羚牛骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

賈 佳，郭含星，王娟娟，羅偉強(qiáng)，耿陽(yáng)陽(yáng)，高夢(mèng)溪，王君建，潘廣林，賈康勝，嚴(yán)興榮

(1. 西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710068；2. 陜西省野生動(dòng)物保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710068；3. 陜西省珍稀野生動(dòng)物搶救飼養(yǎng)研究中心，西安 710402)

間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一種具有自我更新與多向分化能力的基質(zhì)細(xì)胞，可分化為中胚層細(xì)胞，如脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞以及其他胚胎譜系的細(xì)胞。MSCs可從多種器官組織中分離得到，如臍帶、子宮內(nèi)膜息肉、月經(jīng)血、骨髓及脂肪組織[1]。來(lái)源于骨髓的MSCs(Bone-marrow-derived MSCs,BM-MSCs)通過(guò)與免疫細(xì)胞的相互作用可實(shí)現(xiàn)效應(yīng)功能的調(diào)節(jié)[2]。近年來(lái)的多項(xiàng)研究結(jié)果表明，MSCs具有的多能性使其成為臨床醫(yī)療應(yīng)用上極具吸引力的選擇，如細(xì)胞治療、再生醫(yī)學(xué)和組織修復(fù)等[3]。此外，MSCs在野生動(dòng)物保護(hù)方面發(fā)揮重要作用。目前，已有研究實(shí)現(xiàn)恒河猴、大熊貓、棕熊和小熊貓MSCs的分離鑒定[4]。研究表明，瀕危野生動(dòng)物MSCs的超低溫保存可作為就地保護(hù)和遷地保護(hù)的有效補(bǔ)充措施，最大限度保存種群的遺傳多樣性[5]。

羚牛(Budorcastaxicolor)，屬偶蹄目，?？疲饕植荚谥袊?guó)西北、西南高海拔地區(qū)以及印度、不丹等地[6-9]。受過(guò)度捕獵和棲息地喪失等因素影響，羚牛被世界自然保護(hù)聯(lián)盟(International Union for Conservation of Nature,IUCN)紅色名單列為易危物種[10]，是國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物。為保護(hù)和改善羚牛及其他野生動(dòng)物的宜居環(huán)境，中國(guó)已實(shí)施包括退耕還林工程和天然林保護(hù)工程在內(nèi)的多項(xiàng)保護(hù)計(jì)劃[11-12]。然而，就地保護(hù)策略難以維持羚牛這類(lèi)小種群的繁殖和足夠的遺傳多樣性，因此，亟需開(kāi)發(fā)更加可行的保護(hù)途徑以應(yīng)對(duì)羚牛種群規(guī)模的不斷減少[13]。近年來(lái)，集中在行為生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的研究使得羚牛種群數(shù)量有所上升[14-16]；線粒體全基因組等分子水平的測(cè)定與分析為羚牛遺傳多樣性的保護(hù)提供了資料[17-19]。但是，細(xì)胞治療與體細(xì)胞克隆等技術(shù)作為瀕危物種保護(hù)的重要措施[20]，圍繞其開(kāi)展的羚牛保護(hù)學(xué)研究較少。BM-MSCs具有的易獲取、易培養(yǎng)、低免疫等特性可能作為羚牛干細(xì)胞疾病臨床治療與胚胎克隆的有效載體。因此，本研究從羚牛骨髓中分離BM-MSCs，在細(xì)胞水平上進(jìn)行鑒定，為羚牛生物多樣性保護(hù)以及間充質(zhì)干細(xì)胞在野生瀕危物種中的應(yīng)用研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物材料 動(dòng)物樣品采自樓觀臺(tái)珍稀野生動(dòng)物搶救飼養(yǎng)研究中心(陜西省西安市周至縣)12歲正常死亡6 h后的雄性羚牛。將無(wú)菌分離的羚牛股骨用含青霉素-鏈霉素的磷酸緩沖液洗滌3次，4 ℃保存，備用。本研究涉及的所有動(dòng)物試驗(yàn)程序均已獲得西北大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[許可證號(hào):SYXK(陜)2021-004]。

1.1.2 試劑與儀器 試劑：胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)、高糖培養(yǎng)基(Dulbecco’s modifified Eagle medium,DMEM)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(Insulin-Transferrin-Selenium,ITS)、胰島素(Insulin,IS)、胰蛋白酶(Gibco)；乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)、吉姆薩染液(Giemsa stain solution)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-Isobutyl-1-methylxanthine,IBMX)、地塞米松(Dexamethasone,DM)、吲哚美辛(Indometacin,ID)、抗壞血酸(Ascorbic acid,AA)、秋水仙素(北京索萊寶科技有限公司)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3(Transforming growth factor-β3,TGF-β3)、β-甘油磷酸酯(β-Glycerophosphate,β-GP)、油紅(Oil Red O)、茜素紅(Alizarin Red S)、阿利新藍(lán)(Alcian blue)、胰蛋白酶(Sigma Aldrich)；多聚甲醛(PFA)、氯化鉀、無(wú)水乙醇、甲醇、冰醋酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

儀器：超凈工作臺(tái)(北京昊諾斯科技有限公司ECO 0.9)，高溫高壓滅菌鍋(上海賽默生物科技發(fā)展公司SX-300)，體視顯微鏡(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司S10)，二氧化碳培養(yǎng)箱(恒生實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司CHP-80Q)，倒置熒光顯微鏡(Nikon)，醫(yī)用冷藏箱(廈門(mén)藍(lán)冰生物科技有限公司QBLL0812)，-20 ℃冰箱(海爾DW-25L256)，-80 ℃冰箱(賽默飛世爾科技公司ULTS1490)，流式細(xì)胞儀(BD Biosciences FACSAriaTM III)，高速離心機(jī)(賽默飛世爾科技公司H1850)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 羚牛骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 無(wú)菌條件下分離死亡羚牛股骨，去除附著在骨頭上的所有結(jié)締組織，用套管針連接10 mL注射器抽吸骨髓。抽吸后將骨髓置于直徑10 cm培養(yǎng)皿中，加入10 mL的含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃，5% CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)7 d，期間2 d更換1次培養(yǎng)基。原代細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右時(shí)傳代。用0.25%胰蛋白酶和0.04% EDTA消化，含10% FBS的DMEM中和，1 000 r/min離心3 min后棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液。將1 mL濃度為1×106mL-1的細(xì)胞懸液置于直徑10 cm的培養(yǎng)皿中，加入9 mL DMEM和10% FBS培養(yǎng)至80%融合度時(shí)冷凍保存，凍存時(shí)間不超過(guò)3代[21]。

1.2.2 染色體組型分析 用0.3 μg/mL的秋水仙素處理羚牛骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞6 h。細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶(0.25%胰蛋白酶，0.04% EDTA)消化后，加入低滲溶液(0.075 mol/L KCl)重懸，37 ℃處理30 min后離心去上清。加入固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1，體積比)固定細(xì)胞3次，制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液滴至高度大于10 cm的 -20 ℃預(yù)冷載玻片上，風(fēng)干后用染色液(Giemsa∶PBS=1∶9)染色[22]。顯微鏡下觀察染色體形態(tài)并進(jìn)行組型分析。

1.2.3 細(xì)胞表面抗原鑒定 采用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原進(jìn)行鑒定[23]。 0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，10% FBS中和培養(yǎng)基，PBS洗滌3次。用移液器反復(fù)吹打，獲得均勻細(xì)胞懸液。將細(xì)胞稀釋至濃度為0.5～1×106mL-1后用2% PFA固定細(xì)胞20 min，PBS洗滌3次，采用以下抗體進(jìn)行流式細(xì)胞免疫反應(yīng)：CD14-FITC(Fluorescein isothiocyanate),CD19-FITC,CD34-FITC,CD45-FITC,HLA-DR-FITC,CD105-PE(phycoerythrin),CD166-PE,CD44-PE,CD73-PE,CD90-PE(表1)。使用安裝FACSComp軟件的FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

表1 流式細(xì)胞免疫反應(yīng)使用抗體Table 1 Antibodies for flow cytometry

1.2.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的定向分化培養(yǎng) 細(xì)胞的成脂分化培養(yǎng)[24]：將P3代間充質(zhì)干細(xì)胞消化處理制成單細(xì)胞懸液。將8×104個(gè)細(xì)胞接種于直徑3.5 cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h。隨后將培養(yǎng)基替換為成脂分化培養(yǎng)基(含10% FBS的DMEM ,500 μmol/L IBMX,1 μmol/L DM,10 μmol/L IS,200 μmol/L ID)進(jìn)行定向誘導(dǎo)培養(yǎng)，期間每周更換2次培養(yǎng)基。21 d后，PBS沖洗2次，4% PFA固定10 min。用染色液(0.3% Oil Red O溶于60%異丙醇)處理細(xì)胞20 min后，60%乙醇漂洗2次，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞分化情況。

細(xì)胞的成骨分化培養(yǎng)[25]：P3代細(xì)胞消化處理后，將5×104個(gè)細(xì)胞接種于直徑3.5 cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h。用成骨分化培養(yǎng)基(含10% FBS的DMEM,0.1 μmol/L DM,300 μmol/L AA,10 mmol/L β-GP)進(jìn)行定向誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d。經(jīng)固定處理后的細(xì)胞用Alizarin Red S染色30 min，漂洗后觀察細(xì)胞狀態(tài)。

細(xì)胞的成軟骨分化培養(yǎng)[26]：P3代細(xì)胞消化處理后，將2×105個(gè)細(xì)胞接種于直徑3.5 cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h。用成軟骨分化培養(yǎng)基(含10% FBS的DMEM,0.1 μmol/L DM,300 μmol/L AA,10 ng/mL TGF-β3,1% 100×ITS)進(jìn)行定向誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d。經(jīng)固定處理后的細(xì)胞染色30 min(1% Alcian blue溶于3%乙酸)，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的定向分化狀態(tài)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 所有試驗(yàn)至少獨(dú)立進(jìn)行3次。數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差” 的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 羚牛骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與核型分析

光鏡下可見(jiàn)成纖維細(xì)胞狀的羚牛BM-MSCs貼壁生長(zhǎng)，中間密度大，隨著代數(shù)增加逐漸向外擴(kuò)散(圖1-A)。傳代培養(yǎng)至P5時(shí)，細(xì)胞仍維持正常形態(tài)(圖1-B)。觀察統(tǒng)計(jì)50 個(gè)分散較好的中期細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)從羚牛骨髓分離出的MSCs染色體數(shù)目正常(2n=52)(圖1-C)。常染色體中有4對(duì)近中著絲點(diǎn)染色體和21對(duì)端著絲點(diǎn)染色體；在性染色體中，X染色體為端著絲點(diǎn)染色體，Y染色體長(zhǎng)度最小，為近中著絲點(diǎn)染色體(表2)。

A. P1代 BM-MSCs 形態(tài); B. P5 代 BM-MSCs 形態(tài); C. 染色體組型分析。 標(biāo)尺為100 μmA. Cell morphologies at P1; B.Cell morphologies at P5; C. Karyotype analysis of takin BM-MSCs. Bar=100 μm圖1 羚牛骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)與染色體組型分析Fig.1 Morphological and karyotype analysis of takin BM-MSCs

表2 羚牛染色體相對(duì)長(zhǎng)度Table 2 Relative length of chromosomes in takin

2.2 羚牛骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原分析

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD105、CD166、CD44、CD73、CD90、CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR。羚牛BM-MSCs對(duì)特異性表面標(biāo)記CD105(97.1%)、CD73(95.9%)和CD90(97.6%)呈陽(yáng)性，對(duì)CD14(單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞標(biāo)記，3.1%)、CD19(b細(xì)胞標(biāo)記，2.4%)、CD34(造血干細(xì)胞標(biāo)記，1.4%)、CD45(泛白細(xì)胞標(biāo)記，1.8%)和HLA-DR(3.7%)呈陰性。此外，羚牛BM-MSCs對(duì)CD166(94.7%)和CD44(97.2%)均呈陽(yáng)性。同型對(duì)照顯示非特異性熒光(圖2)。

圖2 羚牛骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面特異性抗原的鑒定Fig.2 Identification of surface specific antigens of takin BM-MSCs

2.3 羚牛骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化潛能的檢測(cè)

為了鑒定羚牛BM-MSCs的分化潛能，將細(xì)胞分別置于成脂、成骨與成軟骨分化培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)分化。

細(xì)胞的成脂分化：與對(duì)照組細(xì)胞相比，分化誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細(xì)胞生長(zhǎng)速度逐漸下降并停止。分化前細(xì)胞呈正常梭形(圖3-A)，分化誘導(dǎo)21 d后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變(圖3-B)。Oil Red O染色呈陽(yáng)性，可見(jiàn)橘紅色的空泡狀脂滴(圖3-E)。結(jié)果表明，羚牛BM-MSCs在體外具有向脂肪細(xì)胞分化的潛力。

細(xì)胞的成骨分化：置于分化培養(yǎng)基中的細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞(圖3-A)相比，生長(zhǎng)逐漸放緩，最終停止生長(zhǎng)。細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后呈方形或五角形(圖3-C)。Alizarin Red染色可觀察到骨細(xì)胞外基質(zhì)沉積(圖3-F)，這表明細(xì)胞具有成骨分化潛能。

細(xì)胞的成軟骨分化：BM-MSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化后可見(jiàn)形態(tài)均一，呈三角形、不規(guī)則多邊形或鋪路石樣的軟骨細(xì)胞(圖3-D)。誘導(dǎo)21 d后軟骨基質(zhì)增多，經(jīng)Alcian blue染色后呈現(xiàn)藍(lán)色(圖3-G)；未誘導(dǎo)組細(xì)胞呈梭形生長(zhǎng)(圖3-A)。上述結(jié)果顯示羚牛BM-MSCs具有成軟骨分化潛能。

3 討 論

MSCs已在小鼠[27]、大鼠[28]、兔子[29]、狗[30]、貓[31]、馬[32]、牛[33]、山羊[34]、綿羊[35]等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 或家畜中實(shí)現(xiàn)分離與體外培養(yǎng)。然而，包括羚牛在內(nèi)的瀕危野生動(dòng)物MSCs的相關(guān)研究較少。本研究成功分離的羚牛MSCs具有以下特性：維持正常核型的MSCs表現(xiàn)出貼附塑料表面生長(zhǎng)的特性，細(xì)胞表面存在特異性抗原表達(dá)，具有多向分化潛能。上述研究結(jié)果均符合國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)(the International Society for Cellular Therapy,ISCT)宣布的MSC定義最低標(biāo)準(zhǔn)[36]，這表明本研究從正常死亡羚牛骨髓中分離的細(xì)胞系確為MSCs。

MSCs可以從多種器官或組織中獲得，包括胎兒肝臟、骨髓、血液和羊水、出生時(shí)的臍帶組織和臍血、青年時(shí)發(fā)育中的牙齒、成年時(shí)的骨髓組織和脂肪組織[1]。研究顯示，來(lái)源于同一物種的不同組織或器官的MSCs在增殖能力、分化能力和/或其他生物學(xué)特性方面表現(xiàn)出不同的特征[37]。從瀕危動(dòng)物分離的MSC活細(xì)胞冷凍保存技術(shù)是目前野生動(dòng)物遺傳資源保護(hù)的有效策略之一[5]。因此，本研究成功分離鑒定的羚牛BM-MSCs可作為種質(zhì)資源保護(hù)的種子細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)羚牛遺傳資源的長(zhǎng)期保存。然而，已有研究表明，來(lái)自臍帶的MSCs比骨髓等其他組織來(lái)源的MSCs具有更強(qiáng)的分化能力，易獲取且無(wú)傷害性，更加適合瀕危物種體外試驗(yàn)與細(xì)胞治療相關(guān)研究[37-38]。因此，未來(lái)筆者將進(jìn)一步嘗試提取臍帶組織以及其他來(lái)源的MSCs，為開(kāi)展細(xì)胞水平的野生瀕危動(dòng)物保護(hù)研究提供更多有效資源。

MSCs具有成脂、成骨與成軟骨多向分化潛能。研究表明，不同因子影響MSCs的多向分化。目前已有報(bào)道稱(chēng)，DM，IS，ID和IBMX或4 種試劑聯(lián)合使用時(shí)可促進(jìn)MSCs向脂肪細(xì)胞的分化[39]。DM、TGF、AA等因子對(duì)于MSCs的成骨分化以及成軟骨分化存在一定的影響[40]。TGF-β1是目前調(diào)控MSCs分化的首選生長(zhǎng)因子之一。不同濃度的TGF-β1對(duì)MSCs分化的誘導(dǎo)效率不同，適宜濃度時(shí)可有效促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞的分化；而TGF-β2和TGF-β3則在促進(jìn)MSCs的軟骨分化上強(qiáng)于TGF-β1，主要表現(xiàn)在促進(jìn)葡糖胺聚糖和Ⅱ型膠原聚集方面[41]。作為T(mén)GF-β超家族成員之一的骨形成蛋白對(duì)于MSCs的誘導(dǎo)效應(yīng)具有特異性[42-44]和劑量依賴(lài)性[45-46]。此外，普遍存在于多種器官組織中的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子持續(xù)釋放時(shí)可增強(qiáng)軟骨分化。研究顯示，用含成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(10 ng/mL)的培養(yǎng)基MSCs時(shí)可提高細(xì)胞增殖速率[47]。因此，為了促進(jìn)羚牛MSCs的增殖和多向分化，可以考慮將適宜濃度的生長(zhǎng)因子作為細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)組成部分，以充分發(fā)揮MSCs的分化再造潛能。

體細(xì)胞核移植技術(shù)目前已成為多個(gè)物種繁殖和保護(hù)的重要途徑，在多種馴化物種和非繁殖或死亡的動(dòng)物中成功實(shí)施[48]。利用體細(xì)胞核移植技術(shù)融合產(chǎn)生新個(gè)體的相關(guān)研究表明，該項(xiàng)技術(shù)可能成為保護(hù)瀕危野生物種的一種有效工具[5]。成纖維細(xì)胞在生物體中的數(shù)量較多，它們的分離和培養(yǎng)也比其他細(xì)胞類(lèi)型更容易?；谏鲜鲈颍衫w維細(xì)胞在生物醫(yī)學(xué)研究中具有巨大潛力，也成為體細(xì)胞核移植技術(shù)的常見(jiàn)供體細(xì)胞[49]。然而，多項(xiàng)研究證實(shí)MSCs也可成為合適的核供體[5]。利用牛的羊水MSCs和脂肪MSCs生產(chǎn)克隆牛的研究表明，MSCs對(duì)于提高牛的核移植效率具有重要意義[50]。特別是，Su等[51]和Kwong等[52]分別對(duì)蒙古綿羊和山羊的BM-MSCs與成纖維細(xì)胞作為不同核供體制備的克隆胚胎體外發(fā)育能力進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，利用BM-MSCs克隆的胚胎具有較高的卵裂率和囊胚率。這表明BM-MSCs可作為大型動(dòng)物自體研究的良好細(xì)胞類(lèi)型，并將成為體細(xì)胞克隆和未來(lái)轉(zhuǎn)基因研究的寶貴材料。此外，有研究將羚牛耳成纖維細(xì)胞與去核牛卵母細(xì)胞融合，產(chǎn)生羚牛胚胎，但發(fā)育率較低[53]。近年來(lái)，對(duì)于羚牛的分類(lèi)學(xué)研究表明該物種與山羊、綿羊等羊亞科動(dòng)物的親緣關(guān)系最近，存在高度保守性[14]。因此，在未來(lái)的研究中，羚牛MSCs將有望在種內(nèi)與種間體細(xì)胞核移植技術(shù)上發(fā)揮巨大潛力。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究成功分離鑒定羚牛骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，為羚牛生物多樣性保護(hù)研究提供依據(jù)。未來(lái)應(yīng)從羚牛不同組織MSCs的分離培養(yǎng)以及體外胚胎克隆方面繼續(xù)開(kāi)展深入研究，為瀕危野生動(dòng)物資源保存奠定良好基礎(chǔ)。