基于傅里葉變換紅外光譜技術(shù)分析壬基酚和雙酚A對斑馬魚胚胎的影響

劉芳，田斐，史文俊

1. 華南師范大學地理科學學院，廣州 510631 2. 中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源環(huán)境科學觀測實驗站，廣東珠江口生態(tài)系統(tǒng)野外科學觀測研究站，廣州510300 3. 中國科學院廣州地球化學研究所，廣州 510640 4. 華南師范大學環(huán)境研究院廣東省化學污染與環(huán)境安全重點實驗室，華南師范大學環(huán)境理論化學教育部重點實驗室，廣州510006

環(huán)境激素(environmental hormone, EH)，又稱“環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmental endocrine disruptors, EEDs)”，是一類通過干擾人和動物體內(nèi)激素的合成、釋放、轉(zhuǎn)運、代謝、與受體結(jié)合、功能表達等一系列生物過程，從而影響有機體穩(wěn)定性的保持、生殖、發(fā)育或者行為的外源物質(zhì)[1]。環(huán)境激素可導致生物體生殖功能下降[2]、生殖器官異常[3]、免疫力降低[4]、神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙[5]和癌癥[6]等癥狀。環(huán)境激素大多數(shù)是化學性質(zhì)穩(wěn)定的脂溶性化合物，極易經(jīng)食物鏈富集進入人體，生物半衰期較長且在人體內(nèi)沒有特定的代謝系統(tǒng)，導致在人體內(nèi)富集并長期緩慢地發(fā)揮作用，對人類及整個生態(tài)系統(tǒng)造成潛在的危害。

近幾十年來，隨著我國經(jīng)濟高速發(fā)展和城市化規(guī)模迅猛擴張，大量化學物質(zhì)被應用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)當中[7]，其中大部分化學物質(zhì)最終通過各種途徑匯入水環(huán)境中，對水生態(tài)系統(tǒng)造成危害[8]。壬基酚(nonylphenol, 4-NP)和雙酚A(bisphenol A, BPA)是2種在環(huán)境中普遍檢出的雌激素物質(zhì)。例如，在我國北京污水處理廠進水中4-NP平均濃度為19.26 μg·L-1，最高達到了25.75 μg·L-1，出水4-NP平均濃度為4.57 μg·L-1，最高達到了7.93 μg·L-1，污水處理廠對4-NP去除率可達到75.3%[9]。類似地，在我國北京污水處理廠中BPA是含量最大的化合物，進水最高濃度為1.574 μg·L-1，出水總平均濃度為0.049 μg·L-1，去除率可達96%以上[10]。此外，在我國煙臺污水處理廠出水中4-NP最高濃度達到了0.662 μg·L-1；BPA最高為0.195 μg·L-1，該研究發(fā)現(xiàn)污水處理廠附近河流中的4-NP和BPA的濃度甚至比污水處理廠中最高濃度還要高，分別達到了1.946 μg·L-1和1.772 μg·L-1[11]。這也不難理解4-NP和BPA在地表水中的頻繁檢出。研究發(fā)現(xiàn)4-NP在美國30個州139條河流中最高濃度達到了40 μg·L-1[12]。在西班牙，4-NP在地表水中濃度最高達到了644 μg·L-1[13]。在我國太湖流域，4-NP的檢出濃度最高也達到了208 μg·L-1[14]。此外，在我國太原工業(yè)地區(qū)地下水中4-NP濃度最高為151 μg·L-1[15]。類似地，BPA在工業(yè)發(fā)達地區(qū)地表水濃度顯著高于其他地區(qū)。例如，在我國黃浦江和珍珠河口地區(qū)，BPA濃度高達4 μg·L-1[16-17]，珠江口BPA最高濃度為3.92 μg·L-1[16,18]。在美國BPA地表水最高濃度為12 μg·L-1[19]。由于4-NP和BPA具有較強的雌激素活性，對水體中生物具有潛在的生態(tài)風險。

傅里葉變換紅外光譜(FTIR)作為一種基于化合物中官能團和極性鍵振動的結(jié)構(gòu)分析技術(shù)，已廣泛應用于大分子化合物結(jié)構(gòu)分析以及蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)解析[20-21]，是獲取分子結(jié)構(gòu)信息的有力工具，被廣泛應用于臨床醫(yī)學、藥學、化工化學、環(huán)境分析和材料學等領(lǐng)域。近年來，F(xiàn)TIR技術(shù)被運用到毒理學研究中。Henczová等[22-23]利用FTIR技術(shù)研究了重金屬銅、鎘和鉛對不同魚類的毒性效應。Cakmak等[24]利用FTIR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)17β-雌二醇顯著改變了虹鱒魚肝臟組織的成分、結(jié)構(gòu)以及功能，并認為FTIR技術(shù)可以成功解決生態(tài)毒理學問題。Llabjani等[25]運用FTIR技術(shù)檢測低濃度多溴二苯醚(polybrominated diphenyl ether, PBDE)、苯并芘、雌二醇和林丹對靶細胞的生物學效應，研究發(fā)現(xiàn)極低劑量的PBDE即可誘導靶細胞的生物學改變，其誘導靶細胞發(fā)生的生物學改變主要是脂質(zhì)、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和DNA/RNA構(gòu)象變化等。此外，Llabjani等[26]還利用FTIR技術(shù)研究了PBDE和多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls, PCB)的聯(lián)合毒性效應，結(jié)果表明PBDE和PCB126相互之間可能存在拮抗作用，但PBDE與PCB153聯(lián)合作用產(chǎn)生的生物學改變比單一物質(zhì)作用要顯著。我們團隊前期利用FTIR分析了實驗中常用助溶劑對綠藻和浮萍的毒性，結(jié)果表明，甲醇和乙醇在很低濃度暴露下，仍然會對浮萍和綠藻的生長及生物大分子產(chǎn)生影響；丙酮在經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)建議濃度(0.01%V/V)對浮萍和綠藻的毒性較弱；二甲基亞砜(DMSO)在0.1%V/V濃度下對浮萍的影響也很小。這表明，F(xiàn)TIR可以靈敏地分析實驗中常用的助溶劑對生物的毒性[27]。總的說來，近年國內(nèi)外利用FTIR技術(shù)研究污染物的生態(tài)毒理效應取得了一定的進展，但尚處起步階段。因此，本研究利用FTIR技術(shù)分析了環(huán)境中常見的雌激素物質(zhì)4-NP和BPA對斑馬魚胚胎的毒性。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要試劑

壬基酚(4-NP，純度≥98%，Adamas)，雙酚A(BPA，純度≥99%，CNW)。實驗用其他試劑均為分析純。4-NP和BPA分別溶于DMSO中配成儲液，置于-20 ℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 斑馬魚飼養(yǎng)和胚胎收集

成年斑馬魚(Daniorerio)購買于廣州市花地灣花鳥魚蟲市場，實驗室馴養(yǎng)一個月后，用于本實驗。成年斑馬魚飼養(yǎng)在包含有內(nèi)置循環(huán)泵裝置的玻璃魚缸中，魚缸體積為45 L，每個魚缸飼養(yǎng)30條雌性和雄性斑馬魚。自來水經(jīng)過活性炭過濾后，曝氣2 d以上方可用于實驗。用于暴露的水中氧飽和度>80%，溫度和pH分別控制在(26±1) ℃和7～8范圍內(nèi)；光暗周期比為14 h∶10 h。每天早上和下午分別喂食冰凍紅蟲(chironomid larvae)和豐年蝦(Artemiasalina)2次。由于缸內(nèi)具有循環(huán)系統(tǒng)，每周更換一次水。飼養(yǎng)期間，每天及時用虹吸法吸出魚缸的糞便和殘餌，防止斑馬魚生病，確保實驗正常進行。

產(chǎn)卵前一天，將3條雌魚和6條雄魚放入產(chǎn)卵缸的孵化器內(nèi)，中間有隔板將雌魚和雄魚分開，它們能夠通過隔板的縫隙看到對方，但是不能相互靠在一起。孵化器下面的篩板將魚與缸底隔開，防止魚提前產(chǎn)卵和吞食魚卵。將魚放入孵化器后避光，次日早晨，抽走雌魚和雄魚之間的隔板，并給以充足的光照，雌雄斑馬魚會在光照的刺激下互相追逐完成交配產(chǎn)卵等過程，30 min后收集胚胎。將受精卵收集起來，用胚胎培養(yǎng)液沖洗，并在倒置顯微鏡下觀察其發(fā)育情況。挑選發(fā)育正常且處于囊胚期(受精后2～4 h)的受精卵用于接下來的暴露實驗。胚胎培養(yǎng)液配制方法：按照ISO 7346/3標準配制母液(294.0 mg·L-1CaCl2·2H2O，123.3 mg·L-1MgSO4·7H2O，63.0 mg·L-1NaHCO3，5.5 mg·L-1KCl)，將母液按體積比為1∶4稀釋，通氣24 h以上，調(diào)節(jié)pH值到7.8±0.2，方可使用。

1.3 暴露實驗

暴露容器采用玻璃培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿加30 mL試液和20顆胚胎。暴露溶液是加了目標化合物的胚胎培養(yǎng)液。斑馬魚胚胎暴露于一系列名義濃度的4-NP和BPA中，同時設(shè)置溶劑對照組。處理組濃度設(shè)置分別為：200、400、600、800、1 000和1 200 μg·L-14-NP；2、4、6、8、10和12 mg·L-1BPA。目標化合物處理組和溶劑對照組均含有0.01%(V/V)的DMSO助溶劑。每個處理組設(shè)置3個平行，因此每個處理組有60個胚胎用于毒性評估。暴露時間為96 hpf (hours post fertilization)。暴露期間，胚胎放入人工氣候箱中進行培養(yǎng)，溫度保持為(26±1) ℃，光暗周期比為14 h∶10 h。每天在倒置顯微鏡下觀察胚胎的發(fā)育情況。根據(jù)Nagel[28]的方法，每天記錄胚胎的致死、亞致死和致畸情況，如表1所示。

1.4 ATR-FTIR檢測及多變量分析

參照我們前期研究[27]，暴露結(jié)束后，隨機取斑馬魚幼魚(胚胎)放到10%福爾馬林(V(甲醛)/V(PBS))中固定，之后放在氟化鋇窗片上并置于干燥盒去掉斑馬魚幼魚(胚胎)的水分，待水分去掉后，將斑馬魚幼魚(胚胎)放到布魯克紅外光譜儀上進行紅外光譜分析。紅外光譜采用Bruker Optics公司的Bruker Vector 70傅里葉變換紅外光譜儀與衰減全反射(ATR)附件、MCT檢測器。測定條件：光譜范圍4 000～600 cm-1，分辨率8 cm-1，掃描累加次數(shù)64次。掃描時扣除H2O和CO2的干擾，以不放入任何樣本的空白掃描作為背景。

在進行多變量分析之前，檢測樣本獲取的紅外圖譜需進行預處理。首先，運用OPUS軟件，分別對ATR-FTIR原始圖譜截取細胞生物化學指紋圖譜區(qū)域段(1 800～900 cm-1)，然后根據(jù)酰胺酶Ⅰ(1 650 cm-1)對圖譜進行基線化校正和標化。原始圖譜經(jīng)預處理后，采用MATLAB R2010a和圖標用戶界面的工具包進行多變PCA-LDA分析。多變量分析處理結(jié)果通過得分圖和集群矢量圖直觀顯示。

表1 斑馬魚胚胎及幼魚在不同時間的異常率的測試終點和評分系統(tǒng)Table 1 Assignment of zebrafish embryo-larval abnormalities scoring and endpoints

1.5 化合物在暴露水溶液中的實際測定濃度

為了測定4-NP和BPA在暴露水中的實際濃度，本研究對溶劑對照組和各處理組進行了化學分析。由于暴露水溶液每天都更新，所以所有處理組的水樣只在暴露第1天開始暴露時(0 h)和換水前(24 h)這2個時間點收集進行檢測。通過分析2個時間點水樣中4-NP和BPA的濃度，來表征它們在暴露期間的變化情況。

4-NP和BPA濃度采用高效液相色譜法分析(HPLC-FLD，Agilent 1200 series，USA)，采用Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)。色譜條件如下。4-NP：流動相A乙腈和流動相B水(80∶20，V/V)，流速1 mL·min-1，柱溫30 ℃，熒光檢測器激發(fā)波長為230 nm，發(fā)射波長為290 nm，進樣體積100 μL，PTM-gain為17。BPA：流動相A乙腈和流動相B水(50∶50，V/V)，流速1 mL·min-1，柱溫30 ℃，熒光檢測器激發(fā)波長為230，發(fā)射波長為290，進樣體積20 μL，PTM-gain為18。

1.6 數(shù)據(jù)分析

斑馬魚胚胎發(fā)育毒性，參照文獻中的方法[29]，用FTI指數(shù)來表示，魚類致畸指數(shù)(fish teratogenicity index, FTI)按以下公式來計算：FTI=(Eother×1+Esubl.×2+Elethal×3)/N。式中：FTI表示魚類致畸指數(shù)；Eother表示出現(xiàn)其他效應的胚胎數(shù)；Esubl.表示出現(xiàn)亞致死效應的胚胎數(shù)；Elethal表示出現(xiàn)致死效應的胚胎數(shù)；N表示每個重復所用的胚胎總數(shù)。

劑量效應曲線用Origin 8軟件擬合得到LC50和EC50。處理組與對照組之間的差異顯著性分析由SPSS14.0統(tǒng)計軟件完成，在不同的處理組之間采用單因子方差分析(One-way ANOVA)進行差異顯著性檢驗，用Duncan’s法對濃度組與對照組間數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，其中*表示在P<0.05上有顯著差異。所有結(jié)果表示為平均值±標準誤差(Mean±SD)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 暴露水溶液中4-NP和BPA實測濃度

BPA在暴露開始時(0 h)的實測濃度都非常接近它們的名義濃度，在24 h濃度都稍有降低。另外，4-NP和BPA在溶劑對照組中均沒有檢測到。4-NP在0 h檢測濃度與名義濃度非常接近，但是暴露24 h后，濃度下降了19.9%～28.5%。由于濃度梯度較多，為了便于記錄和簡潔，在圖表中分別以L1、L2、M1、M2、H1、H2代表4-NP和BPA從低到高的實測濃度(表2)。

2.2 4-NP和BPA對斑馬魚早期胚胎形態(tài)學發(fā)育的影響

不同濃度4-NP和BPA暴露下，斑馬魚胚胎的96 hpf存活率、72 hpf孵化率以及FTI指數(shù)如圖1所示。結(jié)果顯示，暴露96 h后，當4-NP≥332 μg·L-1時，斑馬魚胚胎的存活率顯著下降(P<0.05)，且隨著暴露濃度的增加，存活率逐漸降低。849.5 μg·L-1和1 038.5 μg·L-14-NP暴露后，斑馬魚胚胎全部死亡。以胚胎死亡率作為效應終點，4-NP對斑馬魚胚胎的96 h-LC50為481.7 μg·L-1。當4-NP≥332μg·L-1時，均顯著降低斑馬魚胚胎72 hpf孵化率(P<0.05)；同時，斑馬魚胚胎72 hpf孵化率分別只有33%、5%、0%、0%和0%。4-NP≥332 μg·L-15個處理組中FTI指數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)，且隨著暴露濃度的增加，F(xiàn)TI指數(shù)增加。以FTI指數(shù)作為效應終點，4-NP對斑馬魚胚胎的96 h-EC50為362.6 μg·L-1。

表2 壬基酚(4-NP)和雙酚A(BPA)在暴露實驗中名義濃度和實測濃度Table 2 The nominal and measured concentrations of nonylphenol and bisphenol A in the exposure experiment

圖1 4-NP和BPA對斑馬魚胚胎形態(tài)發(fā)育的影響注：FTI表示魚類致畸指數(shù)，SC表示溶劑對照；4-NP實測濃度中，L1, 158.5 μg·L-1; L2, 332 μg·L-1; M1, 472.5 μg·L-1; M2, 692 μg·L-1; H1, 849.5 μg·L-1; H2, 1 038.5 μg·L-1；BPA實測濃度中，L1, 1.75 mg·L-1; L2, 3.75 mg·L-1; M1, 5.55 mg·L-1; M2, 7.5 mg·L-1; H1, 9.55 mg·L-1; H2, 11.4 mg·L-1；*表示P<0.05。Fig. 1 Effects of 4-NP and BPA on morphological development of zebrafish embryosNote: FTI means fish teratogenicity index; SC means solution control; for the measured concentrations of 4-NP, L1, 158.5 μg·L-1; L2, 332 μg·L-1; M1, 472.5 μg·L-1; M2, 692 μg·L-1; H1, 849.5 μg·L-1; H2, 1 038.5 μg·L-1; for the measured concentrations of BPA, L1, 1.75 mg·L-1; L2, 3.75 mg·L-1; M1, 5.55 mg·L-1; M2, 7.5 mg·L-1; H1, 9.55 mg·L-1; H2, 11.4 mg·L-1; *represents P<0.05.

暴露96 h后，當BPA≥7.5 mg·L-1，斑馬魚胚胎的存活率顯著下降(P<0.05)，且隨著暴露濃度的增加，存活率顯著降低。以胚胎死亡率作為效應終點，BPA對斑馬魚胚胎的96 h-LC50為8.8 mg·L-1。BPA≥5.55 mg·L-1處理組中，斑馬魚胚胎72 hpf孵化率顯著降低(P<0.05)，這4個處理組斑馬魚胚胎72 hpf孵化率分別只有30%、0%、0%和0%；這些處理組中，F(xiàn)TI指數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)，且隨著暴露濃度的增加，F(xiàn)TI指數(shù)增加。以FTI指數(shù)作為效應終點，BPA對斑馬魚胚胎的96 h-EC50為7.9 mg·L-1。

2.3 ATR-FTIR分析4-NP和BPA對斑馬魚胚胎的影響

由于4-NP濃度≥692 μg·L-1時，斑馬魚胚胎存活率非常低，導致樣品量不足。這里我們利用ATR-FTIR分析了較低濃度4-NP對斑馬魚胚胎的影響。在4-NP處理組中，PCA-LDA一維和二維得分圖均顯示，處理組與對照組相比差異顯著(P<0.05)，高濃度的處理組(332 μg·L-1和472.5 μg·L-1)比低濃度處理組(158.5 μg·L-1)區(qū)分度更高，差異更顯著(P<0.001)(圖2(a)～(b))。通過PCA-LDA分析，進一步發(fā)現(xiàn)不同處理組斑馬魚胚胎ATR-FTIR圖譜組間差異波數(shù)(如圖2(c))，cluster vector圖顯示引起組間差異的波數(shù)所對應的主要生物標記物如表3所示。當4-NP≥158.5 μg·L-1時，對酰胺Ⅱ、脂質(zhì)和蛋白磷酸化等波數(shù)有顯著影響。

在BPA處理組中，PCA-LDA一維和二維得分圖均顯示，當BPA處理組濃度≥3.75 mg·L-1時，處理組與對照組相比差異顯著(P<0.05)(圖2(d)～(e))。通過PCA-LDA分析，進一步發(fā)現(xiàn)不同處理組斑馬魚胚胎ATR-FTIR圖譜組間差異波數(shù)(如圖2(f))，cluster vector圖顯示引起組間差異的波數(shù)所對應的主要生物標記物如表4所示。當BPA≥1.75 mg·L-1時，對酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ、脂質(zhì)和碳水化合物等波數(shù)有顯著影響。

3 討論(Discussion)

魚類對污染物暴露特別敏感，尤其是在其生命發(fā)育的早期階段[30]。本研究結(jié)果表明，4-NP、BPA暴露均可抑制斑馬魚的早期胚胎發(fā)育，且抑制效應隨著處理濃度的升高而增強。

孵化率是胚胎發(fā)育階段重要的毒理學指標。前人研究結(jié)果顯示，4-NP對黑頭軟口鰷[31]、玫瑰無須鲃[32]、斑馬魚[33]和奧尼羅非魚[34]的96 h-LC50分別為135、379、960和264.6 μg·L-1。BPA對斑馬魚胚胎的96 h、120 h-LC50分別為13.9 mg·L-1[35]和5 mg·L-1[36]。以96 hpf孵化率作為效應終點，BPA對斑馬魚胚胎EC50為5.25 mg·L-1[37]。本研究顯示，隨著4-NP和BPA暴露濃度的提高，斑馬魚胚胎的存活率呈下降趨勢，個體死亡的數(shù)量增加。以斑馬魚胚胎96 hpf死亡率作為效應終點，4-NP和BPA對斑馬魚胚胎的96 h-LC50分別為481.7 μg·L-1和8.8 mg·L-1。對斑馬魚胚胎的毒性強弱順序為4-NP>BPA。魚類致畸指數(shù)(FTI)被用于表征污染物對魚類胚胎發(fā)育的毒性效應[38]。本研究中，以FTI指數(shù)作為效應終點，4-NP和BPA對斑馬魚胚胎的96 h-EC50分別為362.6 μg·L-1和7.9 mg·L-1。以上結(jié)果表明，4-NP對斑馬魚的存活和致畸的毒性要遠強于BPA。

圖2 利用傅里葉紅外分析4-NP和BPA對斑馬魚胚胎的影響注：SC表示溶劑對照；4-NP實測濃度中，L1, 158.5 μg·L-1; L2, 332 μg·L-1; M1, 472.5 μg·L-1; M2, 692 μg·L-1; H1, 849.5 μg·L-1; H2, 1 038.5 μg·L-1；BPA實測濃度中，L1, 1.75 mg·L-1; L2, 3.75 mg·L-1; M1, 5.55 mg·L-1; M2, 7.5 mg·L-1; H1, 9.55 mg·L-1; H2, 11.4 mg·L-1。Fig. 2 Effects of 4-NP and BPA on zebrafish embryo by using ATR-FTIRNote: SC means solution control; for the measured concentrations of 4-NP, L1, 158.5 μg·L-1; L2, 332 μg·L-1; M1, 472.5 μg·L-1; M2, 692 μg·L-1; H1, 849.5 μg·L-1; H2, 1 038.5 μg·L-1; for the measured concentrations of BPA, L1, 1.75 mg·L-1; L2, 3.75 mg·L-1; M1, 5.55 mg·L-1; M2, 7.5 mg·L-1; H1, 9.55 mg·L-1; H2, 11.4 mg·L-1.

FTIR作為一種基于化合物中官能團和極性鍵振動的結(jié)構(gòu)分析技術(shù)，已廣泛應用于大分子化合物結(jié)構(gòu)分析以及蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)解析[20-21,39]，是獲取分子結(jié)構(gòu)信息的有力工具，被廣泛應用于臨床醫(yī)學、藥學、化工化學、環(huán)境分析和材料學等領(lǐng)域。本研究運用ATR-FTIR紅外光譜以及多變量分析研究不同污染物對斑馬魚胚胎的特征性變化。并運用多變量方法PCA-LDA提取ATR-FTIR光譜的復雜數(shù)據(jù)進行判別分析。研究結(jié)果表明，該方法能夠有效鑒別一系列低于引起胚胎形態(tài)發(fā)育異常的低劑量污染物的劑量-效應關(guān)系。以生化指紋區(qū)PCA-LDA結(jié)果作為效應終點，4-NP和BPA對斑馬魚胚胎的96 h-EC50分別329.2 μg·L-1和7.2 mg·L-1。紅外光譜分析技術(shù)及多變量分析方法為更好地研究低劑量污染物的生物學效應提供了一種全新的手段，生化指紋區(qū)PCA-LDA結(jié)果可以作為一個新的效應終點[27]。本研究結(jié)果表明，4-NP(158.5、332 μg·L-1和472.5 μg·L-1)暴露斑馬魚胚胎，主要影響了胚胎的脂質(zhì)(1 739 cm-1)、酰胺Ⅱ(1 511～1 558 cm-1)、DNA/RNA(1 072 cm-1, 1 226 cm-1)以及蛋白磷酸化水平(975 cm-1)。隨著暴露濃度的增加，與對照組相比，在～1 740，～1 580，～1 225和～970 cm-1差異程度逐漸增加。Larsen等[40]采用表面增強激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)以及酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法研究發(fā)現(xiàn)，暴露于29 μg·L-14-NP的大西洋鱈魚和大比目魚幼魚體內(nèi)蛋白質(zhì)水平發(fā)生顯著變化。Aravindakshan和Cyr[41]的研究結(jié)果表明4-NP可以降低connexin 43蛋白磷酸化水平，從而使細胞間隙連接通訊受到損害。此外，研究發(fā)現(xiàn)4-NP可以改變脂質(zhì)代謝[42]，并對生物體產(chǎn)生遺傳毒性[43]。本研究結(jié)果表明，較低濃度BPA(1.75、3.75和5.55 mg·L-1)暴露斑馬魚胚胎，主要影響了胚胎的蛋白質(zhì)(1 500～1 680 cm-1)、脂質(zhì)(1 700～1 740 cm-1)、脂肪酸(1 488 cm-1)、碳水化合物(1 168 cm-1)，而較高濃度BPA(8、10和12 mg·L-1)對斑馬魚胚胎產(chǎn)生遺傳毒性(1 064 cm-1, 1 226 cm-1)。Larsen等[40]采用SELDI-TOF以及ELISA方法研究發(fā)現(xiàn)，暴露于59 μg·L-1BPA的大西洋鱈魚和大比目魚幼魚體內(nèi)蛋白質(zhì)水平發(fā)生顯著變化。BPA可以使前脂肪細胞加速分化為成熟的脂肪細胞，從而導致脂質(zhì)在細胞內(nèi)積累[44]。微藻細胞內(nèi)碳水化合物和脂肪酸的含量隨著BPA處理濃度的增加而提高[45]。Park和Choi[43]同樣證明BPA對大型溞和搖蚊幼蟲產(chǎn)生遺傳毒性。

表3 4-NP暴露組中差別最顯著的5個峰值及其代表的相關(guān)生物分子Table 3 Assignments of top 5 significant peaks in 4-NP treatments

表4 BPA暴露組中差別最顯著的5個峰值及其代表的相關(guān)生物分子Table 4 Assignments of top 5 significant peaks in BPA treatments

上面結(jié)果均表明，4-NP和BPA影響了斑馬魚胚胎脂質(zhì)代謝相關(guān)的波數(shù)。脂質(zhì)對于生物正常的生理功能至關(guān)重要，例如人體的新陳代謝能量和激素合成[46]。4-NP和BPA是典型的環(huán)境雌激素，可以導致魚類產(chǎn)生雌激素效應。4-NP和BPA結(jié)構(gòu)類似，均與內(nèi)源性雌激素雌二醇(estradiol, E2)具有相同的酚羥基結(jié)構(gòu)，能夠模擬E2與斑馬魚雌激素受體(estrogen receptor, ER)活性位點結(jié)合，從而導致雌激素效應[47-48]。其中，BPA和4-NP分別有2個和1個官能團酚羥基；分子對接結(jié)果顯示，BPA和4-NP均可與ER中Leu79、Met83、Phe99和Ile119等氨基酸形成的疏水腔結(jié)合[48]。有研究通過體外重組酵母方法分析發(fā)現(xiàn)，BPA和4-NP均對ER有顯著的親和力[49]。因此，BPA和4-NP對斑馬魚胚胎具有類似的毒性，這與本研究中胚胎發(fā)育毒性和生理生化變化相吻合。比如，4-NP和BPA可以影響魚類類固醇以及膽固醇代謝。類固醇激素和膽固醇是典型的脂質(zhì)類物質(zhì)，這可以解釋脂質(zhì)相關(guān)的波數(shù)在4-NP和BPA處理組中聚集。此外，4-NP和BPA導致了斑馬魚胚胎死亡，前期研究表明4-NP和BPA可以導致細胞凋亡和DNA損傷，這可作為支撐本文中的核酸波數(shù)變化的依據(jù)。

綜上所述，從生理生化和胚胎發(fā)育等角度，4-NP和BPA對斑馬魚具有胚胎毒性，同時顯著影響了脂質(zhì)和核酸相關(guān)的波數(shù)變化。

通訊作者簡介：史文俊(1987—)，男，博士，副教授，主要研究方向生態(tài)毒理學。