骨炭、過磷酸鈣對稀土礦區(qū)停耕稻田土壤細(xì)菌群落的影響

白益軍，董承旭，潘華華，胡忠俊，金德才，金姝蘭,*

1. 上饒師范學(xué)院歷史地理與旅游學(xué)院，上饒 334000 2. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京 100085

稀土是全球戰(zhàn)略性資源。中國是世界稀土資源大國，尤其是離子型稀土儲量、產(chǎn)量占世界首位[1-2]。江西省贛州市是中國離子型稀土資源重地。該市尋烏縣輕離子型稀土礦世界馳名。自1969年在贛南發(fā)現(xiàn)稀土礦并進(jìn)行開采以來，累計開采稀土約30萬t，占全國離子吸附型稀土開采總量的70%以上[3]。離子吸附型稀土礦床裸露于地表，厚度約8～10 m。稀土元素主要以水合離子或羥基水合離子的形式吸附在粘土礦物中?，F(xiàn)已經(jīng)歷3代工藝沿替，即第1代池浸工藝、第2代堆浸工藝和第3代原地浸出工藝[4]。礦產(chǎn)開采導(dǎo)致大量稀土及廢水、廢渣進(jìn)入礦區(qū)周邊水土，污染環(huán)境，部分稻田被迫停耕[5]。

磷(P)是農(nóng)作物生長和高產(chǎn)必不可少的元素。Jin等[6-7]通過盆栽水稻，探討含磷物質(zhì)對土壤稀土元素生物有效性及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，研究表明不同的含磷材料由于性質(zhì)不同，其對土壤細(xì)菌群落的影響不同。細(xì)菌是土壤微生物的主要組成部分。其群落的變化可以揭示土壤生態(tài)環(huán)境的演變[8]。目前關(guān)于施肥如何影響土壤細(xì)菌特性的研究結(jié)論不盡相同。研究認(rèn)為施磷肥可增加細(xì)菌生物量及多樣性[9-12]，促進(jìn)細(xì)菌的生產(chǎn)力和產(chǎn)量，增加細(xì)菌群落的多樣性[13-14]，P改變根際細(xì)菌(rhizobacteria)群落的豐富度、多樣性及群落結(jié)構(gòu)[15-16]，但是有的研究認(rèn)為施磷肥對土壤微生物的組成和結(jié)構(gòu)沒有顯著影響[17]。趙國強等[18]認(rèn)為單施磷肥各土層微生物量、碳、氮含量相對于空白均無顯著差異。Jin等[19]研究發(fā)現(xiàn)，添加含磷材料改變土壤酸堿度(pH)、速效磷(AP)及土壤溶解態(tài)的稀土元素濃度。安鳳秋[20]發(fā)現(xiàn)外源重金屬鉛和鎘的形態(tài)與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)。研究表明高濃度稀土鑭(La)對土壤細(xì)菌產(chǎn)生擬制作用，如顯著抑制微生物的呼吸速率，抑制土壤酶活性，影響微生物生理類群和群落結(jié)構(gòu)[21-22]。研究發(fā)現(xiàn)，土壤稀土含量與理化性質(zhì)的變化顯著影響土壤細(xì)菌多樣性和豐度[23-24]。

Jin等[6-7]研究了種植水稻的前提下，P對土壤細(xì)菌群落的影響，并且發(fā)現(xiàn)了骨炭最具有修復(fù)稀土污染土壤的潛力。稀土開采導(dǎo)致礦區(qū)周邊大量農(nóng)田被迫停耕，需要修復(fù)。郎明[25]的研究表明，P影響根區(qū)生態(tài)位，根區(qū)生態(tài)位是影響細(xì)菌群落的關(guān)鍵因子。但是到目前為止，關(guān)于含磷材料對棄耕農(nóng)田，尤其是稀土污染稻田的影響十分少見。因此，探討含磷材料骨炭、過磷酸鈣對礦區(qū)周邊大量荒田、裸地土壤微生物的影響具有一定的理論和現(xiàn)實意義。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料準(zhǔn)備

樣品采集自尋烏縣文峰鄉(xiāng)石排村輕稀土礦區(qū)停耕3年的土壤，該地經(jīng)緯度為24°52′53″N，115°42′6″E。蛇形取樣，每100 m設(shè)一個采樣點，共采100個樣點，采樣深度20 cm。將土樣品自然風(fēng)干，除去草根及枯枝落葉、石塊等雜物，過100目篩混合均勻后備用。供試過磷酸鈣(SSP)購自上海市滬試生產(chǎn)廠，骨炭(BC)購自山東省滕州化工廠。土壤與含磷材料理化性質(zhì)及稀土含量如表1所示。將BC、SSP添加至土壤中，共設(shè)3個處理：未添加含磷材料(CK)、添加2.5%骨炭(BC)、添加2.5%過磷酸鈣(SSP)。每個處理3次重復(fù)。供試樣品分別裝入高20 cm、直徑15 cm的硬質(zhì)PVC桶中。每桶稱取4 kg的土壤，共9桶，稱取3份0.1 kg的BC、3份0.1 kg的SSP，分別加入對應(yīng)的土壤樣品中，攪拌、混勻，入桶，浸水淹沒，保持土壤表面淺水平鋪。分別標(biāo)注CK1、CK2、CK3，BC1、BC2、BC3，SSP1、SSP2、SSP3。樣品放置大棚中，大棚內(nèi)外氣溫、濕度、光照基本一致。實驗起始日為2019年5月1日，40 d和80 d后，即6月10日、7月20日分別采集試驗樣品，低溫保存，送至北京新科開源基因科技有限公司進(jìn)行高通量測序及數(shù)據(jù)分析。

1.2 化學(xué)分析

土壤基本理化性質(zhì)的測定參考《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》。其中，土壤pH值采用水土比2.5∶1電極法；用鉬銻抗法和紫外可見分光光度計(型號UV755B，上海元析儀器有限公司，中國)測定土壤中的P含量[26]。土壤樣品稀土元素含量采用王水-高氯酸消解法消解。由于ICP-MS用于痕量元素分析，ICP-OES可以檢測濃度不超過1%的樣品。所以，土壤中含量較高的稀土元素La、Ce和Nd采用ICP-OES測定，含量較低的Pr、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu和Y等稀土元素用ICP-MS測定，采用國家標(biāo)準(zhǔn)樣品(土壤GBW07043)進(jìn)行質(zhì)量控制[26]。

1.3 16S r RNA基因的擴增和測序

1.3.1 樣本準(zhǔn)備、文庫制備及測序

對6月10日和7月20日的2批樣品及時進(jìn)行DNA樣品提取，分別對DNA樣本的V3V4區(qū)進(jìn)行PCR擴增，并使用設(shè)定的index序列進(jìn)行樣本區(qū)分。擴增使用的引物分別為338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCA)、806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)[27]。PCR使用Phusion高保真酶(high-fidelity PCR master with GC buffer)，流程為：95 ℃預(yù)變性5 min、94 ℃變性30 s、55 ℃退火35 s、72 ℃延伸30 s，以上共30個循環(huán)，72 ℃延伸8 min[6-7]。產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，藍(lán)光觀察目的片段。使用凝膠回收試劑盒(Life Technology，USA)進(jìn)行回收純化[28]，經(jīng)凝膠電泳檢測合格后，對回收純化的產(chǎn)物，使用Qubit 3.0(Life Technology，USA)進(jìn)行精確雙鏈DNA濃度定量。將每個樣本雙鏈DNA條數(shù)設(shè)定一致(總量=濃度×體積)，均勻混合為1管。使用NEB建庫試劑盒進(jìn)行建庫，采用DNA Library Prep Kit for Illumina. NEBNext Ultra(NEB#e7370S/L)中的標(biāo)準(zhǔn)建庫流程。對構(gòu)建出的文庫，使用Aglent2100和qPCR分別進(jìn)行文庫長度分布檢測和濃度檢測。將檢測合格的文庫使用Illumina Hiseq2500(PE250讀長)進(jìn)行測序[27]。對測序完畢得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控。

1.3.2 下機數(shù)據(jù)統(tǒng)計

將下機得到的原始數(shù)據(jù)，使用Ngs Tookit軟件進(jìn)行質(zhì)控，質(zhì)量控制采用Bokulich等[29]推薦的參數(shù)，質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)為：刪掉質(zhì)量值Q<15且長度>50%該序列總長度的Reads(即堿基質(zhì)量差的序列)，刪掉任意一端含接頭序列的Reads(即長度過短的序列)，得到分析可用的Clean Data(干凈數(shù)據(jù))，之后根據(jù)混樣前每個樣本的Barcode序列，使用Qiime軟件中split_libraries_fastq.py腳本對數(shù)據(jù)進(jìn)行拆分(參數(shù)設(shè)置：Barcode允許最大容錯為0 bp，Primer允許最大容錯為3 bp)，至此得到每個樣本的分拆序列。

使用FLASH軟件，對各樣本正向和反向Fastq文件進(jìn)行拼接(參數(shù)默認(rèn)最小Overlap=30 bp，Overlap默認(rèn)錯配率為0.3，Phred值默認(rèn)為33)，獲得各樣本拼接統(tǒng)計Reads數(shù)目。

表1 土壤、過磷酸鈣(SSP)、骨炭(BC)的理化性質(zhì)和稀土元素(REE)濃度Table 1 Physicochemical properties and rare earth element (REE) concentrations of soil and superphosphate (SSP) and bone charcoal (BC)

1.3.3 OTU生成及注釋

根據(jù)序列的相似性，將之歸為多個OTU(operational taxonomic unit)。選擇相似水平為0.03(即97%序列相似性，大約等同于種水平)進(jìn)行后續(xù)分析。本次分析采用Uclust算法，可以較好地處理長度有一定差異的序列聚類。本次規(guī)則定義為：每個OTU總含量≥2，或者>1時給予保留，否則將其OTU舍棄[30]。將精簡后的OTU表格供下游所有分析使用。

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)清洗和物種分類，以及后期Alpha多樣性分析，使用了軟件Mothur v.1.35.0(http://www.mothur.org)。序列注釋是微生物多樣性分析的一項核心內(nèi)容。本次分析，針對OTU代表序列進(jìn)行注釋。使用了來自Silva數(shù)據(jù)庫的參考序列(db128版)，注釋使用Mothur軟件的classify.seqs命令，注釋算法使用RDP算法(https://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline)。繪制Heatmap使用Origin9.0，數(shù)據(jù)可視化采用了Metasee軟件和Qiime軟件。

2 結(jié)果(Results)

2.1 pH及氣溫

由表2和表3可知，樣品培養(yǎng)40 d與80 d期間氣溫差異較大，BC與SSP不同處理對土壤不同階段pH產(chǎn)生了不同影響。40 d時，添加SSP的土壤pH有所下降，添加BC的土壤pH顯著增大；80 d時，添加SSP和BC，pH均顯著升高。

2.2 多樣性分析

Alpha多樣性指數(shù)一般用來衡量單個樣本內(nèi)部的豐富度和多樣性高低。計算各個樣本的相關(guān)統(tǒng)計和分析指數(shù)包括覆蓋率指數(shù)(Good’s Coverage)、豐度指數(shù)(OTU數(shù)目、Chao和Ace)和多樣性指數(shù)(Shannon-Weiner指數(shù)和Simpson多樣性指數(shù))。

圖1由F1、F2、F3和F4共4個部分構(gòu)成，分別表達(dá)的是Ace、Chao1、INV-Simpson和Shannon指數(shù)。從F1、F2可知，CK、BC和SSP處理40 d土壤細(xì)菌群落的Ace、Chao1指數(shù)均高于80 d的樣品；BC、SSP處理40 d后，前者土壤微生物總數(shù)降低，豐富度下降，后者土壤微生物總數(shù)、多樣性均略有升高。從F3、F4可知，BC處理的土壤細(xì)菌群落INV-Simpson、Shannon指數(shù)均高于CK和SSP處理的樣品；BC、SSP處理40 d后，前者微生物多樣性指數(shù)INV-Simpson、Shannon均有升高，而后者INV-Simpson下降，Shannon值變化不顯著。由圖1可知，處理80 d后，BC處理組土壤微生物豐富度、多樣性均有升高，SSP處理組豐富度變化不明顯，多樣性略有下降。

2.3 稀釋性曲線

稀釋性曲線衡量樣本的取樣深度。當(dāng)稀釋性曲線趨向與X軸平行時，說明取樣的數(shù)量充足，更多的取樣也可能只產(chǎn)生少量新的OTU；反之則表明繼續(xù)取樣還可能產(chǎn)生較多新的OTU。隨機抽樣方法，將每個樣本每隔50條抽取一次，計算當(dāng)前OTU數(shù)目(式(1))，得到一系列累計值，如圖2所示。

(1)

式中：Sn表示在抽取n個個體后觀察到的OTU平均數(shù)，St表示N個個體樣本中的OTU總數(shù)。

表2 不同處理土壤pH值Table 2 Soil pH value with different treatments

表3 不同時期的氣溫Table 3 Temperature of different periods

圖1 不同含磷材料對土壤群落的α多樣性的影響注：不同的字母表示不同含磷材料處理之間的顯著性差異(小寫字母表示同一個階段內(nèi)的顯著性差異，大寫字母表示在2個階段之間的顯著性差異)，P<0.05；BC、CK、SSP為培養(yǎng)40 d的樣品，BC(2)、CK(2)、SSP(2)為培養(yǎng)80 d的樣品，下同。Fig. 1 The effect of different phosphorous materials on the alpha diversity of soil communityNote: Different letters indicate the significant differences among treatments of different phosphorated materials (Lowercase letters indicate significant differences in the same stage, and capital letters indicate significant differences in two stages), P<0.05; BC, CK and SSP were samples cultured for 40 d, BC (2), CK (2) and SSP (2) were samples cultured for 80 d; the same below.

圖2 細(xì)菌16S基因序列的稀釋曲線Fig. 2 Rarefaction curves of bacterial 16S gene sequences

2.4 對土壤細(xì)菌群落影響的差異性分析

由圖3可知，第1、2階段BC、CK、SSP不同處理的各點分布差異較大，同一個階段內(nèi)BC、CK、SSP不同處理的各點分布差異也較大，說明非度量多維標(biāo)度(non-metric multidimensional scaling)NMDS Bray-Curtis差異顯著，表明不同階段BC、CK和SSP不同處理均顯著影響了細(xì)菌的β多樣性。

圖3 NMDS分析不同磷材料處理土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性Fig. 3 Similarity of bacterial community structure in soil treated by different phosphorus materials under the analysis of NMDS

2.5 對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

由圖4～圖6可知，BC、CK和SSP處理40 d時，門水平有酸桿菌門(Acidobacteria)、Verrucomicrobia、變形菌門(Proteobacteria)>15%，其中SSP處理Acidobacteria平均占65.8%、CK處理平均占52.9%、BC處理平均占25.1%，BC處理Verrucomicrobia平均占45.8%、CK處理平均占30.2%、SSP處理只占7%；綱水平有Acidobacteria、豐佑菌綱(Opitutae)、OPB35_soil_group>15%，其中Acidobacteria門中的Acidobacteria綱，SSP處理平均占65.5%、CK處理平均占52.5%、BC處理平均占23.7%；目水平有酸桿菌目(Acidobacteriales)、豐佑菌目(Opitutales)、OPB35_soil_group>15%，其中Acidobacteria綱中的Acidobacteriales，SSP處理平均占65.5%、CK處理平均占52.5%、BC處理平均占23.7%；科水平有酸桿菌科Acidobacteriaceae_(Subgroup_1)、豐佑菌科(Opitutaceae)、OPB35_soil_group_fa>15%，其中Acidobacteriales目中的Acidobacteriaceae_(Subgroup_1)科，SSP處理平均占65.5%、CK處理平均占52.5%、BC處理平均占23.7%；屬水平Candidatus_koribacter、豐佑菌(Opitutus)、OPB35_soil_group_ge>15%，其中Acidobacteriaceae_(Subgroup_1)科中的Candidatus_koribacter屬，SSP處理平均占61.1%、CK處理平均占46.6%、BC處理平均占21.8%。

由圖4～圖6可知，BC、CK和SSP處理80 d時，門水平有Proteobacteria、Verrucomicrobia、Acidobacteria、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)、儉菌總門(Parcubacteria)>15%，其中Proteobacteria門在SSP、CK、BC處理時平均占40.0%、23.7%、36.6%；Acidobacteria門在SSP、CK、BC處理時分別平均占3.7%、17.6%、14.3%；Verrucomicrobia門在SSP、CK、BC處理時分別平均占21.9%、8.4%、32.8%；綱水平有Acidobacteria、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、Opitutae、Chloroplast、Verrucomicrobiae、Parcubacteria_cl>15%，其中Acidobacteria綱在SSP、CK、BC處理分別時平均占2.6%、17.4%、13.8%，Deltaproteobacteria綱在SSP、CK、BC處理時分別平均占10.5%、13.4%、24.7%，Gammaproteobacteria綱在SSP、CK、BC處理時平均占27.5%、8.5%、10.1%；目水平有黏球菌目(Myxococcales)、Acidobacteriales、假單胞菌目(Pseudomonadales)、Opitutales、綠彎菌目(Chloroplast)、Verrucomicrobiales、Parcubacteria>15%，Myxococcales目在SSP、CK、BC處理時分別平均占9.7%、13.1%、23.8%，Acidobacteriales目在SSP、CK、BC處理時分別平均占2.6%、17.4%、13.8%，Pseudomonadales目在SSP、CK、BC處理時分別平均占25.2%、5.4%、6.5%；科水平有固氮菌科(Archangiacea)、Acidobacteriaceae_(Subgroup_1)、Opitutaceae、莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、Chloroplast_fa、Verrucomicrobiaceae、Pseudomonadaceae>15%，原囊粘菌科(Archangiaceae)在SSP、CK、BC處理時分別平均占7.4%、12.6%、19.7%，Acidobacteriaceae_(Subgroup_1)科在SSP、CK、BC處理時分別平均占2.6%、17.4%、13.8%，Moraxellaceae科在SSP、CK、BC處理時分別平均占24.0%、1.4%、5.2%；屬水平厭氧粘細(xì)菌(Anaeromyxobacter)、Candidatus_koribacter、豐佑菌(Opitutus)、透明球菌(Perlucidibaca)、Chloroplast_ge、突柄桿菌(Prosthecobacter)、Parcubacteria_ge>15%，Anaeromyxobacter屬在SSP、CK、BC處理時分別平均占7.4%、12.6%、20.0%，Candidatus_koribacter屬在SSP、CK、BC處理時分別平均占2.2%、15.2%、12.7%，Perlucidibaca屬在SSP、CK、BC處理時分別平均占23.9%、1.4%、5.0%。Verrucomicrobia門、Opitutae綱、Opitutales目、Opitutaceae科、Opitutus屬在SSP處理時占比均<15%，BC、CK處理時占比均<15%。

3 討論(Discussion)

稀土礦產(chǎn)開采導(dǎo)致礦區(qū)土壤稀土含量過多，影響生態(tài)環(huán)境。近年來，金姝蘭及其團(tuán)隊研究了種植水稻的情況下，含磷材料對土壤生物有效性及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。研究表明，含磷材料影響土壤pH值、土壤溶液稀土元素的濃度，影響土壤主要細(xì)菌的門、綱、目、科、屬、種的多樣性[1,6-7]。本研究在稀土礦區(qū)被迫停耕的稻田土壤中添加含磷材料骨炭(BC)和過磷酸鈣(SSP)進(jìn)行實驗，在實驗進(jìn)行至40 d和80 d時分別進(jìn)行了16S r RNA基因的擴增和測序。BC、SSP處理無論是40 d和80 d均對土壤細(xì)菌產(chǎn)生顯著的不同影響。由于添加不同含磷材料導(dǎo)致土壤pH值不同、不同時段氣溫的不同以及土壤中可溶解的稀土元素含量的變化，BC處理40 d后，微生物多樣性指數(shù)INV-Simpson、Shannon均有升高；SSP處理40 d后，土壤微生物總數(shù)、多樣性均有升高。BC處理80 d后，土壤微生物豐富度、多樣性均有升高，SSP處理80 d后，豐富度、多樣性變化不大。

大量研究表明，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受pH、P含量、重金屬離子濃度、時間和溫度等因素的影響[31-37]。土壤中最豐富的微生物是細(xì)菌，主要包括變形菌(Proteobacteria)、綠彎菌(Chloroflexi)、擬桿菌(Bacteroidetes)、放線菌(Actinobacteria)和酸桿菌(Acidobacteria)等[38]。pH被認(rèn)為是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)鍵因子。本研究表明，BC、CK、SSP處理40 d和80 d，門水平豐度均>10%的包括Acidobacteria和Verrucomicrobia，二者均與pH顯著相關(guān)，其中Acidobacteria與pH顯著負(fù)相關(guān)，經(jīng)相關(guān)性分析后得出其相關(guān)系數(shù)為-0.827。研究表明，土壤中添加SSP后由于SSP溶解過程中H+的釋放，土壤pH值有所下降[39]。SSP處理40 d時，土壤酸性有所增強，所以40 d時SSP處理Acidobacteria豐度升高，平均占65.8%，Candidatus_koribacter所占比例最高，達(dá)61.1%，顯著高于其他處理；添加BC土壤酸性下降，pH值升高，BC處理Acidobacteria平均只占25.1%；Verrucomicrobia與pH顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.705，這與之前的多數(shù)研究結(jié)果一致[40-41]。本研究發(fā)現(xiàn)，CK、BC、SSP處理40 d與80 d時，由于土壤pH變化，土壤細(xì)菌的門、綱、目、科、屬均發(fā)生了變化。有研究表明，變形菌門中的不同菌對pH值要求不同，如Gammaproteobacteria中的Perlucidibaca屬適宜pH較低的環(huán)境[42]，所以SSP處理80 d后，Perlucidibaca占比最高；而Deltaproteobacteria中的Anaeromyxobacter屬適宜pH相對高一些的環(huán)境，所以BC處理80 d后，Anaeromyxobacter屬占比最高。受pH值影響最顯著的是OPB35_soil_group_ge，該菌屬適宜pH相對高一些的環(huán)境，所以無論是40 d，還是80 d時，其豐度均為BC處理>CK處理>SSP處理。

圖4 各分類水平>15%的統(tǒng)計結(jié)果注：(a)為培養(yǎng)40 d的樣品；(b)為培養(yǎng)80 d的樣品。Fig. 4 The statistical results of each classification level greater than 15%Note: (a) The sample cultured for 40 d; (b) The sample cultured for 80 d.

圖5 門水平柱狀圖Fig. 5 Bar graph of phylum in soil

圖6 屬水平聚類熱圖Fig. 6 Heat map of genera in soil

施肥對土壤細(xì)菌影響顯著，有研究表明增施P肥可促進(jìn)變形菌門的生長[7]，3種處理組在處理40 d和80 d后，門水平豐度>10%有Verrucomicrobia、Proteobacteria，其豐度的變化均與P的添加相關(guān)。無論是40 d，還是80 d時，BC處理與SSP處理的土壤Proteobacteria所占比例均大于CK處理；有研究表明[32]，與未施肥的對照相比，在施肥處理中Verrucomicrobia的相對豐度均有所增加。本研究中處理40 d和80 d時BC、SSP處理Verrucomicrobia所占比例顯著高于CK，這與已有的研究結(jié)果一致。

金姝蘭等[3]的研究表明，稀土礦區(qū)稻田土壤中由于含磷材料的添加，導(dǎo)致土壤溶液稀土元素濃度變化。土壤中Candidatus_koribacter豐度更受土壤溶液中的稀土元素濃度影響，處理80 d后，BC、SSP中的P與土壤中的稀土元素形成磷酸稀土沉淀，減少了溶液中的稀土元素濃度，導(dǎo)致BC、SSP處理的土壤Candidatus_koribacter豐度低于CK處理。土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受時間、溫度等因素的影響。CK、BC和SSP處理40 d的樣品是5月初至6月10日這一時間段培養(yǎng)的，80 d的樣品是5月初至7月底這一時間段的。所以80 d的樣品溫度顯著高于40 d的。Ding等[43]和Jin等[1]的研究表明，微生物群落結(jié)構(gòu)受季節(jié)和溫度的影響。由于40 d的樣品與80 d的樣品的時間和溫度均發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)菌群落的豐富度(Chao1、Ace指數(shù))、多樣性(INV-Simpson、Shannon指數(shù))均發(fā)生了顯著變化。

有研究表明，酸性礦山廢水污染的河流流域稻田土壤形成了與其他稻田土壤中的Proteobacteria主導(dǎo)的群落結(jié)構(gòu)不同[41]。所以，本次添加BC、SSP對稀土礦區(qū)停耕稻田細(xì)菌群落影響的研究與之前將含磷材料添加在未停耕稻田土壤的研究結(jié)果有所不同。停耕稻田土壤中Proteobacteria的豐度顯著低于未停耕土壤，而Acidobacteria、Verrucomicrobia的豐度顯著高于未停耕土壤。含磷材料對停耕和未停耕稻田修復(fù)效果不一致。Jin等[6]的研究表明，BC是未停耕稻田最有潛力的修復(fù)劑，而本研究認(rèn)為SSP添加40 d后、BC添加80 d后，稀土礦區(qū)停耕稻田土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)均有升高，2種含磷材料均有一定的修復(fù)效果。

CK、BC、SSP處理40 d和80 d后，土壤中P含量、pH、稀土離子濃度和溫度等不同，對土壤微生物影響不同，BC、SSP對稀土礦區(qū)停耕稻田均有一定的修復(fù)效果。

(1)pH是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)鍵因子，Acidobacteria與pH顯著負(fù)相關(guān)，Verrucomicrobia與pH顯著正相關(guān)；BC、SSP中的P促進(jìn)變形菌門的生長，無論是40 d，還是80 d時，BC處理與SSP處理的土壤Proteobacteria所占比例均大于CK處理。

(2)BC、SSP中的磷酸根離子與土壤中的稀土元素形成磷酸稀土沉淀，減少了溶液中的稀土元素濃度，導(dǎo)致BC、SSP處理的土壤Candidatus_koribacter豐度低于CK處理；土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受時間、溫度等因素的影響；CK、BC和SSP處理40～80 d時，隨著時間、溫度的變化Verrucomicrobia豐度發(fā)生了顯著變化。

(3)SSP添加40 d后、BC添加80 d后，稀土礦區(qū)停耕稻田土壤細(xì)菌群落Chao、Ace指數(shù)均有升高，土壤細(xì)菌群落多樣性增大，表明BC、SSP對稀土礦區(qū)停耕稻田均有一定的修復(fù)效果。

(4)BC、SSP等含磷材料可能促進(jìn)稀土礦區(qū)停耕稻田有益菌的繁殖與富集，修復(fù)稀土污染土壤，使停耕稻田的復(fù)耕成為可能。

以上結(jié)論僅僅是基于實驗室的培養(yǎng)實驗得出的，實驗結(jié)果未經(jīng)大田實驗驗證，這是本研究的不足，也是下一步我們要開展的工作。

通訊作者簡介：金姝蘭(1966—)，女，碩士，教授，主要研究方向為土壤污染過程與修復(fù)機理。