PPARy受體激動(dòng)劑羅格列酮對(duì)形覺(jué)剝奪性近視和正常豚鼠屈光度的影響

趙婧妍 李 兵

近年來(lái)，近視已經(jīng)成為非常普遍的眼部疾病。高度近視不僅影響遠(yuǎn)視力，還會(huì)增加白內(nèi)障及相關(guān)眼底病的風(fēng)險(xiǎn)[1]。近視主要是眼軸的異常延長(zhǎng)，鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)發(fā)生重塑引起[2-3]。在鞏膜重塑的過(guò)程中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-2(TIMP-2)和I型膠原蛋白(COL-I)十分重要[4]。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs),是一類(lèi)由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子Ⅱ型核激素受體超家族成員，包括PPARα、PPARβ、PPARy三種亞型。PPARy與其他核受體超家族要與相應(yīng)的配體結(jié)合才能夠活化[5]?；罨腜PARy在多種器官中具有抗纖維化和抗血管生成作用，在抗纖維化中主要通過(guò)調(diào)控TGF-β1、COL-I、TIMP-2[6]和MMP-2[7]四種蛋白發(fā)揮作用。PPARy在眼部的研究中主要集中在角膜新生血管[8]、眼表瘢痕[9]和糖尿病性視網(wǎng)膜病變等方面，而在近視方面的研究較少，本研究旨在探討PPARy受體激動(dòng)劑對(duì)形覺(jué)剝奪性近視(FDM)的影響，以及對(duì)COL-I、TGF-β1、MMP-2和TIMP-2四種蛋白的作用，以期對(duì)近視的臨床防治有一定的參考作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物普通級(jí)3周齡豚鼠40只(購(gòu)于錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，雌雄不限，體重150～200 g，豚鼠屈光度+3.00～+6.00 D，雙眼屈光參差≤+2.00 D，散光記為等效球鏡度。實(shí)驗(yàn)前使用手持裂隙燈排除眼表異常、眼底病變的豚鼠。飼養(yǎng)條件：日光燈12 h/12 h晝夜規(guī)律，室溫22～28 ℃，濕度50%，自由飲食，每天喂食充足新鮮大頭菜以補(bǔ)充維生素C。實(shí)驗(yàn)中嚴(yán)格遵守動(dòng)物3R原則與倫理要求。

1.1.2 主要試劑羅格列酮(上海源葉生物科技有限公司)，兔抗鼠TIMP-2單克隆抗體(NBP2-53347，美國(guó)NOVUS公司)，兔抗鼠TGF-β1多克隆抗體、兔抗鼠MMP-2多克隆抗體、兔抗鼠COL-I多克隆抗體、兔抗鼠GAPDH多克隆抗體(Proteintech中國(guó)公司)，通用SP試劑盒、DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，HE染色試劑盒(索萊寶生物科技有限公司)，檢影驗(yàn)光儀(蘇州六六視覺(jué)科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及方法40只豚鼠隨機(jī)分成4組，實(shí)驗(yàn)眼均為右眼。正常組：不做處理；FDM組：戴頭套，遮住右眼，露出左眼、雙耳及口鼻；正常+羅格列酮組：每天上午進(jìn)行一次腹腔注射羅格列酮5 mg·kg-1；FDM+羅格列酮組：戴頭套，遮住右眼，露出左眼、雙耳及口鼻，同時(shí)每天上午進(jìn)行一次腹腔注射羅格列酮5 mg·kg-1。

1.2.2 眼部生物學(xué)參數(shù)測(cè)量在實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)后28 d使用檢影驗(yàn)光儀測(cè)量豚鼠屈光度，測(cè)量前，使用復(fù)方托吡卡胺滴眼液對(duì)實(shí)驗(yàn)眼進(jìn)行散瞳，每5 min一次，共滴3次，再由同一位驗(yàn)光師進(jìn)行屈光度檢測(cè)，測(cè)量3次取平均值。實(shí)驗(yàn)后28 d，處死豚鼠后快速將眼球取出，剔除周?chē)钅ぃ糜诒?，使用游?biāo)卡尺測(cè)量眼軸長(zhǎng)度，測(cè)量5次取平均值。

1.2.3 組織標(biāo)本的處理每組取3只鼠眼置于FAS眼球固定液中固定24 h，脫水、石蠟包埋，每眼于鞏膜后極部切片15張，每張切片厚度為5 μm，1張用于HE染色，1張用于陰性對(duì)照，其他用于免疫組織化學(xué)染色；取剩余7只鼠眼，沿角膜緣剪開(kāi)，將眼前節(jié)組織、玻璃體及視網(wǎng)膜剔除，將鞏膜組織于EP管中，-80 ℃冰箱保存，用于Western blot檢測(cè)。

1.2.4 HE染色將石蠟切片置于60 ℃烤箱2 h，再經(jīng)脫蠟水化、蘇木素染色、分色、藍(lán)化、伊紅染色，脫水、透明，最后封片。觀察鞏膜厚度、膠原纖維排列整齊度。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色將石蠟切片于60 ℃烤片箱2 h，再脫水脫蠟、抗原修復(fù)、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷、正常山羊血清封閉，一抗過(guò)夜(陰性對(duì)照組以PBS替代一抗)，滴加生物素標(biāo)記山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，DAB顯色、沖洗、蘇木素復(fù)染、返藍(lán)、脫水、透明、封片。每種切片任意選取鞏膜后極部進(jìn)行圖像采集,各獲得9張圖像，每種蛋白(COL-I、TGF-β1、MMP-2和TIMP-2蛋白)各隨機(jī)選取5張圖像，使用Image-pro plus 6.0 圖像分析軟件，測(cè)定各組蛋白的平均光密度。

1.2.6 Western blot檢測(cè)取各組鞏膜組織進(jìn)行制樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，10 g·L-1BSA于室溫封閉2 h，一抗4 ℃冰箱過(guò)夜，二抗于室溫孵育2 h，最后化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影。使用ImageJ軟件對(duì)所有條帶進(jìn)行蛋白(COL-I、TGF-β1、TIMP-2和MMP-2蛋白)灰度值測(cè)量，目的條帶的灰度值除以?xún)?nèi)參灰度值得到相對(duì)表達(dá)量，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用 SPSS 25.0軟件,計(jì)量指標(biāo)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多個(gè)組間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 眼部生物學(xué)參數(shù)測(cè)量結(jié)果實(shí)驗(yàn)前，4組豚鼠屈光度均呈遠(yuǎn)視狀態(tài)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)后28 d，與正常組相比，F(xiàn)DM組豚鼠右眼屈光度和眼軸長(zhǎng)度均增加，形成相對(duì)近視，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；正常+羅格列酮組豚鼠右眼屈光度與眼軸長(zhǎng)度變化差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)；FDM+羅格列酮組豚鼠右眼屈光度和眼軸長(zhǎng)度變化差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。實(shí)驗(yàn)后28 d，與FDM組相比，F(xiàn)DM+羅格列酮組豚鼠右眼屈光度和眼軸長(zhǎng)度均減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(表1)。

表1 各組豚鼠屈光度、眼軸長(zhǎng)度比較

2.2 HE染色形態(tài)學(xué)觀察正常組：豚鼠鞏膜纖維厚度正常，排列整齊、緊密，分布規(guī)則；FDM組：豚鼠鞏膜纖維厚度明顯變薄，排列紊亂、松散，斷裂明顯；正常+羅格列酮組：豚鼠鞏膜纖維厚度正常，排列整齊、緊密，分布規(guī)則；FDM+羅格列酮組：豚鼠鞏膜纖維厚度中等，排列稍有紊亂、松散(圖1)。

圖1 各組豚鼠鞏膜HE染色結(jié)果(×400) 箭頭示鞏膜組織。

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果COL-I蛋白在正常組、正常+羅格列酮組、FDM+羅格列酮組豚鼠鞏膜均為高表達(dá)，呈棕色或棕黃色，在FDM組為低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TGF-β1蛋白在正常組、正常+羅格列酮組、FDM+羅格列酮組豚鼠鞏膜中均為高表達(dá)，呈棕色或棕黃色，在FDM組為低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MMP-2在正常組、正常+羅格列酮組、FDM+羅格列酮組豚鼠鞏膜中均為低表達(dá)，呈淺黃色，在FDM組為高表達(dá)，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TIMP-2蛋白在正常組、正常+羅格列酮組、FDM+羅格列酮組豚鼠鞏膜中均為高表達(dá)，呈黃色，在FDM組為低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2，圖2)。

表2 免疫組織化學(xué)染色觀察各組豚鼠鞏膜中COL-I、TGF-β1、MMP-2和TIMP-2蛋白表達(dá)

圖2 各組豚鼠免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×400) 1組為正常組，2組為FDM組，3組為正常+羅格列酮組，4組為FDM+羅格列酮組，5組為PBS陰性對(duì)照組。棕黃色、褐色為強(qiáng)陽(yáng)性；黃色為陽(yáng)性；淺黃色為弱陽(yáng)性；未著色為陰性。箭頭示鞏膜組織。

2.4 Western blot檢測(cè)各組豚鼠鞏膜中蛋白的表達(dá)與正常組相比，F(xiàn)DM組豚鼠鞏膜中COL-I、TGF-β1、TIMP-2蛋白的表達(dá)量均減少，MMP-2蛋白的表達(dá)量增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；正常+羅格列酮組豚鼠鞏膜中COL-I和TGF-β1蛋白的表達(dá)量較正常組均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，TIMP-2和MMP-2蛋白的表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；FDM+羅格列酮組豚鼠鞏膜中COL-I蛋白的表達(dá)量與正常組接近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TGF-β1、TIMP-2蛋白表達(dá)量均增加，MMP-2蛋白表達(dá)量減小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。與FDM組相比，F(xiàn)DM+羅格列酮組豚鼠鞏膜中COL-I、TGF-β1、TIMP-2蛋白的表達(dá)量均增加，MMP-2蛋白的表達(dá)量減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(圖3、表3)。

圖3 各組豚鼠鞏膜中COL-I、TGF-β1、TIMP-2和MMP-2蛋白的表達(dá) 1組為正常組，2組為FDM組，3組為正常+羅格列酮組，4組為FDM+羅格列酮組。

表3 各組豚鼠鞏膜中COL-I、TGF-β1、TIMP-2和MMP-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

目前關(guān)于近視機(jī)制的研究，多數(shù)學(xué)者發(fā)現(xiàn)近視的調(diào)控與鞏膜ECM的重塑有著一定的聯(lián)系。在近視進(jìn)程中，鞏膜ECM重塑，同時(shí)眼軸拉長(zhǎng)，鞏膜變薄，膠原纖維排列紊亂、稀疏。在鞏膜的ECM中，主要成分是膠原蛋白，其排列整齊致密，是維持眼球后極部形態(tài)的重要部分，其中COL-I蛋白的比例高達(dá)50%[10]。TGF-β1可以促進(jìn)鞏膜成纖維細(xì)胞分泌COL-I，而MMP-2是在ECM、膠原蛋白的降解過(guò)程中起主要作用的酶；同時(shí)TIMP-2是MMP-2的特異性抑制劑，在眼軸異常延長(zhǎng)的過(guò)程中，MMP表達(dá)增加，ECM分解增加，鞏膜厚度進(jìn)一步變薄，因此，二者之間的平衡對(duì)近視眼的鞏膜重塑起到重要作用[11-12]。以往的研究證實(shí),在FDM小鼠眼中，MMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)均升高，TIMP-2蛋白的表達(dá)降低，TGF-β1蛋白的表達(dá)降低，COL-I蛋白的表達(dá)降低[13-14]，HIF-1α蛋白的表達(dá)升高[15]。

PPARy受體在抗纖維化的治療過(guò)程中起到了重要作用，在纖維變形的過(guò)程中，存在大量的促炎因子的參與，其中TGF-β1是最重要的因子，起到了介導(dǎo)成纖維細(xì)胞的增殖與分化、促進(jìn)ECM的合成以及減少ECM降解的作用[16]。以往的研究證明，羅格列酮激活PPARy能夠抑制角膜、脈絡(luò)膜新生血管形成，抑制生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[8,17]。有臨床研究報(bào)道，羅格列酮可延緩糖尿病性視網(wǎng)膜病變的進(jìn)展[18]，還能抑制角膜、結(jié)膜組織的纖維化，包括角膜損傷、結(jié)膜瘢痕化等[19]。PPARy在損傷性疾病中具有神經(jīng)保護(hù)作用，其激動(dòng)劑對(duì)視神經(jīng)也起到了保護(hù)作用[20]。有關(guān)PPARy在近視方面的研究較少，Pan等[21]發(fā)現(xiàn)PPARy拮抗劑對(duì)FDM沒(méi)有影響，對(duì)正常豚鼠有近視漂移作用；而其激動(dòng)劑GW1929能夠抑制FDM的進(jìn)展，對(duì)正常豚鼠沒(méi)有影響；該研究還發(fā)現(xiàn)，PPARy受體激動(dòng)劑通過(guò)下調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)，而上調(diào)COL-I蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而對(duì)豚鼠的屈光度起到調(diào)節(jié)作用。

PPARy必須與相對(duì)應(yīng)的配體結(jié)合后才能夠活化，其配體分為天然激動(dòng)劑和合成激動(dòng)劑，羅格列酮屬于后者。羅格列酮在臨床糖尿病以及眼部疾病的治療中均有應(yīng)用，安全性較高，本研究建立豚鼠FDM模型，探討PPARy受體激動(dòng)劑羅格列酮在豚鼠FDM的作用及其機(jī)制。與FDM組相比，F(xiàn)DM+羅格列酮組中，豚鼠屈光度與眼軸長(zhǎng)度均減少(均為P<0.05)；鞏膜纖維厚度中等，排列稍有紊亂、松散；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，豚鼠鞏膜中COL-I、TGF-β1、TIMP-2蛋白的表達(dá)量均增加，MMP-2蛋白的表達(dá)量減少(均為P<0.05)。本研究結(jié)果表明，羅格列酮通過(guò)增加FDM組豚鼠中COL-I、TGF-β1和TIMP-2蛋白的表達(dá)量，減少M(fèi)MP-2蛋白的表達(dá)量，使得FDM組豚鼠的屈光度和眼軸長(zhǎng)度的增長(zhǎng)與延長(zhǎng)都受到了抑制，提示PPARy受體激動(dòng)劑羅格列酮對(duì)近視的進(jìn)展起到了抑制作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，在正常+羅格列酮組豚鼠中，COL-I、TGF-β1蛋白的表達(dá)量均上升，其中COL-I蛋白的表達(dá)量顯著上升，通過(guò)Pan等[21]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPARy受體激動(dòng)劑GW1929能夠減少HIF-1α的表達(dá)。綜合分析，考慮原因可能是羅格列酮作為另一種激動(dòng)劑，可能也會(huì)減少HIF-1α的表達(dá)，與增加TGF-β1蛋白共同作用，調(diào)節(jié)COL-I蛋白的表達(dá)，后續(xù)有機(jī)會(huì)可以嘗試驗(yàn)證,結(jié)合屈光度和眼軸長(zhǎng)度，提示羅格列酮對(duì)正常屈光度的豚鼠沒(méi)有明顯影響。本研究中羅格列酮能夠抑制FDM的進(jìn)展，且對(duì)正常豚鼠眼無(wú)影響，與其他研究一致[21]，通過(guò)本研究中四種蛋白與屈光度、眼軸長(zhǎng)度等參數(shù)的變化情況，提示PPARy激動(dòng)劑羅格列酮調(diào)控FDM的機(jī)制可能是：通過(guò)上調(diào)TGF-β1蛋白促進(jìn)COL-I蛋白的分泌與合成，下調(diào)MMP-2蛋白的表達(dá)和上調(diào)其特異性抑制劑TIMP-2蛋白的表達(dá)，來(lái)減少COL-I蛋白的降解，進(jìn)而達(dá)到調(diào)控鞏膜重塑的目的，從而對(duì)FDM的形成起到了一定的抑制作用。通過(guò)蛋白變化的比較，考慮PPARy受體激動(dòng)劑羅格列酮對(duì)FDM進(jìn)展中該通路的作用和激動(dòng)效果可能更為明顯，也提示我們羅格列酮對(duì)FDM近視進(jìn)展的抑制效果良好。本研究中豚鼠鞏膜中COL-I、TGF-β1、MMP-2、TIMP-2四種蛋白表達(dá)的變化，與其他研究中有關(guān)肺[22]和腎[23]的抗纖維化過(guò)程中的變化并不一致，原因可能是抗纖維化與近視發(fā)生發(fā)展是兩個(gè)不同的過(guò)程，二者受不同的機(jī)制調(diào)控。

本研究中豚鼠樣本量較少，同時(shí)未做藥物濃度梯度對(duì)比，后期可以考慮進(jìn)行藥物劑量梯度實(shí)驗(yàn)，以及嘗試結(jié)膜下注射或滴眼等不同的給藥方式，以期待探索出更加合適的給藥劑量和給藥方式。