧化，但過程比較緩慢.根據(jù)鉛脅迫期間的觀察，土人參生長良好，初步推斷其對鉛脅迫具有更大的耐受性.比較圖1 和圖2 發(fā)現(xiàn)，MDA 與POD 對鉛脅迫的響應(yīng)變化趨勢相似，前4 d 變化較小，土人參可以通過自身的光合生理調(diào)節(jié)適應(yīng)短期的鉛脅迫，表現(xiàn)出對鉛脅迫具有較好的耐受力；而后隨著脅迫時間的延長，土人參能較快的通過上調(diào)抗氧化酶活性升級保護(hù)防御機(jī)制，延緩膜脂過氧化進(jìn)程.綜上分析表明，土人參對鉛脅迫的應(yīng)激響應(yīng)較為快速，生長良好，對鉛脅迫具有更大的耐受性.

圖2 鉛脅迫時間對土人參MDA 的影響

2.2 鉛脅迫濃度對土人參的影響

2.2.1 鉛脅迫濃度對土人參葉綠素的影響

土人參在不同濃度鉛脅迫10 d 后，隨脅迫濃度的升高，葉綠素總含量均低于對照，總體呈下降態(tài)勢（表2）. 脅迫濃度為0～3.8 mmol/L 之間時變化不顯著；4.6 mmol/L 時，葉綠素總含量顯著降低（0.5 mg/g），較對照降低了26.5%（表2）. Chl a 含量的變化趨勢與葉綠素總含量的變化趨勢相同；Chl b 的變化較對照顯著降低；但Chl a/Chl b 比值整體保持相對穩(wěn)定，沒有因脅迫濃度的提高而發(fā)生顯著變化.由此可見，土人參能耐受0 ～3.8 mmol/L濃度的鉛脅迫，對該脅迫濃度不敏感，葉綠素含量基本不受影響.

表2 鉛脅迫濃度對土人參葉綠素含量的影響

2.2.2 鉛脅迫濃度對土人參POD 活性的影響

隨鉛脅迫濃度的升高，土人參POD 酶活性呈先升后降的趨勢（圖3）.低濃度脅迫（0.8 mmol/L）對土人參的POD 活性影響不顯著；中高濃度脅迫（1.5～4.6 mmol/L）使POD 活性較對照顯著上升，而此濃度區(qū)間內(nèi)POD 活性變化不顯著，脅迫濃度為2.3 mmol/L 時POD酶活最高，約為對照的2 倍，而后緩慢下降；高濃度鉛脅迫（4.6 mmol/L）時的酶活依然較高，是對照的2 倍.

圖3 不同濃度鉛脅迫對土人參POD 活性的影響

POD 活性是對鉛毒害相對敏感的指標(biāo)，一定濃度的鉛脅迫會提高其活性，這也是所有植物對各種脅迫的共同響應(yīng)特征，其活性的增加能提高植物抗氧化能力，與植物耐受性直接相關(guān)[32]，POD 活性越高植物適應(yīng)性也就越強(qiáng).但是，在鉛脅迫濃度增高達(dá)到其耐受閾值或極限時，植物細(xì)胞因膜脂過氧化受到較大損傷，細(xì)胞失去正常生理和生物大分子合成機(jī)能，預(yù)示著POD 的合成和活性受到影響，出現(xiàn)抗氧化保護(hù)機(jī)能下降的現(xiàn)象[33-34].綜上分析表明，2.3 mmol/L可能是土人參對鉛脅迫的耐受閾值，土人參能很好地耐受中高度鉛污染的土壤環(huán)境；高濃度（4.6 mmol/L）鉛脅迫10 d 后，POD 活性并沒有出現(xiàn)顯著下降，表明土人參短期耐鉛脅迫的能力更強(qiáng).

2.2.3 鉛脅迫濃度對土人參MDA 含量的影響

MDA 質(zhì)量濃度總體呈現(xiàn)上升態(tài)勢，低濃度鉛脅迫（0.8 mmol/L）對土人參MDA 含量變化影響不顯著，中高濃度鉛脅迫（1.5～4.6 mmol/L）對土人參造成明顯脅迫，MDA 質(zhì)量濃度較對照顯著增加（圖4）.當(dāng)脅迫濃度達(dá)到3.1 mmol/L 時，MDA 質(zhì)量濃度達(dá)最大值56.3 nmol/g，約為對照（26.6 nmol/g）的2 倍，差異顯著.可見中高濃度鉛脅迫使土人參膜脂過氧化水平不斷增大，生理受害程度不斷增大.

圖4 不同濃度鉛脅迫對土人參MDA 質(zhì)量濃度的影響

鉛是植物生長的非必需元素，不同植物對鉛的耐受性也不同，雖然微量的鉛可促進(jìn)植物生長[33,35-36]，但是大量的鉛對大部分農(nóng)作物都是有害的[37]；鉛通過食物鏈進(jìn)入人體，影響人們的身體健康，因此，土壤鉛污染是現(xiàn)代社會發(fā)展亟待解決的問題.目前，土壤重金屬污染應(yīng)用最廣的是植物修復(fù)技術(shù)，篩選和種植鉛耐受植物，在治理解決土壤鉛污染中起到至關(guān)重要的作用，尤其是篩選適宜的耐鉛園林觀賞植物，既能實現(xiàn)環(huán)境治理又能美化環(huán)境.

研究發(fā)現(xiàn)土人參對鉛脅迫表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受力.在1.5 mmol/L 鉛脅迫濃度下，隨著脅迫時間的延長，土人參合成自身生長所需葉綠素的量不減反增，說明土人參能夠適應(yīng)該濃度的鉛脅迫.當(dāng)鉛脅迫濃度逐步升高，其葉綠素含量有所下降，高濃度鉛會抑制土人參葉綠素的合成，這與其它物種上的研究報道相吻合[38-40].在鉛脅迫濃度為2.3 mmol/L 時，POD酶活性達(dá)到最高，是土人參對鉛脅迫的耐受閾值.已有研究表明，POD 酶活隨鉛脅迫濃度的增加大都呈現(xiàn)出先升后降的趨勢[41-43]，大部分植物在POD 酶活性下降時均會表現(xiàn)出生長受到抑制甚至損害[33,44-45]，因此，可根據(jù)POD 活性達(dá)到峰值時的鉛脅迫濃度高低作為初步判定植物對鉛耐受性高低的標(biāo)準(zhǔn).據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)草本園藝觀賞植物的鉛耐受濃度區(qū)間在0.2～1.0 mmol/L，比如紫茉莉、洋常春藤、東方香蒲和碗蓮等園林花卉[45-52]，極少數(shù)花卉如白雪姬[53]和喜鹽鳶尾[54]能達(dá)到3.1～5.0 mmol/L.可見，土人參對鉛脅迫的耐受力（2.3 mmol/L）優(yōu)于大部分草本觀賞植物，甚至達(dá)到部分木本植物的耐受力[55-56].根據(jù)《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險管控標(biāo)準(zhǔn)（試行）》（GB 15618—2018）規(guī)定，鉛污染風(fēng)險管制值上限為400 mg/kg（1.9 mmol/kg）、水田為1000 mg/kg（4.8 mmol/kg），土人參適宜種植在風(fēng)險管制值以上的鉛污染土壤環(huán)境，是極具土壤鉛污染修復(fù)潛力和開發(fā)應(yīng)用價值的觀賞植物.今后可進(jìn)一步對其各器官吸附和富集鉛能力、鉛耐受相關(guān)基因等進(jìn)行更深入的研究，以期為鉛污染地區(qū)的生態(tài)修復(fù)和土人參的開發(fā)利用提供理論支撐.