復方黃柏液對糖基化內(nèi)皮細胞增殖遷移成管的影響

陳潤銘 杜玉青 李友山 謝存香 安琪 董學宇

摘要 目的：通過研究復方黃柏液對糖基化內(nèi)皮細胞增殖遷移成管的影響，尋找復方黃柏液治療糖尿病足潰瘍的依據(jù)。方法：為說明晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE），用晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）誘發(fā)內(nèi)皮細胞功能障礙的重要受體，本研究設(shè)置了RT-PCR實驗沉默了RAGE，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默RAGE后，經(jīng)AGEs處理內(nèi)皮細胞，檢測其內(nèi)皮細胞增殖遷移成管作用出現(xiàn)上升，因此檢測RAGE表達水平的變化能作為后續(xù)評價復方黃柏液改善內(nèi)皮細胞功能的重要指標。如果RAGE水平出現(xiàn)下降，就證明內(nèi)皮細胞功能障礙得到了修復，復方黃柏液治療糖尿病足潰瘍是有效的。為了評估內(nèi)皮細胞的增殖能力，設(shè)置CCK-8實驗;用劃痕實驗檢查內(nèi)皮細胞的遷移水平變化;通過成管實驗來測試內(nèi)皮細胞的成管作用;利用蛋白質(zhì)印跡法檢測RAGE蛋白表達水平。結(jié)果：RAGE-3 siRNA沉默效率最好，可用于后續(xù)實驗。與空白組比較，AGEs處理后內(nèi)皮細胞增殖活性、遷移水平、成管作用都下降，RAGE蛋白表達水平上升。與AGEs-BSA處理組比較，沉默RAGE或加入復方黃柏液后均較AGEs處理后內(nèi)皮細胞的增殖遷移成管作用有了提高，RAGE蛋白的表達下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論：復方黃柏液可能通過改善AGEs誘發(fā)的內(nèi)皮細胞功能障礙即促進內(nèi)皮細胞增殖遷移成管來實現(xiàn)對糖尿病足潰瘍的愈合。

關(guān)鍵詞 復方黃柏液;內(nèi)皮細胞;晚期糖基化終產(chǎn)物;糖尿病足潰瘍;增殖;遷移;成管

Effect of Compound Fluid of Cortex Phellodendri on Proliferation，Migration，and Tube Formation of Human Endothelial Cells

CHEN Runming，DU Yuqing，LI Youshan，XIE Cunxiang，AN Qi，DONG Xueyu

（Department of Peripheral Blood Vessels，Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China）

Abstract Objective：This study aims to clarify the mechanism of Compound Fluid of Cortex Phellodendri in treating diabetic foot ulcer based on the influence of the prescription on the proliferation，migration，and tube formation of endothelial cells treated with advanced glycation end products（AGEs）.Methods：In order to show that receptor for advanced glycation end products（RAGE） is an important receptor for AGEs-induced endothelial cell dysfunction，we performed RT-PCR to confirm the silencing of RAGE.We found that the proliferation，migration，and tube forming ability of endothelial cells treated by AGEs improved after the silencing of RAGE.Therefore，RAGE can serve as important index for evaluating the improvement of endothelial cell function by Compound Fluid of Cortex Phellodendri.If RAGE level dropped，it proved that endothelial cell dysfunction had been alleviated and that Compound Fluid of Cortex Phellodendri was effective for diabetic foot ulcer.Cell counting kit-8（CCK-8） assay was employed to evaluate the proliferation of endothelial cells，scratch assay to check the migration of the cells，and tube forming experiment to test the tube forming ability.Western blotting was used to detect the expression level of RAGE protein.Results：The silencing efficiency of siRNA on RAGE-3 was the highest and thus it was used for subsequent experiments.com

pared with normal control group，AGEs treatment decreased the proliferation activity，migration level，and tube forming ability of endothelial cells and increased the RAGE protein level.com7BD29904-7E78-49C3-88D8-9C2070DC7F5F

pared with AGES-BSA treatment group，the proliferation，migration，and tube forming ability of endothelial cells were improved and the expression of RAGE protein was decreased after the addition of Compound Fluid of Cortex Phellodendri or the silencing of RAGE（P<0.05）.Conclusion：Compound Fluid of Cortex Phellodendri may improve the dysfunction of endothelial cells induced by AGEs to relieve diabetic foot ulcers.

Keywords Compound Fluid of Cortex Phellodendri; Endothelial cell; AGEs; Diabetic foot ulcers;Proliferation;Migration;Tube formation

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.08.006

糖尿病足因機體長期處于高糖狀態(tài)導致的足部周圍神經(jīng)病變以及如足部感染、潰瘍或深層組織破壞等外周血管病變，不僅高發(fā)且難愈合。根據(jù)最新的糖尿病足治療指南，我國糖尿病足潰瘍的每年發(fā)病率為8.1%[1]。因為糖尿病足的高發(fā)病率，對其難愈性形成原因的研究越來越受到重視。有研究表明，由于機體長期處于高糖狀態(tài)導致非酶促糖基化反應產(chǎn)生的終末產(chǎn)物也稱晚期糖基化終產(chǎn)物（Advanced Glycation End-products，AGEs），其在體內(nèi)蓄積，損傷內(nèi)皮細胞和組織，導致皮膚自身細胞和基質(zhì)功能不全使糖尿病潰瘍難愈合[2]。血管內(nèi)皮細胞是參與血管生成重要細胞。當組織處于正常狀態(tài)時，內(nèi)皮細胞AGEs低表達，但在糖尿病狀態(tài)下，AGEs與AGEs受體（Receptor for Advanced Glycation End Products，RAGE）水平提高，相關(guān)炎癥介質(zhì)也相應被激活，如炎癥介質(zhì)核因子κB（NF-κB）等。已經(jīng)有研究證實高水平的AGEs會提高炎癥的發(fā)生概率和破壞內(nèi)皮細胞，同時也會誘導動脈壁血管收縮功能障礙，最后形成血管局部微循環(huán)障礙[3]。因此降低內(nèi)皮細胞AGEs及RAGE的表達水平，改善AGEs引起的內(nèi)皮功能障礙，極大可能對由內(nèi)皮功能障礙引起的難愈性糖尿病足潰瘍具有治療作用。

復方黃柏液是我國骨髓炎專家謝景龍醫(yī)生總結(jié)多年臨床經(jīng)驗所得。其對糖尿病潰瘍具有顯著療效。王寧等[4]實驗證明復方黃柏液對感染抗甲氧西林金黃色葡萄的糖尿病足潰瘍療效好。李友山和楊博華[5]通過外用復方黃柏液和康復新液治療糖尿病足潰瘍療效對比，發(fā)現(xiàn)復方黃柏液對于治療濕熱毒盛型糖尿病足有顯著療效。AGEs是引起血管內(nèi)皮損傷的重要物質(zhì)，是糖尿病足的病理基礎(chǔ)。而復方黃柏液治療糖尿病足潰瘍是否與參與改善AGEs誘發(fā)的內(nèi)皮細胞功能仍然未知。本研究基于此前提通過觀察復方黃柏液對AGEs處理后內(nèi)皮細胞增殖遷移成管的影響來探究復方黃柏液與AGEs關(guān)系，為復方黃柏液治療糖尿病足潰瘍提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 內(nèi)皮細胞（CTCC公司，批號：CL-463）。

1.1.2 藥物 復方黃柏液（山東漢方制藥，國藥準字Z10950097）。

1.1.3 試劑與儀器 EBSS培養(yǎng)基（Hyclone，德國，批號：SH30253.01），F(xiàn)BS（Hyclone，德國，批號：SH30084.03），Trizol提取試劑盒（中國索萊寶公司，批號：R1200），cDNA合成試劑盒（中國生工生物，批號：B532445），AGEs-BSA（BioVision，美國，貨號：2221-10），細胞計數(shù)試劑（Cell Counting Kit-8，CCK8）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C0037），Matrigel（BD Incorporated，美國，批號：354248），BCA蛋白定量試劑盒（廣州賽國科技公司，批號：BL521A），麗春紅S（索萊寶公司，批號：P8330），聚偏二氟乙烯膜（Polyvinylidene Fluoridepvdf，Pvdf）（Millipore公司，美國，型號：HATF00010）。辣根酶標記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋公司，批號：ZB2301），辣根酶標記山羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋公司，批號：ZB2305），RAGE（Abcam，英國，批號：ab3611），GAPDH（Proteintech，美國，批號：60004-1-Ig）。細胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific，美國，型號：8000），酶標檢測儀（Thermo Scientific，美國，型號：MK3）低速離心機（上海盧湘儀公司，型號：TDZ4B-WS）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將設(shè)置6個分組。A為空白組，B為AGEs-BSA組（100 μg/mL），C為AGEs-BSA+復方黃柏液1∶100組，D為AGEs-BSA+復方黃柏液1∶200組，E為AGEs-BSA+復方黃柏液1∶400組，F(xiàn)為AGEs-BSA+RAGE siRNA組。

1.2.2 給藥方法 當內(nèi)皮細胞處于對數(shù)生長時，調(diào)整細胞濃度為2×105個細胞/mL，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 mL，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。A組僅保留培養(yǎng)基;B組給予100 μg/mL AGEs-BSA處理;C組、D組、E組內(nèi)皮細胞給予100 μg/mL AGEs-BSA分別與濃度2 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL的復方黃柏涂液（即原液1∶100、原液1∶200、原液1∶400）處理;F組內(nèi)皮細胞給予100 μg/mL AGEs-BSA后與RAGE siRNA處理7BD29904-7E78-49C3-88D8-9C2070DC7F5F

1.2.3 檢測指標與方法 1）RT-PCR篩選靶向siRNA序列：用Lipofectamine RNAi MAX Reagent與siRNA NC、RAGE-1、RAGE-2、RAGE-3進行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)24 h后收樣做RT-PCR。用Trizol提取試劑盒抽提細胞內(nèi)總RNA;用第一鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA;以ddH2O、SybrGreen qPCR Master Mix、Forward primer、Reverse primer、cDNA混勻配置Real time-PCR反應液。充分混勻，在以下條件下完成40個循環(huán)：94 ℃10 min，（94 ℃20 s，55 ℃20 s，72 ℃20 s）。最后采用2-△△Ct法計算各組RAGE相對表達量。其中實驗中用的引物序列為RAGE（human）-RT-F GACCAAGTCCAACTACCG、RAGE（human）-RT-R GCTTCCCTCTGACACACA、Gapdh（human）-RT-R AGGGGCCATCCACAGTCTTC、Gapdh（human）-RT-F AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計。2）CCK8檢測血管內(nèi)皮增殖情況：將內(nèi)皮細胞以細胞濃度為5×104 cells/mL接種于每孔100 μL的96孔培養(yǎng)板，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。上述組別給藥24 h后，每孔加入20 μL的CCK8，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育4 h。最后，使用酶標儀在450 nm處測量吸光度值以測量細胞活力。3）細胞劃痕實驗：將要用到的器材提前紫外線照射30 min，用marker筆在3.5 cm皿背后劃好均勻的橫線作標記，將3×105個細胞懸液加入皿中。保證過夜細胞密度達到90%，次日用200 μL槍頭盡量垂直于細胞平面沿線劃痕。用磷酸鹽緩沖液（Phosphate-buffered Saline，PBS）沖洗細胞3次。按照上述分組給藥24 h后，用顯微鏡觀察細胞遷移情況并拍照。4）成管實驗：融化Matrigel，預冷槍頭盒、EP管和96孔板。以每孔50 μL的量將基質(zhì)膠添加到預冷的96孔板中。將板置于5%CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min。按照上述分組準備懸液，用胰蛋白酶消化細胞，細胞消化后再將懸液濃度調(diào)整為1×105 cell/mL。將以每孔1.0×104個細胞的形式添加到Matrigel包被的96孔板中，并在37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后加入鈣黃綠素Calcein AM染色;染色30 min后于熒光顯微鏡下觀察拍照。5）蛋白質(zhì)印跡法實驗：按照上述分組給藥24 h后，用RIPA裂解細胞，并加入適量的PMSF，置于冰上裂解、離心后棄上清提取細胞總蛋白。繪制標準曲線得到各組蛋白含量，根據(jù)蛋白定量結(jié)果上樣、聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium Dodecyl Sulate（SDS）-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）、轉(zhuǎn)移到PVDF膜。用麗春紅染色檢測轉(zhuǎn)膜是否成功。封膜及孵育抗體、顯色拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法 用SPSS 16.0進行數(shù)據(jù)分析，以均數(shù)±標準差（±s）表示所有數(shù)據(jù)，2組間比較采用t檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA序列篩選結(jié)果 RAGE-3 siRNA沉默效率最高，RT-PCR結(jié)果顯示，與空白組比較，RAGE-1 siRNA，RAGE-2 siRNA，RAGE-3 siRNA 3條siRNA轉(zhuǎn)染細胞后，RAGE的表達均有不同程度的下降（均P<0.01），其中RAGE-3 siRNA的RAGE表達較其他組最少，因此后續(xù)實驗選用RAGE-3 siRNA。見表1。

2.2 復方黃柏液能促進AGEs處理后內(nèi)皮細胞增殖

根據(jù)測得的A值分析細胞活性狀況：與空白組比較，AGEs-BSA細胞活力明顯下降。而使用復方黃柏液的組較AGEs-BSA組細胞活力有提高（P<0.05）;但復方黃柏液濃度較低的2組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與AGEs-BSA組比較，作為AGEs的受體RAGE，將其沉默后，細胞活力有提高（P<0.05）。見表2。

2.3 復方黃柏液促進AGEs處理后細胞遷移

各分組遷移情況在顯微鏡下觀察，與空白組比較，AGEs-BSA組細胞遷移率明顯下降（P<0.01）。與AGEs-BSA組比較，加入復方黃柏液或?qū)GEs的受體RAGE沉默后，細胞遷移水平較之有提高（P<0.05）;但在這種差異僅在復方黃柏液濃度最高的一組才有體現(xiàn)。見圖1，表3。

2.4 復方黃柏液促進AGEs處理后細胞成管作用? 與空白組比較，AGEs-BSA成管作用減弱（P<0.01）。與AGEs-BSA組比較，加入復方黃柏液或沉默AGEs的受體RAGE，細胞成管作用增強（P<0.05，P<0.01）;但復方黃柏液濃度最低的一組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖2，表4。

2.5 復方黃柏液使RAGE的蛋白表達下降

與空白組比較，AGEs-BSA組的RAGE的蛋白表達上升（P<0.01）。與AGEs-BSA組比較，加入復方黃柏液或?qū)AGE基因沉默后，RAGE的蛋白表達下降（P<0.05）。見圖3，表5。

3 討論

糖尿病足潰瘍難愈合一直是治療難題。目前主要治療方法是負壓閉式引流、清創(chuàng)術(shù)、截肢手術(shù)等，但費用高昂，有的必須住院治療，有嚴格的適應證等缺點。中醫(yī)藥治療糖尿病足潰瘍有著獨特的經(jīng)驗，其中的外治法是其核心所在。塌漬法是最常用來治療糖尿病足的外治法，而復方黃柏液是目前臨床上最常被用來塌漬治療糖尿病足潰瘍的外用試劑。復方黃柏液是一種中藥復方溶液，內(nèi)含黃柏、金銀花、連翹、蒲公英、蜈蚣，能夠清熱解毒，外用則能治療陽性瘡瘍，能夠明顯緩解由熱毒郁積所致紅腫熱痛的癥狀。其中蜈蚣擅長鉆縫穿隙，取蜈蚣爬行之性，在人體運用內(nèi)可通行臟腑，外可達經(jīng)絡(luò)，可以治療一切瘡瘍腫毒[6]。諸藥合用，藥少力專，適用于熱毒熾盛，熱盛肉腐的陽性瘡瘍破潰期。糖尿病本因機體陰虛燥熱而成，糖尿病血糖控制不佳說明此時體內(nèi)長期處于陰虛內(nèi)熱，日久傷氣，氣虛則無力運血形成血瘀，瘀久化熱，熱盛肉腐，發(fā)于足部肌肉，則為糖尿病足潰瘍。臨床多運用復方黃柏液濕敷創(chuàng)面治療糖尿病足潰瘍，這樣藥液能夠直接進入熱毒聚集破潰的創(chuàng)面，具有清熱解毒消腫，通絡(luò)止痛的功效。徐炯[7]以復方黃柏液作為觀察組，生理鹽水作為對照組，觀察二者對糖尿病足潰瘍的影響，證實了復方黃柏液具有改善患者糖尿病足潰瘍狀況的作用。馬紅霞和殷元萬[8]以復方黃柏液作為觀察組，康復新液作為對照組治療糖尿病足潰瘍，復方黃柏液療效明顯優(yōu)于康復新液?，F(xiàn)代醫(yī)學在糖尿病足中發(fā)現(xiàn)了銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌等菌群，認為可以通過抑制病原菌來治療糖尿病足潰瘍[9]。而復方黃柏液也被發(fā)現(xiàn)具有明顯抑制這些細菌生長的作用[10]。但目前復方黃柏液對糖尿病足潰瘍的具體作用機制仍未知。7BD29904-7E78-49C3-88D8-9C2070DC7F5F

糖尿病足潰瘍一旦無法控制有極大可能發(fā)生截肢，目前認為糖尿病足潰瘍難愈合可能與AGEs、內(nèi)皮細胞相關(guān)。當人體長期處于高糖狀態(tài)，體內(nèi)的蛋白質(zhì)與還原糖、脂質(zhì)等物質(zhì)會發(fā)生非酶促反應而產(chǎn)生AGEs。血管內(nèi)皮細胞是高血糖損傷的主要細胞。內(nèi)皮細胞損傷后會出現(xiàn)血管通透性提高、細胞體積增大、血管破裂出血、管腔狹窄閉塞導致組織血流量減少，最終組織會出現(xiàn)缺血壞死引發(fā)糖尿病微血管病變。因此內(nèi)皮細胞的改變是糖尿病足早期病變的病理基礎(chǔ)[11]。除此之外，內(nèi)皮細胞還是血管新生的關(guān)鍵細胞，能夠參與血管的再生過程。血管生成是由多道程序組成的，它囊括了血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、成管以及毛細血管發(fā)芽等[12-13]。高濃度的AGEs會引發(fā)內(nèi)皮細胞的紊亂[14]。Li等[15]認為AGEs通過協(xié)調(diào)內(nèi)皮細胞中的ARHGAP18/RhoA信號通路來激活核因子κB信號通路，影響VE-鈣黏蛋白和緊密連接蛋白的結(jié)構(gòu)和形態(tài)，引起內(nèi)皮細胞皺縮，內(nèi)皮細胞通透性增加，最后破壞內(nèi)皮細胞的活性。邸鐵濤等[16]認為AGEs能導致血管內(nèi)皮生長因子的減少，使?jié)冎醒茉偕щy。Ando等[17]的研究表明AGE-RAGE介導的活性氧的產(chǎn)生導致一氧化氮的減少，而一氧化氮不僅會抑制血管壁細胞中的炎癥增殖反應，而且還會在體內(nèi)發(fā)揮抗血栓形成和內(nèi)皮細胞的保護特性。因此一氧化氮減少會帶來內(nèi)皮細胞功能障礙。Adamopoulos等[18]認為AGE可以影響細胞外基質(zhì)組分的結(jié)構(gòu)和功能，并通過與RAGE結(jié)合誘導內(nèi)皮細胞激活了促絲裂原活化的蛋白激酶（Mitogen-activated Protein Kinase，MAPK）。隨后，炎癥介質(zhì)核因子κB被激活，導致促炎癥和氧化應激介質(zhì)的上調(diào)，最終導致內(nèi)皮細胞失去穩(wěn)態(tài)，產(chǎn)生有害的血管效應?；罨鞍?1（Activating Protein-1，AP-1）轉(zhuǎn)錄因子也可通過AGE/RAGE/MAPK信號軸被激活，并與核因子κB協(xié)同誘導促炎基因的表達。綜上所述，AGEs能夠通過多途徑、多方面來破壞內(nèi)皮細胞組分，使內(nèi)皮細胞的凋亡加快，最終使血管再生困難，是糖尿病足難以愈合的關(guān)鍵因素。

AGEs-BSA是AGEs的理想模型，因為人血白蛋白與牛血清白蛋白具有高度同源性的氨基酸序列，且價格較低制備方便[19]。根據(jù)信號轉(zhuǎn)導途徑分類，有3種受體能夠識別AGEs與其結(jié)合，分別是由（a）AGE-R1 80K-H，AGE-R2 OST-48和AGE-R3 galectin-3組成的AGE-R復合物，（b）RAGE和（c）CD36屬于SR-B（巨噬細胞清除劑受體型B）。而RAGE主要表達于血管與內(nèi)皮細胞，可用于研究AGEs與內(nèi)皮細胞之間的關(guān)系，因此主要討論RAGE[20]。除此之外，AGEs主要通過與其受體RAGE結(jié)合來損傷細胞[21]，為了闡明AGEs與受體RAGE結(jié)合對細胞的損傷，我們特意利用siRNA沉默受體RAGE的表達。結(jié)果表明，AGEs能降低內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、成管作用，而加入復方黃柏液或沉默受體RAGE后，原本降低的增殖、遷移、成管作用有了提高，但實驗中也發(fā)現(xiàn)低濃度的復方黃柏液，如實驗中的1∶200、1∶400，相對AGEs-BSA組差異沒有統(tǒng)計學意義（P>0.05）。這可能也說明了復方黃柏液要發(fā)揮治療糖尿病足潰瘍的作用可能還需要一定的藥物濃度?？傊瑥头近S柏液能改善糖尿病足AGEs的蓄積，對治療糖尿病足潰瘍有一定療效。此外，我們還通過蛋白質(zhì)印跡法實驗印證了復方黃柏液對RAGE的影響，結(jié)果顯示RAGE表達出現(xiàn)下降，這也說明復方黃柏液能夠通過降低RAGE表達，阻斷AGEs與受體RAGE結(jié)合，減少AGEs對機體的損傷。

綜上所述，糖尿病足患者由于身體長期處于高糖狀態(tài)導致AGEs的蓄積，而AGEs的積蓄破壞了在血管新生發(fā)揮重要作用的內(nèi)皮細胞，最終導致了糖尿病足的難愈合。實驗中復方黃柏液能夠改善AGEs處理后內(nèi)皮細胞增殖遷移成管作用，說明它能夠減輕AGEs誘導的內(nèi)皮功能障礙，發(fā)揮促進糖尿病足潰瘍愈合的作用。

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（2021-03-28收稿 本文編輯：張樂杰）

基金項目：國家自然科學基金面上項目（81973849-H2709）作者簡介：陳潤銘（1995.08—），女，碩士生研究生在讀，研究方向：中醫(yī)外科周圍血管，E-mail：chenrm95@163.com

通信作者：李友山（1979.10—），男，博士，主任醫(yī)師，博士研究生導師，研究方向：中醫(yī)外科周圍血管，E-mail：lys4626@sina.com7BD29904-7E78-49C3-88D8-9C2070DC7F5F