IGF-1、bFGF、ITS、2-ME2對(duì)牛耳皮膚成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

孟曉俁，劉 欣，孫 羽，張廣輝，張 涌

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

影響體細(xì)胞核移植效率的因素有很多，其中供體細(xì)胞核不完全重編程是影響體細(xì)胞核移植效率最重要的因素。處于不同細(xì)胞周期中的供體細(xì)胞，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和表觀遺傳修飾不同，體細(xì)胞核移植效率也不同。通常認(rèn)為，G1或G0期是最適合作為體細(xì)胞核移植供體細(xì)胞的細(xì)胞周期。目前體細(xì)胞核移植程序中供體細(xì)胞一般通過(guò)血清饑餓或接觸抑制處理，讓更多的供體細(xì)胞處于G1或G0期，但是這兩種處理方法獲得的G1或G0期的細(xì)胞只占細(xì)胞總數(shù)的70%～80%，并且獲得的供體細(xì)胞容易受到損傷，因此優(yōu)化供體細(xì)胞的處理方法對(duì)于完善體細(xì)胞核移植技術(shù)具有重要意義。

細(xì)胞周期分為G1、S、G2、M期。G1期還可分為G1早期和G1晚期。細(xì)胞質(zhì)橋連接的兩個(gè)細(xì)胞即為eG1期細(xì)胞，有研究通過(guò)震蕩法獲取eG1期細(xì)胞[1]。G0(靜止期)細(xì)胞既不生長(zhǎng)也不增殖。這種狀態(tài)通常由有絲分裂過(guò)程中所需物質(zhì)耗竭(如血清饑餓)引起，具有特定的轉(zhuǎn)錄[2-3]和代謝[4]變化等特征。有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于非轉(zhuǎn)基因的成纖維細(xì)胞，血清饑餓法誘導(dǎo)獲得的G0期細(xì)胞核移植后，足月?tīng)倥５拇婊盥曙@著高于G1早期和G1晚期細(xì)胞。但是對(duì)于轉(zhuǎn)基因的成纖維細(xì)胞，G1期細(xì)胞核移植后重構(gòu)胚發(fā)育至足月?tīng)倥５谋壤噍^于G0期細(xì)胞顯著升高，犢牛存活率及發(fā)育至斷奶的比例也更高。用非轉(zhuǎn)基因的eG1期細(xì)胞核移植后獲得的重構(gòu)胚發(fā)育明顯優(yōu)于G0和G1晚期。與G1晚期作為供體細(xì)胞時(shí)獲得的重構(gòu)胚相比，eG1期細(xì)胞作為供體細(xì)胞時(shí)，1級(jí)和2級(jí)囊胚發(fā)育率更高[5]。這些研究表明，eG1期細(xì)胞是體細(xì)胞核移植最適合的細(xì)胞周期。

本試驗(yàn)研究不同生長(zhǎng)因子(2-ME2、IGF-1、bFGF、ITS)及其組合(2-ME2+IGF-1+bFGF+ITS)對(duì)細(xì)胞周期中G0/G1期細(xì)胞比例的影響，并與震蕩法聯(lián)合使用觀察獲得的細(xì)胞中eG1細(xì)胞比例，以期在短期內(nèi)獲得更多數(shù)量及更高比例的eG1期細(xì)胞，為體細(xì)胞核移植提供適合的供體細(xì)胞處理方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛耳皮膚成纖維細(xì)胞(渭南華陰市草灘第一牧場(chǎng)，采取母牛新鮮牛耳皮膚組織分離培養(yǎng))；300目細(xì)胞篩；0.22 μm濾器購(gòu)自美國(guó)Millipore；小鼠抗波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體(ab8069)購(gòu)自美國(guó)Abcam；山羊抗小鼠抗體(A-21424)購(gòu)自美國(guó)Thermo； DMEM/F12+GlutaMAX TM-1(1X)、Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine(ITS-X)(100X)、IGF-1、bFGF、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco；2-ME2購(gòu)自美國(guó)Sigma；二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)、胰蛋白酶(Trypsin)購(gòu)自美國(guó)Amresco；DAPI、體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定液、免疫染色通透液Triton X-100、免疫染色封閉液、免疫熒光染色一抗稀釋液、免疫熒光染色二抗稀釋液均購(gòu)自中國(guó)上海碧云天；生理鹽水購(gòu)自中國(guó)陜西圣奧動(dòng)物藥業(yè)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牛耳皮膚成纖維原代細(xì)胞分離與培養(yǎng) 采用組織塊貼壁培養(yǎng)法分離牛耳皮膚成纖維細(xì)胞。采集牛耳皮膚組織，用含青霉素及硫酸鏈霉素的PBS反復(fù)沖洗，加入少許細(xì)胞培養(yǎng)液，用眼科剪剪碎皮膚組織。將組織塊間隔排布，均勻貼附在60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，倒置于飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、38.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。待組織塊周圍液體即將蒸發(fā)完前加3 mL培養(yǎng)液，正置入培養(yǎng)箱，2～3 d后觀察細(xì)胞遷出情況并更換新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)滿后棄掉組織塊，將細(xì)胞傳代或凍存。試驗(yàn)所用細(xì)胞均為F7-F11細(xì)胞。

1.2.2 牛耳皮膚成纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng) 將已長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿皿底的牛耳皮膚成纖維原代細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。棄培養(yǎng)液，加入胰酶細(xì)胞消化液并置于培養(yǎng)箱消化3～4 min，用移液器吹打貼壁細(xì)胞，待所有細(xì)胞懸浮，加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化。加入離心管，1 050 r/min離心5 min(以下離心條件均相同)，棄上清，培養(yǎng)液重懸細(xì)胞加入培養(yǎng)皿，“十字法”混勻后置于培養(yǎng)箱。

1.2.3 震蕩法獲取牛耳皮膚成纖維G1期細(xì)胞 復(fù)蘇細(xì)胞至24孔板，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM/F12的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)90%后傳代，傳代后匯合度達(dá)到80～90%時(shí)將細(xì)胞傳代至35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿。24 h后，鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)及匯合度。棄原培養(yǎng)液，加DPBS洗1～2次，分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同的處理：對(duì)照組為添加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，處理組為向培養(yǎng)液中分別添加1 μmol/L 2-ME2(2-ME2)、20 ng/mL IGF-1(IGF-1)、10 ng/mL bFGF(bFGF)、ITS(ITS)及4種細(xì)胞因子組合(2-ME2+ IGF-1+ bFGF+ ITS)，培養(yǎng)細(xì)胞2 h，將培養(yǎng)皿置于渦旋振蕩器上于7檔震蕩2 min。收集培養(yǎng)液，離心后棄上清，用培養(yǎng)液重懸混勻，血球細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 當(dāng)60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中細(xì)胞匯合度達(dá)60%時(shí)，消化后離心并收集細(xì)胞，PBS洗3次。體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛 4 ℃過(guò)夜固定細(xì)胞，離心后棄上清，PBS洗3次。500 μL Triton-X 100透化液室溫孵育30 min，PBS洗1次。生理鹽水避光稀釋DAPI至3 μg/mL后加至管內(nèi)重懸細(xì)胞，PBS洗1次，加500 μL PBS重懸，用300目細(xì)胞篩過(guò)篩至流式管內(nèi)，上機(jī)。

1.2.5 牛耳皮膚成纖維細(xì)胞的免疫熒光鑒定 牛耳皮膚成纖維細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右時(shí)，棄原培養(yǎng)液，PBS洗2次，加入體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液4 ℃過(guò)夜固定，PBS洗3次；加Triton-X 100透化液，室溫孵育30 min，PBS洗3次，用免疫熒光封閉液室溫封閉2 h，吸棄上清，小鼠抗Vimentin單克隆一抗(1∶1 000)4 ℃過(guò)夜孵育；PBS洗3次，山羊抗小鼠二抗(1∶500)室溫孵育2 h，PBS洗3次后參照“1.2.4”進(jìn)行DAPI染色，將細(xì)胞置于熒光倒置顯微鏡DAPI激發(fā)光下拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。流式細(xì)胞儀結(jié)果分析使用FLOW JO 10.7.1軟件，柱狀圖使用EXCEL 2019軟件制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛耳皮膚成纖維原代細(xì)胞的分離培養(yǎng)

牛耳皮膚組織塊貼壁培養(yǎng)11 d后，鏡下觀察牛耳皮膚成纖維原代細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形(圖1)。

圖1 牛耳皮膚成纖維細(xì)胞顯微圖Fig.1 Microscopic image of bovine ear skin fibroblasts

2.2 牛耳皮膚成纖維細(xì)胞免疫熒光鑒定

選取F7代牛耳皮膚成纖維細(xì)胞鋪于24孔板進(jìn)行免疫熒光染色，細(xì)胞純度可達(dá)100%(圖2)。在熒光倒置顯微鏡下可觀察到明場(chǎng)下牛耳皮膚成纖維細(xì)胞為長(zhǎng)梭形，牛耳皮膚成纖維細(xì)胞胞質(zhì)中的波形蛋白為成纖維細(xì)胞的主要標(biāo)志物，染色后呈紅色熒光，DAPI著色的細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。

Bright field表示牛耳皮膚成纖維細(xì)胞的明場(chǎng)圖； DAPI表示DAPI著色的細(xì)胞核呈現(xiàn)的藍(lán)色熒光； Vimentin表示對(duì)牛耳皮膚成纖維細(xì)胞染色后的胞質(zhì)中的波形蛋白呈現(xiàn)的紅色熒光；Merge是合并圖Brightfield represents bovine ear skin fibroblasts under brightfield; DAPI represents the blue fluorescence of the nucleus colored by DAPI; Vimentin represents the red fluorescence of vimentin in the cytoplasm of bovine ear skin fibroblasts; Merge is the merged image圖2 牛耳皮膚成纖維細(xì)胞免疫熒光鑒定Fig.2 Immuno fluorescence identification of bovine ear skin fibroblasts

2.3 不同細(xì)胞因子對(duì)G0/G1期細(xì)胞的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)(圖3)，相同處理時(shí)間內(nèi)， 2-ME2處理組G0/G1期細(xì)胞比例相較其他組顯著增加(P<0.05)，其他組間無(wú)顯著差異。

*表示差異顯著(P<0.05)；Control為對(duì)照組，下同* means significant difference (P<0.05); Control is the control group,the same below圖3 G0/G1期細(xì)胞所占比例 Fig.3 Proportion of cells in G0/G1 phase

2.4 不同細(xì)胞因子聯(lián)合震蕩法對(duì)G1期細(xì)胞的影響

用血球細(xì)胞計(jì)數(shù)板分別對(duì)震蕩所得細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)結(jié)果顯示(圖4)，在相同處理時(shí)間內(nèi)，2-ME2處理組 eG1期細(xì)胞較其他組顯著增加(P< 0.05)，其他組間無(wú)顯著差異。

圖4 eG1期細(xì)胞所占比例Fig.4 Proportion of cells in eG1 phase

3 討論與結(jié)論

目前，處于細(xì)胞周期中哪個(gè)階段的供體細(xì)胞最適合進(jìn)行體細(xì)胞核移植尚無(wú)定論。有研究表明，對(duì)于轉(zhuǎn)基因供體細(xì)胞，源自eG1期細(xì)胞的重構(gòu)胚發(fā)育明顯優(yōu)于G0期和G1晚期；對(duì)于非轉(zhuǎn)基因供體細(xì)胞，源自G1期的重構(gòu)胚的發(fā)育率明顯低于G0期，但胚胎移植后源自G1期的重構(gòu)胚得到的克隆牛在斷奶后存活率更高[5]。處于G1期的細(xì)胞主要合成RNA和核糖體，為下階段S期的DNA復(fù)制作好物質(zhì)和能量的準(zhǔn)備，有研究發(fā)現(xiàn)eG1期細(xì)胞核移植后所得克隆牛的存活率提高[5]。G0期細(xì)胞處于細(xì)胞的靜止期，移入卵母細(xì)胞后能夠與其DNA復(fù)制同步，減少了核移植胚胎發(fā)育過(guò)程中染色體畸變的可能性。那么如何提供更多處于G0/G1期及eG1期的細(xì)胞，對(duì)于提高SCNT效率有重要意義。

影響細(xì)胞周期調(diào)控的因素包括細(xì)胞周期蛋白依賴激酶的磷酸化、細(xì)胞周期蛋白的產(chǎn)生與降解、細(xì)胞因子等。有研究發(fā)現(xiàn)1 μmol/L 2-ME2與震蕩法聯(lián)合作用下可以使更多的牛胎兒成纖維細(xì)胞處于有絲分裂期[6]；20 ng/mL IGF-1可以增強(qiáng)小鼠精源干細(xì)胞的增殖能力[7]；對(duì)從大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞中分化出成纖維細(xì)胞[8]和大鼠鞏膜成纖維[9]來(lái)說(shuō)，bFGF促進(jìn)細(xì)胞增殖的最佳濃度為10 ng/mL； Keenan等[10]總結(jié)了胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和硒對(duì)細(xì)胞增殖的影響，10 μg/mL胰島素+5.5 μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白+6.7 ng/mL亞硒酸鹽(ITS)的組合已經(jīng)成為商業(yè)上可獲得的培養(yǎng)基補(bǔ)充劑。因此本研究選擇上述細(xì)胞因子開(kāi)展試驗(yàn)。

2-ME2是體內(nèi)雌二醇的一種代謝產(chǎn)物。有研究發(fā)現(xiàn)，2-ME2處理人慢性髓原白血病細(xì)胞后G0/G1期細(xì)胞比例增加，S期比例下降[11]。此外，隨著2-ME2濃度的升高，骨肉瘤MG63細(xì)胞的細(xì)胞周期停留在G0/G1期比例顯著性提高，而S期和G2/M期的細(xì)胞比例則顯著性下降[12]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，平滑肌細(xì)胞經(jīng)0～10 μmol/L 2-ME2作用24 h后，會(huì)抑制G2/M至G0/G1的轉(zhuǎn)變[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在2-ME2處理后，與對(duì)照組和其他處理組相比，G0/G1期及eG1期比例均顯著升高(P<0.05)，說(shuō)明2-ME2處理2 h后，更多的牛耳皮膚成纖維細(xì)胞處于G0/G1期，筆者推測(cè)2-ME2對(duì)細(xì)胞周期的作用不僅受2-ME2濃度和處理時(shí)間的影響，也受細(xì)胞種類的影響。此外，還有研究表明BIX-01294 作為一種有效的G9a甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，1 μmol/L的BIX-01294處理山羊胎兒成纖維細(xì)胞可增加G1/G0期細(xì)胞比例，后續(xù)可進(jìn)一步研究[14]。

bFGF是由146個(gè)氨基酸組成的多肽，能通過(guò)旁分泌或自分泌機(jī)制發(fā)揮許多重要的生理特性，具有較強(qiáng)的促進(jìn)細(xì)胞增殖分化的作用，與相應(yīng)受體結(jié)合后可通過(guò)酪氨酸蛋白激酶系統(tǒng)傳遞信息并逐級(jí)放大，最終產(chǎn)生細(xì)胞增殖效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，從細(xì)胞增殖和成纖維細(xì)胞膠原蛋白的表達(dá)來(lái)看，bFGF最佳質(zhì)量濃度為10 ng/mL，在該濃度下，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)更快，并向細(xì)胞外基質(zhì)中分泌更多的Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白，這可能有助于微環(huán)境的穩(wěn)定[8]。此外，bFGF與細(xì)胞膜上相應(yīng)的受體結(jié)合后，定位細(xì)胞核，通過(guò)RNA聚合酶I加強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄從而加速細(xì)胞G0～G1，G1～S期的轉(zhuǎn)換，促進(jìn)細(xì)胞的分裂與增殖[15]。還有研究發(fā)現(xiàn)1、50、100、500 ng/mL的bFGF處理細(xì)胞后G1期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞增加，進(jìn)入有絲分裂的細(xì)胞數(shù)增加[16]。本研究使用10 ng/mL的bFGF處理后，G0/G1期及eG1期細(xì)胞比例無(wú)顯著變化。雖然bFGF具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，但對(duì)牛耳皮膚成纖維細(xì)胞來(lái)說(shuō)，bFGF處理細(xì)胞2 h可能無(wú)法推動(dòng)細(xì)胞周期向G0/G1期轉(zhuǎn)變，增加G0/G1期及eG1期細(xì)胞的數(shù)量。

IGF-I是一種廣譜促分裂素，通過(guò)結(jié)合胰島素樣生長(zhǎng)因子受體來(lái)增強(qiáng)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶的活性，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的生物合成，抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮很強(qiáng)的促有絲分裂原作用，促使細(xì)胞從G0期向G1期轉(zhuǎn)變，進(jìn)而刺激cyclin D1和CDK4基因表達(dá)，促使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤腫瘤抑制蛋白磷酸化合成cyclin E，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)變，縮短S期時(shí)間，導(dǎo)致G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低，細(xì)胞分裂的速度加快，周期縮短，促進(jìn)細(xì)胞增殖[17-18]。本研究結(jié)果表明，20 ng/mL的IGF-I處理后，G0/G1期及eG1期細(xì)胞比例無(wú)顯著變化。

胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒是一種含有胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉的培養(yǎng)基添加劑，在低血清培養(yǎng)基中添加可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。有研究發(fā)現(xiàn)，將ITS-X添加至DMEM/F12、F12、DMEM、EMEM等培養(yǎng)液，且FBS體積分?jǐn)?shù)<4%時(shí)，能夠促進(jìn)各種類型細(xì)胞的生長(zhǎng)[19]。但也有研究表明，將體積分?jǐn)?shù)為1%的ITS加入體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS的培養(yǎng)液中能增強(qiáng)人耳軟骨細(xì)胞的增殖以及減少去分化，但是單獨(dú)使用卻不能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖[20]。其中，胰島素通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有多效合成代謝作用，能夠促進(jìn)葡萄糖和氨基酸攝取[21-22]、脂肪生成[23]、單價(jià)陽(yáng)離子[24]和磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)[25]、蛋白質(zhì)[26-27]和核酸合成[28]，同時(shí)抑制糖原、蛋白質(zhì)和脂肪的分解。轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin，Trf)是一種高度保守的血清糖蛋白，具有運(yùn)輸鐵的作用。Trf作為無(wú)血清培養(yǎng)基必需添加的組分，可以通過(guò)與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體相互作用，在無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要功能。Trf能與三價(jià)鐵離子可逆性結(jié)合，調(diào)節(jié)鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝，維持細(xì)胞內(nèi)的鐵平衡及細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖。同時(shí)，鐵也是一種重要的胞外抗氧化劑，有助于降低氧自由基和過(guò)氧化氫對(duì)細(xì)胞的毒性。硒以亞硒酸鹽的形式存在，具有抗氧化作用。本研究結(jié)果表明，在ITS處理2 h后，G0/G1期及eG1期細(xì)胞比例無(wú)顯著變化，推測(cè)只有在低血清培養(yǎng)液中添加ITS才會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，本研究中使用含10%FBS的培養(yǎng)液，其中血清含量過(guò)高可能影響ITS發(fā)揮作用。但血清是培養(yǎng)供體細(xì)胞最有效的生物液體之一[29]。其中的生長(zhǎng)因子、激素等物質(zhì)對(duì)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)具有重要作用，降低血清含量可能會(huì)影響細(xì)胞增殖。因此，ITS對(duì)細(xì)胞周期的影響仍需進(jìn)一步探索。

2-ME2+IGF-1+bFGF+ITS處理組與對(duì)照組相比，細(xì)胞周期無(wú)顯著變化，推測(cè)4種因子對(duì)細(xì)胞的促增殖作用與對(duì)細(xì)胞周期的阻滯作用相互影響。但目前4種因子共同作用的機(jī)理仍不清楚，需要進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)通過(guò)研究細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控，可在體細(xì)胞核移植過(guò)程中短時(shí)間內(nèi)獲得更多G0/G1期和eG1期的供體細(xì)胞，為提高體細(xì)胞核移植效率提供了新線索。