龜齡集指紋圖譜的建立及共有峰的LC-MS鑒定

史靜超 ，高曉霞 ，張愛榮 ，秦雪梅 *

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué) 中藥與食品工程學(xué)院，山西 晉中 030619；2.山西大學(xué) 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006；3.山西廣譽(yù)遠(yuǎn)國(guó)藥有限公司，山西 太谷 030800）

0 引言

龜齡集是我國(guó)傳統(tǒng)中藥名方，始于明代嘉靖年間，歷經(jīng)400多年傳承而不衰。2020版《中國(guó)藥典》記載該方由紅參、鹿茸、海馬、補(bǔ)骨脂、甘草、天冬、淫羊藿等二十余味藥材加工制成，具有強(qiáng)身補(bǔ)腦，固腎補(bǔ)氣，增進(jìn)食欲之功效［1］?，F(xiàn)代藥理和臨床研究表明龜齡集可改善衰老引起的學(xué)習(xí)記憶功能障礙［2-3］，并可改善腎陽(yáng)虛證［4］，對(duì)睪丸功能障礙具有保護(hù)作用［5-6］。

龜齡集的多種功效源于其物質(zhì)基礎(chǔ)，龜齡集組方由二十余味藥材經(jīng)炮制、升煉而成，藥味多、生產(chǎn)工藝復(fù)雜，這都增加了龜齡集質(zhì)量控制的難度。近年來(lái)，中藥復(fù)方指紋圖譜因其能夠獲得多維化學(xué)信息，并可得到標(biāo)志復(fù)方特征的共有峰，而在中藥復(fù)方質(zhì)量控制方面應(yīng)用廣泛［7］。龜齡集產(chǎn)品一致性如何，怎樣評(píng)價(jià)龜齡集產(chǎn)品的一致性和生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，目前尚無(wú)相關(guān)研究?；诖耍狙芯坎捎肬PLC法對(duì)龜齡集進(jìn)行測(cè)定，建立了龜齡集的UPLC指紋圖譜，并對(duì)收集的15批次龜齡集樣本進(jìn)行了相似度評(píng)價(jià)。同時(shí)，采用LC-MS技術(shù)對(duì)龜齡集UPLC指紋圖譜共有峰進(jìn)行鑒定，以期為龜齡集質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

Waters ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司），UHPLC-Q Exactive四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（美國(guó)Thermo公司），Milli-Q Advantage純水-超純水制備系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

龜齡集（S1～S15批號(hào)依次為：20130201、20130302、 20141112、 20150101、 20150507、20151212、 103160203、 103160407、 103160508、103160917、103161018、 103170305、103170408、103170510、103170714，山西廣譽(yù)遠(yuǎn)國(guó)藥集團(tuán)有限公司），補(bǔ)骨脂素（≥98%，批號(hào)：MUST-16092810）、新補(bǔ)骨脂異黃酮（≥98%，批號(hào)：MUST-16092810）和齊墩果酸（≥98%，批號(hào)：MUST-17042706）均購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司，甲醇、石油醚（60℃～ 90℃）為分析純，乙腈為色譜純。

2 研究方法

2.1 色譜和質(zhì)譜條件

色譜條件：采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm；1.8 μm）色譜柱，流動(dòng)相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣體積2 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；柱溫30℃。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution process

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI），正負(fù)離子全掃模式，設(shè)置掃描質(zhì)量范圍為100 Da～1 500 Da，質(zhì)量分辨率70 000，毛細(xì)管溫度為320℃，加熱器溫度為300℃，鞘氣流速為35 arb，輔氣流速為10 arb，碰撞能量為25 V～60 V，采用快速數(shù)據(jù)依賴采集模式（DDA），對(duì)離子強(qiáng)度大于5 000的前驅(qū)離子進(jìn)行MS/MS采集。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試樣品制備

精密稱取龜齡集樣品1.0 g，置錐形瓶中加50 mL甲醇，超聲提取30 min，將得到的溶液過濾，并將濾液濃縮至干，加30 mL水溶解殘?jiān)?，?0 mL石油醚萃取3次，合并萃取液并濃縮至干，將殘?jiān)? mL容量瓶，以色譜甲醇溶解并定容，再用孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備

取適量補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、齊墩果酸，以色譜甲醇溶解，并定容至2 mL容量瓶，再用孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)

取同一批次龜齡集供試樣品，按“2.1項(xiàng)”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以11號(hào)峰為參照峰，計(jì)算得到各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.13%，相對(duì)峰面積RSD＜1.53%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次龜齡集共6份，按照“2.2項(xiàng)”供試品制備方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1項(xiàng)”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以11號(hào)峰為參照峰，計(jì)算得到各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.10%，相對(duì)峰面積RSD＜1.02%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一龜齡集供試品溶液，按“2.2項(xiàng)”供試品制備方法制備供試品溶液，分別于0 h，4 h，8 h，12 h，16 h，24 h按“2.1項(xiàng)”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以11號(hào)峰為參照峰，計(jì)算得到各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD＜ 0.15%，相對(duì)峰面積RSD＜ 1.78%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

3 研究結(jié)果

3.1 龜齡集UPLC指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

3.1.1 指紋圖譜的建立

按照“2.2項(xiàng)”的方法制備15批龜齡集供試品溶液，按“2.1項(xiàng)”色譜條件測(cè)定，記錄每批龜齡集的UPLC圖譜。15批樣品各主要色譜峰保留時(shí)間基本一致，確定了該檢測(cè)條件下峰面積較大、分離較好的19個(gè)峰為其共有色譜峰。其中11號(hào)峰與相鄰峰分離良好，峰面積大且穩(wěn)定性好，將其作為參照峰。將測(cè)得的15批樣品指紋圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》進(jìn)行分析，得到共有模式對(duì)照指紋圖譜R，如圖1。

圖1 龜齡集UPLC對(duì)照指紋圖譜RFig.1 UPLC fingerprints of control fingerprint（R）

3.1.2 相似度評(píng)價(jià)

利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》對(duì)15批樣品進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，15批龜齡集UPLC指紋圖譜疊加圖見圖2，15批樣品及對(duì)照指紋圖譜R的相似度計(jì)算結(jié)果見表2。由結(jié)果可知15批龜齡集樣本間相似度大于0.820，和對(duì)照指紋圖譜相似度均大于0.932，說明龜齡集產(chǎn)品生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，一致性良好。

圖2 15批龜齡集樣品UPLC指紋圖譜疊加圖Fig.2 UPLC fingerprints of 15 batches of Guilingji samples

表2 龜齡集指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Similarity evaluation on whole plant of Guilingji

3.2 龜齡集UPLC指紋圖譜共有峰LC-MS鑒定

將供試品溶液按照“2.1”項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)試。正負(fù)離子模式下的龜齡集樣品和混合對(duì)照品的總離子流圖見圖3。采用Xcalibur 3.2軟件分析得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，計(jì)算各共有峰對(duì)應(yīng)化合物可能的化學(xué)式，并參照文獻(xiàn)精確分子量和碎片離子鑒定了12個(gè)共有峰，其中1、3、13號(hào)峰經(jīng)和對(duì)照品比對(duì)保留時(shí)間、精密分子量和碎片離子鑒定得到，鑒定結(jié)果見表3。

圖3 正離子模式下龜齡集總離子流圖（a），負(fù)離子模式下龜齡集總離子流圖（b）和混合對(duì)照總離子流圖（c）Fig.3 Total ion chromatograms(TIC)of Guilingji in positive mode(a);the total ion chromatograms(TIC)of Guilingji in negative(b),and the total ion chromatograms(TIC)of mixed references(c)

表3 龜齡集UPLC共有峰LC-MS化學(xué)成分鑒定Table 3 Identification of common peaks of Guilingji by LC-MS

4 分析與討論

4.1 提取條件及色譜條件優(yōu)化

由于龜齡集復(fù)方組成藥味繁多，化學(xué)成分復(fù)雜多樣，使得液相色譜中各峰的分離度差且峰面積小，為獲得較多的化學(xué)信息和更好的分離度，實(shí)驗(yàn)考察了多種提取條件，包括100%甲醇、75%甲醇、50%甲醇、100%水回流、超聲提取，發(fā)現(xiàn)峰分離較差，可能是由于龜齡集組方藥味繁多，化學(xué)成分復(fù)雜導(dǎo)致峰重疊嚴(yán)重，故將甲醇提取物進(jìn)行萃取，使用不同極性溶劑，包括石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，通過對(duì)比各種提取條件下UPLC圖譜中總峰面積、總峰數(shù)和峰分離度，選擇甲醇超聲提取后再用石油醚萃取的條件。色譜條件優(yōu)化了流動(dòng)相系統(tǒng)及洗脫梯度，還考察了柱溫包括25℃、30℃、35℃、40℃，發(fā)現(xiàn)在是用乙腈-水系統(tǒng)得到的峰更多，柱溫在30℃時(shí)各峰對(duì)稱性和分離度較好。采用光二極管陣列全波長(zhǎng)掃描模式考察不同檢測(cè)波長(zhǎng)下的總峰數(shù)和峰面積，發(fā)現(xiàn)在203 nm處的峰數(shù)多且各峰均有較好的吸收。

4.2 龜齡集產(chǎn)品一致性和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

本研究建立的龜齡集UPLC指紋圖譜，確定了19個(gè)共有峰，并計(jì)算了15批龜齡集產(chǎn)品的相似度，結(jié)果表明各批次樣品相似度良好，雖然龜齡集制作工藝復(fù)雜，需將各單味藥材經(jīng)炮制再打粉混勻而后升煉制成，但其生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，產(chǎn)品一致性好。龜齡集UPLC指紋圖譜共有峰LC-MS鑒定結(jié)果表明該指紋圖譜中主要包括黃酮、香豆素、三萜和甾體類化合物。其中黃酮類化合物如新補(bǔ)骨脂異黃酮和corylifol A有良好的抗炎、抗氧化作用［13］，甘草查耳酮A亦可發(fā)揮抗炎和抗氧化的作用，其可能的機(jī)制是抑制NF-κB的激活和清除體外超氧陰離子自由基［14］。且黃酮類化合物可通過與大腦中負(fù)責(zé)記憶的細(xì)胞和分子相互作用來(lái)減少由于神經(jīng)退行性過程造成的神經(jīng)元損失，改善與年齡相關(guān)的認(rèn)知障礙［15］。香豆素類化合物如補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素也有良好的抗炎、抗氧化作用［13］，三萜類化合物如齊墩果酸可通過抗氧化、抗炎機(jī)制產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用，并能抑制腦內(nèi)11β-HSD1活性和β淀粉樣肽的形成改善學(xué)習(xí)記憶障礙［16］。甾體類化合物如薯蕷皂苷元可通過改善氧化應(yīng)激作用，降低Tau蛋白異常磷酸化等作用改善老年性認(rèn)知功能障礙［17］。正是龜齡集組方中二十余味藥材所含的化學(xué)成分協(xié)同作用才使得龜齡集具有強(qiáng)身補(bǔ)腦，固腎補(bǔ)氣等多種功效。

綜上，本研究首次建立了龜齡集UPLC指紋圖譜，該方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、結(jié)果可靠，可用于龜齡集產(chǎn)品的一致性和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。同時(shí)，本研究建立的指紋圖譜為龜齡集甲醇提取物的石油醚萃取部位，由LC-MS共有峰鑒定結(jié)果可知該指紋圖譜主要反映龜齡集中所含的中、低極性成分，下一步研究還將針對(duì)龜齡集中高極性成分建立指紋圖譜，以全面反映龜齡集化學(xué)組成，從而保證臨床用藥的安全性和有效性。