口腔鱗狀細(xì)胞癌中MYLK3的表達(dá)及其臨床病理意義

馮麗媛 高 峰 胡 潔 曾 婧 白 楊 王大維

肌球蛋白輕鏈激酶3（myosin light chain kinase 3，MYLK3）是肌球蛋白輕鏈激酶家族的一員，由Seguchi O 等[1]于2007 年發(fā)現(xiàn)，其對于心臟收縮和肌節(jié)組織的形成至關(guān)重要。前列腺、睪丸、腎、肺等多種正常組織中，均發(fā)現(xiàn)有MYLK3 低水平的表達(dá)，但最近的臨床研究及實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在其在卵巢癌、肝癌及乳腺癌中存在異常表達(dá)[2，3，4]。目前國內(nèi)外尚未見針對MYLK3 在口腔鱗狀細(xì)胞癌中具體表達(dá)情況的相關(guān)報導(dǎo)。本研究采用免疫組織化學(xué)ABC 法觀察和檢測其在OSCC 和正常口腔粘膜中的表達(dá)情況，分析其與臨床病理指標(biāo)之間是否存在相關(guān)性，并初步探討及闡述其臨床病理意義。

資料和方法

1.臨床資料：在取得倫理委員會批準(zhǔn)后自本院病理科選取1991 年到2020 年間密封保存的蠟塊，其中正?？谇徽衬ど掀?0 例，OSCC 65 例（包括舌癌20 例、頰癌18 例、牙齦癌27 例），年齡24～80 歲成年患者，男34 例，女31 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10 例，55 例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；15 例低分化，50 例中高分化（根據(jù)世界衛(wèi)生組織分類標(biāo)準(zhǔn)，分化程度被分為高分化、中分化、低分化和未分化，為統(tǒng)計方便將高分化和中分化合并為中高分化，低分化和未分化合并為低分化）。入選實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)：①腫瘤原發(fā)于舌部、頰部或牙齦；②術(shù)前經(jīng)2 名副高及以上職稱的病理專家病理診斷為鱗狀細(xì)胞癌；③術(shù)前未行放、化療等其他輔助治療。

2.試劑與實(shí)驗(yàn)方法：間隔5 μm 對石蠟包埋的組織進(jìn)行連續(xù)切片，常規(guī)HE 染色和免疫組織化學(xué)ABC 染色。福建邁新生物試劑有限公司購買免疫組化檢測試劑盒，兔抗人MYLK3 多克隆抗體試劑。免疫組織化學(xué)法染色步驟：組織切片進(jìn)行脫蠟水化，3% H2O2甲醇對內(nèi)源性過氧化物酶進(jìn)行滅活，之后依次在切片中滴加一抗、二抗、三抗試劑，待DAB 顯色后用蘇木精試劑進(jìn)行復(fù)染，常規(guī)方法進(jìn)行脫水、透明、封片。用PBS 代替一抗作為空白對照。

3.染色結(jié)果判斷：由兩名計數(shù)者雙盲進(jìn)行閱片。每張切片隨機(jī)選取5 個視野，每個視野計數(shù)100 個細(xì)胞，根據(jù)染色程度和陽性細(xì)胞所占比例綜合評分。無黃染為0 分，輕度黃染1 分，中度黃染2 分，重度黃染3 分；陽性細(xì)胞＜5%為0 分，5%～25%為1 分，25%～75%為2 分，≥75%為3 分。0～1 分記為陰性，2～3 分記為陽性。

4.統(tǒng)計學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 26.0 版本統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，正常粘膜與OSCC 之間、不同臨床病例特征組之間MYLK3 的差異表達(dá)采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有顯著意義。

結(jié) 果

1.MYLK3 在正?？谇徽衬ぜ癘SCC 中的表達(dá)情況：MYLK3 在高分化口腔鱗狀細(xì)胞癌及低分化口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)明顯高于正?？谇徽衬そM織（圖1～3）。口腔鱗狀細(xì)胞癌組和正?？谇徽衬そM中陽性表達(dá)率比較差異有顯著性（P＜0.05，表1）。

圖1 MYLK3 在正?？谇徽衬ぶ械谋磉_(dá)（ABC ×200）

表1 MYLK3 在正?？谇徽衬ず涂谇击[狀細(xì)胞癌中的表達(dá)

圖2 MYLK3 在高分化口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)（ABC ×200）

圖3 MYLK3 在低分化口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)（ABC ×200）

2.MYLK3 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中MYLK3 的陽性表達(dá)率為80%，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的MYLK3 陽性表達(dá)率為27%，二者相比較有顯著差異（P＜0.05）；低分化組中MYLK3 陽性表達(dá)率67%，高分化組陽性表達(dá)率26%，二者相比有顯著差異（P＜0.05）。MYLK3 在OSCC 中的表達(dá)情況與患者腫瘤大小、部位以及患者的年齡、性別等無相關(guān)性（P＞0.05，表2）。

表2 MYLK3 表達(dá)與口腔鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系

討 論

MYLK3 基因是一種蛋白編碼基因，位于16 號染色體（16q11.2），其在免疫應(yīng)答信號傳導(dǎo)和肌動蛋白細(xì)胞骨架的形成中具有重要作用[2]。MYLK3 表達(dá)上調(diào)時，可以促使心臟收縮增強(qiáng)及肌節(jié)形成，下調(diào)或缺失時可導(dǎo)致心臟收縮減弱及肌節(jié)瓦解破壞，明顯的肌節(jié)失調(diào)可促使心肌細(xì)胞衰竭[5]，繼而通過多種方式誘導(dǎo)心力衰竭的發(fā)生[6，7]，有相關(guān)研究顯示MYLK3 基因的突變還與家族性擴(kuò)張型心肌病之間存在明顯的關(guān)系[8，9]。除此之外，MYLK3 可能是敗血癥發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵基因，通過多種方式參與了敗血癥的發(fā)病機(jī)制[10]。目前研究還發(fā)現(xiàn)，卵巢癌中MYLK3甲基化程度與患者預(yù)后呈正相關(guān)，MYLK3 基因的甲基化與病人的生存率相關(guān)，伴有MYLK3 甲基化率高的患者通過徹底的手術(shù)治療有較好的預(yù)后，而甲基化率較低的患者經(jīng)過前期徹底的手術(shù)治療后預(yù)后較差[2]；通過抑制MYLK3 高表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡[3]；MYLK3 基因的缺失對于乳腺癌細(xì)胞的遷移起到促進(jìn)的作用[4]；Chen.L 等發(fā)現(xiàn)MYLK 基因從正常病人組到癌前病變組再到胃癌組甲基化率逐漸提高[11]。以上討論表明，MYLK3 在不同類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，并與部分腫瘤預(yù)后相關(guān)。

王娟等研究發(fā)現(xiàn)在口腔白斑中MYLK3 表達(dá)上升，推測其可能參與口腔白斑的發(fā)生[12]，而口腔白斑屬癌前病變[13]，大約4%的口腔白斑可在吸煙，飲酒等多種因素的促進(jìn)作用下發(fā)展為OSCC，其轉(zhuǎn)變?yōu)镺SCC 的風(fēng)險比正常人平均高出近100 倍[14]，因而我們推斷，MYLK3 可能參與了OSCC 的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)OSCC 中MYLK3 的表達(dá)較正?？谇徽衬ぴ黾?，二者陽性表達(dá)率差異有顯著性（P＜0.05），進(jìn)一步提示MYLK3 在OSCC 的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。目前可知，口腔鱗癌組織中粘著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）表達(dá)顯著增強(qiáng)，其參與細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的調(diào)控[12]，Horton ER 等[15]發(fā)現(xiàn)FA（focal adhesion，F(xiàn)A）中有粘著斑激酶的特定位點(diǎn)。FAK 可介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)整合素參與下游的信號傳導(dǎo)[16]，從而在細(xì)胞的遷移、增殖[17]、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial- mesenchymal transition，EMT）[18]以及血管生成[19]等過程中發(fā)揮不可或缺的作用。研究表明，肺癌[20]、肝癌[21]、胸腺癌[22]、結(jié)直腸癌[23]等惡性腫瘤以及口腔白斑[24]中普遍存在FAK 的異常表達(dá)。MYLK3是粘著斑信號通路的重要組成部分，兩者于白斑組織中的表達(dá)同時增高[12]，由此推斷，MYLK3 高表達(dá)使肌動蛋白細(xì)胞骨架異常，通過某些方式可能影響粘著斑內(nèi)部結(jié)構(gòu)，致使FAK 無相應(yīng)附著位點(diǎn)，對下游信號傳導(dǎo)產(chǎn)生一定的影響，從而改變對細(xì)胞生長、細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡的調(diào)控，使腫瘤細(xì)胞無限增生，繼而促使腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。但MYLK3 通過何種機(jī)制影響FAK 的表達(dá)及功能，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，有待于我們以后的研究。

Souza-Smith FM 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，MYLK3 可使肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）發(fā)生磷酸化，磷酸化后會導(dǎo)致淋巴管系統(tǒng)平滑肌的收縮，其收縮是通過肌動蛋白肌球蛋白介導(dǎo)的。本研究發(fā)現(xiàn)MYLK3 的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，二者相比，有顯著差異（P＜0.05），這一結(jié)果提示MYLK3 可以作為一個新的預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的生物學(xué)標(biāo)志物，為腫瘤轉(zhuǎn)移以及判斷預(yù)后提供依據(jù)。由此推測，腫瘤中MYLK3 的異常表達(dá)與淋巴收縮異常或許有著一定的關(guān)系，以此來提高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，但其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步探討。

本研究亦顯示低分化組的陽性表達(dá)率（67%）明顯高于高分化組的陽性表達(dá)率（26%），二者相比，有顯著差異（P＜0.05），這一結(jié)果提示，MYLK3 表達(dá)隨著OSCC 惡性程度的增加而增加，加之 MYLK3 與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)，可以認(rèn)為MYLK3 陽性表達(dá)的患者，其腫瘤更具有轉(zhuǎn)移的可能性。

總之，MYLK3 在OSCC 中的表達(dá)較正?？谇徽衬ぶ械谋磉_(dá)有明顯增加。其在OSCC 的發(fā)生、發(fā)展、分化及轉(zhuǎn)移過程中具有非常重要的作用，推測其可以作為一個用于預(yù)測OSCC 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的生物學(xué)標(biāo)志物，MYLK3 陽性表達(dá)者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能性更大。本研究的目的也在于為OSCC 的治療和分子靶向治療提供新的研究思路。