典型殺蟲劑類內(nèi)分泌干擾物對(duì)水生溞類的毒性效應(yīng)研究進(jìn)展

趙倩，戚錢菊，郭家驊，李琦

西北大學(xué)城市與環(huán)境學(xué)院，西安 710100

隨著殺蟲劑的廣泛應(yīng)用，環(huán)境中殘留著大量有機(jī)氯、有機(jī)磷、擬除蟲菊酯和新煙堿類等具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的殺蟲劑，對(duì)生物體具有顯著的生殖和發(fā)育毒性[1]。近年來，水體環(huán)境中殺蟲劑類內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals, EDCs)的檢出率和檢測(cè)濃度越來越高[2]，其檢出濃度可以高達(dá)0.7088 μg·L-1[3]，其潛在的生態(tài)毒性效應(yīng)也已經(jīng)成為熱點(diǎn)課題。殺蟲劑類EDCs是通過攝入、累積等途徑進(jìn)入生物體，通過與雌激素、雄激素和甲狀腺素等激素受體結(jié)合、與其他受體結(jié)合以及非受體途徑干擾體內(nèi)激素平衡并改變內(nèi)分泌系統(tǒng)功能[4-5]，從而對(duì)水生生物的生長(zhǎng)發(fā)育和存活率具有顯著的不良影響。如殘留的殺蟲劑會(huì)干擾溞類的產(chǎn)卵行為，影響其存活率等[6]，具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的殺蟲劑還會(huì)與生物體內(nèi)的生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)中不同的內(nèi)分泌激素受體相結(jié)合導(dǎo)致各系統(tǒng)的紊亂，從而影響生物體的表面形態(tài)、行為活動(dòng)、生長(zhǎng)繁殖和存活。

水溞是一種廣泛存在的淡水浮游動(dòng)物，其中小型甲殼動(dòng)物大型溞(Daphniamagna)屬于枝角目，由于它具有易于培養(yǎng)、繁殖周期短、對(duì)環(huán)境條件敏感等特點(diǎn)，是被廣泛用作毒理學(xué)研究的模式生物之一[7]。在過去的20年里，大量關(guān)于殺蟲劑對(duì)大型溞慢性毒性影響的研究表明，長(zhǎng)期暴露于殺蟲劑會(huì)導(dǎo)致無脊椎動(dòng)物出現(xiàn)形態(tài)異常，生殖改變、產(chǎn)生雄性后代、蛻皮頻率異常和基因差異表達(dá)的現(xiàn)象[8]。有研究發(fā)現(xiàn)大型溞致死現(xiàn)象與殺蟲劑的神經(jīng)毒性密切相關(guān)[9]，但具體的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步揭示。目前的研究主要集中于殺蟲劑類EDCs對(duì)大型溞的急性或慢性毒性，隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們通過應(yīng)用DNA微陣列分析和高通量測(cè)序等技術(shù)將大型溞的表型生理變化與基因表達(dá)水平聯(lián)系起來[10]，為識(shí)別生物標(biāo)志物和毒性作用途徑提供依據(jù)，提供了從宏觀到微觀角度系統(tǒng)分析殺蟲劑類EDCs對(duì)水生溞類生態(tài)毒性的新視角。

由于殺蟲劑的作用途徑十分復(fù)雜，本文旨在根據(jù)目前的研究現(xiàn)狀總結(jié)歸納典型的殺蟲劑類EDCs對(duì)大型溞的毒性效應(yīng)和作用機(jī)制。通過繁殖、生長(zhǎng)、蛻皮和性別比例等典型生理參數(shù)的變化直觀反映殺蟲劑類EDCs在生理層面對(duì)大型溞生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖的影響，從酶活性變化的角度分析由此造成的氧化應(yīng)激和神經(jīng)系統(tǒng)損傷，識(shí)別潛在的生物標(biāo)志物，并在基因表達(dá)水平上闡明殺蟲劑類EDCs改變的通路，揭示其毒性作用的分子機(jī)制，為進(jìn)行生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和污染物質(zhì)的管理提供依據(jù)。

1 殺蟲劑類EDCs對(duì)大型溞的急性毒性效應(yīng)(Acute toxic effects of pesticides EDCs on Daphnia magna)

大型溞作為生態(tài)毒理學(xué)研究的模式生物之一，通常是根據(jù)經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD)準(zhǔn)則[11]獲得的不同殺蟲劑類EDCs急性毒性研究結(jié)果。通過檢索Elsevier Science Direct全文數(shù)據(jù)庫(kù)、Springer全文數(shù)據(jù)庫(kù)、Web of Science和美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)(American Chemical Society, ACS)數(shù)據(jù)庫(kù)，歸納近25年有關(guān)淡水無脊椎動(dòng)物的生態(tài)毒理學(xué)參數(shù)包括：半數(shù)效應(yīng)濃度(concentration for 50% of maximal effect, EC50)、半數(shù)致死濃度(lethal concentration for 50%, LC50)[12]等表征參數(shù)如表1所示。

對(duì)比表1中不同EDCs的急性毒性參數(shù)發(fā)現(xiàn)，具有保幼激素活性的殺蟲劑和有機(jī)磷類、擬除蟲菊酯類殺蟲劑的急性毒性較強(qiáng)，48 h-EC50大多低于10 mg·L-1，表明實(shí)際環(huán)境濃度下的殺蟲劑會(huì)對(duì)水溞和小型水生動(dòng)物的健康產(chǎn)生威脅。其中，吡丙醚作為防治公共衛(wèi)生蟲害的殺蟲劑，應(yīng)用廣泛。Ginjupalli和Baldwin[36]發(fā)現(xiàn)吡丙醚作為保幼激素的類似物，幼齡大型溞對(duì)其非常敏感，能顯著干擾幼體的生理發(fā)育和繁殖，當(dāng)大型溞暴露于25 ng·L-1吡丙醚時(shí)就開始出現(xiàn)發(fā)育延緩和卵子的孵化率降低現(xiàn)象，從而導(dǎo)致大型溞死亡率升高和種群密度下降。此外，當(dāng)大型溞暴露于250 μg·L-1的苯氧威時(shí)，水溞胚胎的孵化率會(huì)顯著降低，在高濃度下會(huì)出現(xiàn)完全不孵化現(xiàn)象[37]。這些毒性差異可能是由于不同化學(xué)物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)和環(huán)境中的累積量所導(dǎo)致的。由于大部分殺蟲劑對(duì)大型溞表現(xiàn)出強(qiáng)烈的毒性作用和過量毒性，這不僅僅與疏水性有關(guān)，還與極性比表面積、極性、分子體積和氫鍵堿度有關(guān)。這些特征共同表明具有保幼激素活性的殺蟲劑與大型溞生物活性大分子之間是基于配體-受體相關(guān)的特異性作用發(fā)揮毒性的[38]。

表1 典型的殺蟲劑類內(nèi)分泌干擾物(EDCs)對(duì)大型溞的急性毒性Table 1 Acute toxicity of typical pesticides endocrine disrupting chemicals (EDCs) to Daphnia magna

2 殺蟲劑類EDCs對(duì)大型溞的慢性毒性效應(yīng)(Chronic toxic effects of pesticides EDCs on Daphnia magna)

EC50值是用劑量-反應(yīng)曲線表示不同化學(xué)物質(zhì)的急性毒性，但是由于急性毒性并不能全面反映化學(xué)物質(zhì)對(duì)模式生物長(zhǎng)時(shí)間作用的結(jié)果，因此有必要研究更具現(xiàn)實(shí)環(huán)境意義的慢性毒性實(shí)驗(yàn)，從而揭示化學(xué)物質(zhì)的慢性毒性效應(yīng)。慢性毒性實(shí)驗(yàn)是在急性毒性實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將水生動(dòng)物暴露于一系列亞致死濃度的污染物質(zhì)一定時(shí)間后，通過觀察水生溞類的生長(zhǎng)(體長(zhǎng))、繁殖、蛻皮、畸形率和雌雄比例等的變化研究污染物質(zhì)通過多種途徑對(duì)水生生物產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。通過查閱大量文獻(xiàn)整理了目前關(guān)于模式生物的毒性效應(yīng)，重點(diǎn)總結(jié)了慢性暴露于環(huán)境相關(guān)濃度的殺蟲劑類EDCs后對(duì)大型溞不同生理指標(biāo)的影響。

2.1 殺蟲劑類EDCs對(duì)大型溞的生長(zhǎng)和繁殖的影響

雌性大型溞新生兒的個(gè)數(shù)作為典型的生理指標(biāo)之一，可以有效評(píng)估殺蟲劑類EDCs的生殖毒性。多項(xiàng)研究表明，雌性大型溞新生兒的個(gè)數(shù)與殺蟲劑的濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。常見的殺蟲劑對(duì)大型溞繁殖的抑制效應(yīng)如表2所示。例如，Oda等[39]將大型溞暴露于0.01 μg·L-1的苯氧威21 d后，雌性大型溞新生兒的個(gè)數(shù)相較于對(duì)照組減少了約85%；當(dāng)暴露于100 μg·L-1苯氧威21 d后，雌性大型溞幾乎不產(chǎn)生后代。Abe等[40]對(duì)苯蟲醚的研究也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。這些結(jié)果表明，大型溞新生兒的個(gè)數(shù)是極其敏感的生理指標(biāo)，能夠直觀地反映殺蟲劑的慢性毒性效應(yīng)。此外，環(huán)境中某些低濃度的固醇類化合物可能會(huì)影響水溞的繁殖能力，如有研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期暴露于低濃度的雌二醇后，大型溞的繁殖力降低了25%左右，通過檢測(cè)體內(nèi)的卵黃蛋白原濃度驗(yàn)證了該現(xiàn)象是由于內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂導(dǎo)致的[41]。由此可見，雌性大型溞新生兒的個(gè)數(shù)可作為殺蟲劑類EDCs對(duì)大型溞生殖毒性的標(biāo)志指標(biāo)之一，并可以此來預(yù)測(cè)其對(duì)溞類種群水平的影響。

體長(zhǎng)是反映大型溞生長(zhǎng)發(fā)育速率的一個(gè)重要指標(biāo)，當(dāng)大型溞暴露于殺蟲劑時(shí)，其生長(zhǎng)速率會(huì)受到顯著的抑制。有研究者將大型溞慢性暴露于0.01 μg·L-1的苯氧威時(shí)發(fā)現(xiàn)，其體長(zhǎng)相較于對(duì)照開始出現(xiàn)顯著抑制現(xiàn)象；當(dāng)暴露濃度達(dá)到100 μg·L-1時(shí)，其體長(zhǎng)相較于對(duì)照組減小了1/4[44]，由此發(fā)現(xiàn)對(duì)體長(zhǎng)的抑制作用隨暴露濃度的增加而增強(qiáng)。氟他胺和氯丹等具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的物質(zhì)對(duì)雌性水溞的生長(zhǎng)也有影響，成蟲體長(zhǎng)與對(duì)照相比均有所下降[18]。通過測(cè)量體長(zhǎng)，從形態(tài)學(xué)角度反映了化學(xué)物質(zhì)對(duì)溞類的毒性效應(yīng)。

2.2 殺蟲劑類EDCs對(duì)大型溞發(fā)育畸形的影響

此外，慢性暴露于殺蟲劑類EDCs后也會(huì)導(dǎo)致大型溞發(fā)育畸形。有研究表明殺蟲劑能夠通過抑制幼蟲變形來降低其成蟲的存活率，從而起到殺滅蟲害的作用。通過整理已有的研究發(fā)現(xiàn)，大型溞的發(fā)育畸形主要包括彎曲或未伸展的殼棘、腫脹的育雛室、發(fā)育不良的第二觸角、復(fù)眼渾濁、流產(chǎn)卵和四肢發(fā)紅等現(xiàn)象。例如，Kim等[44]發(fā)現(xiàn)大型溞在苯氧威中經(jīng)過21 d的慢性暴露，出現(xiàn)了不同程度的畸形包括彎曲或未伸展的殼棘、腫脹的育雛室和發(fā)育不良的第二觸角；當(dāng)大型溞發(fā)育的胚胎暴露于3 μg·L-1的苯氧威時(shí)，50%的胚胎會(huì)發(fā)育畸形如第二觸角不完全發(fā)育，進(jìn)一步表明苯氧威會(huì)引起生物體功能的紊亂從而導(dǎo)致發(fā)育異常。

2.3 殺蟲劑類EDCs對(duì)大型溞性別分化的影響

目前的研究證據(jù)表明，性別決定系統(tǒng)可以從現(xiàn)象上分為2組：基因型性別決定和環(huán)境性別決定[49-50]。在適宜的環(huán)境條件下，大型溞屬于孤雌生殖。但是，一旦環(huán)境條件發(fā)生變化，大型溞就會(huì)改變繁殖策略開始產(chǎn)生雄性后代。大型溞的性別分化主要是通過第二觸角的形態(tài)來判斷，利用顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)雄性大型溞的第二觸角較長(zhǎng)，而雌性大型溞的第二觸角短而粗[12]，由此能夠清晰地區(qū)分大型溞的性別。

水溞的性別鑒定發(fā)生在卵沉積前1 h左右的關(guān)鍵時(shí)期[51]，在大型溞雄性后代的誘導(dǎo)已被證明是檢測(cè)保幼激素類似物的高度特異性終點(diǎn)[52]。目前已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道保幼激素會(huì)調(diào)節(jié)昆蟲的各種生理過程，包括性腺發(fā)育、繁殖和變形等，具有誘導(dǎo)雄性后代產(chǎn)生的保幼激素。目前，具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的殺蟲劑對(duì)水溞性別分化的顯著誘導(dǎo)作用已經(jīng)得到了廣泛的驗(yàn)證，如表3所示，這是由于大部分殺蟲劑都屬于保幼激素類似物且具有保幼激素活性導(dǎo)致的，但其具體的作用機(jī)理尚不清晰。例如，Abe等[40]通過研究發(fā)現(xiàn)苯蟲醚作為一種保幼激素類似物能夠顯著誘導(dǎo)大型溞的性別分化，其誘導(dǎo)雄性后代的最低有效濃度為4 ng·L-1，且當(dāng)暴露濃度為32 ng·L-1時(shí)能產(chǎn)生100%的雄性新生兒，表明雄性新生兒的比例與苯蟲醚的暴露濃度呈正相關(guān)趨勢(shì)。此外，在法尼酸甲酯、苯氧威和吡丙醚作用下均能誘導(dǎo)大型溞產(chǎn)生100%的雄性后代[53]，通過評(píng)價(jià)溞類在水環(huán)境中的繁殖策略將有助于監(jiān)測(cè)人類活動(dòng)對(duì)水生生態(tài)環(huán)境的潛在不良影響。影響大型溞繁殖的濃度差異可能歸因于化學(xué)物質(zhì)所具有的毒性和保幼激素的活性。此外，大型溞對(duì)保幼激素類似物的敏感性具有遺傳差異[54]，因此由繁殖率下降和性別比改變引起的種群生長(zhǎng)率的差異會(huì)可能會(huì)導(dǎo)致大型溞種群基因結(jié)構(gòu)的改變從而對(duì)種群產(chǎn)生有害影響。

表2 常見的殺蟲劑類內(nèi)分泌干擾物對(duì)大型溞的生殖毒性Table 2 Toxicity of common pesticides endocrine disrupting chemicals to the reproduction of Daphnia magna

表3 常見的殺蟲劑類內(nèi)分泌干擾物對(duì)大型溞性別分化的影響Table 3 Effect of common pesticides endocrine disrupting chemicals on sex differentiation of Daphnia magna

分類Classification殺蟲劑Pesticide暴露時(shí)間/dExposure time/d生理指標(biāo)Physiological index暴露濃度/(mg·L-1)Exposure concentration /(mg·L-1)結(jié)果Results其他Others蚊蠅醚Pyriproxyfen烯蟲乙酯Hydroprene保幼醚Epofenonane烯蟲炔酯Kinoprene烯蟲酯Methoprene法尼酸甲酯Methyl farnesate苯蟲醚Diofenolan阿特拉津Atrazine6每窩中雄性后代的比例Proportion of male offspring per brood0.00002～0.00180～1[31]12雄性新生兒的總個(gè)數(shù)Total number of male neonates0～0.00040～44.25[36]12雌性新生兒的總個(gè)數(shù)Total number of female neonates0～0.00048.9～87.64[36]16雄性新生兒的總個(gè)數(shù)Total number of male neonates0～0.000050～50.4[36]16雌性新生兒的總個(gè)數(shù)Total number of female neonates0～0.0000524.8～102[36]18雄性新生兒的總個(gè)數(shù)Total number of male neonates0～0.000050～5.83[36]18雌性新生兒的總個(gè)數(shù)Total number of female neonates0～0.000050～55.11[36]21總新生兒的性別比Sex ratio of total neonates0.13～3.30～0.96[54]21雌性新生兒的總個(gè)數(shù)Total number of female neonates0～0.00055.2～107.4[54]21雄性新生兒的總個(gè)數(shù)Total number of male neonates0～0.00050～40.4[58]21每窩中雄性后代的比例Proportion of male offspring per brood0～0.00050.06～1[58]21總新生兒的性別比Sex ratio of total neonates0.2～3.50～0.99[56]21總新生兒的性別比Sex ratio of total neonates3.4～5.40.19～0.99[54]21總新生兒的性別比Sex ratio of total neonates0.37～0.770～0.95[54]21總新生兒的性別比Sex ratio of total neonates6.3～8.30.1～0.98[54]21總新生兒的性別比Sex ratio of total neonates5.8～7.40～0.95[54]6每窩中雄性后代的比例Proportion of male offspring per brood0.00016～0.160～1[31]8每窩中雄性后代的比例Proportion of male offspring per brood0～0.180.09～0.17[47]21總新生兒的性別比Sex ratio of total neonates0～6.70～0.67[56]2總新生兒的性別比Sex ratio of total neonates0～0.70～1[40]21總新生兒的性別比Sex ratio of total neonates0～0.000060～0.99[40]21總新生兒的性別比Sex ratio of total neonates0～150～0.94[43]

2.4 殺蟲劑類EDCs對(duì)大型溞蛻皮的影響

蛻皮是指生物體在生長(zhǎng)過程中脫去舊表皮并長(zhǎng)出新表皮的過程，受蛻皮激素控制，蛻皮激素是由P450酶對(duì)膽固醇進(jìn)行酶化修飾而產(chǎn)生的類固醇激素，是一種普遍的生理現(xiàn)象[59]。大型溞為了適應(yīng)體型增長(zhǎng)需要更大的外骨骼。因此，蛻皮是大型溞發(fā)育成熟所必需的生理過程之一。未暴露的母本動(dòng)物平均在6 d后進(jìn)行第4次蛻皮，這標(biāo)志著幼年生命階段的結(jié)束。發(fā)育時(shí)間以及21 d后的繁殖量都與成功完成蛻皮周期有關(guān)，但在一定濃度的殺蟲劑作用下大型溞會(huì)出現(xiàn)明顯的蛻皮困難，因此蛻皮周期可以作為評(píng)價(jià)相關(guān)毒性的指標(biāo)。

目前的研究已經(jīng)表明部分與類固醇相似的殺蟲劑會(huì)導(dǎo)致大型溞出現(xiàn)蛻皮延遲、蛻皮數(shù)量減少和不完全蛻皮等現(xiàn)象。例如，有研究表明，將大型溞短期暴露于20-羥基蛻皮激素后，與對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)大型溞的蛻皮頻率會(huì)顯著降低，可能與蛻皮液中分解酶殼二糖酶的活性有關(guān)[60]。由于一些類固醇與蛻皮激素具有相似的結(jié)構(gòu)，因此硫丹與蛻皮激素受體的結(jié)合阻止了蛻皮激素與蛻皮激素受體的特異性結(jié)合，從而導(dǎo)致大型溞蛻皮的延遲[61]。因此，蛻皮這一生理指標(biāo)可以看作是反映類固醇類殺蟲劑對(duì)甲殼動(dòng)物毒性效應(yīng)的典型標(biāo)志物之一。

3 殺蟲劑類EDCs對(duì)大型溞的毒性作用機(jī)制(The toxic mechanism of pesticides EDCs on Daphnia magna)

3.1 殺蟲劑類EDCs對(duì)大型溞生物酶活性的影響

3.1.1 殺蟲劑對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)酶的影響

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已有大量研究根據(jù)基因表達(dá)水平研究污染物對(duì)大型溞的生長(zhǎng)、繁殖等方面的影響，以識(shí)別改變的生物途徑和潛在的生物標(biāo)記物。當(dāng)大型溞暴露于外源化合物時(shí)，可能會(huì)在亞致死和生態(tài)相關(guān)的水平發(fā)生氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、膜功能障礙、DNA和蛋白質(zhì)損傷等[62]。已有大量研究表明，殺蟲劑會(huì)改變水生動(dòng)物體內(nèi)抗氧化酶的活性，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。例如，當(dāng)大型溞暴露于增塑劑雙酚F時(shí)，大型溞會(huì)通過激活抗氧化系統(tǒng)中的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)來平衡細(xì)胞體內(nèi)的活性氧；但是，過量活性氧的產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致顯著的氧化損傷包括抗氧化酶失活、DNA損傷和脂質(zhì)過氧化等現(xiàn)象。其中脂質(zhì)過氧化是導(dǎo)致細(xì)胞功能受損的主要機(jī)制，具體表現(xiàn)為脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量的增加，如當(dāng)大型溞暴露于0.1 μg·L-1的雙酚A時(shí)，MDA的含量相較于對(duì)照組增加了10%[63]。因此，脂質(zhì)過氧化和抗氧化防御系統(tǒng)能作為生物標(biāo)志物來評(píng)價(jià)環(huán)境中雙酚類物質(zhì)的毒性作用。

3.1.2 殺蟲劑類EDCs對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)酶的影響

大部分殺蟲劑對(duì)大型溞具有神經(jīng)毒性作用，具體表現(xiàn)為乙酰膽堿酯酶(AChE)活性的抑制延長(zhǎng)了神經(jīng)傳遞，甚至在高劑量暴露下出現(xiàn)致死現(xiàn)象，對(duì)大型溞的健康和生存產(chǎn)生了嚴(yán)重的不良影響[64-65]。大量研究表明AChE活性已經(jīng)被用于檢測(cè)有機(jī)磷殺蟲劑和氨基酸甲酯類殺蟲劑對(duì)無脊椎動(dòng)物如大型溞的影響[37-38,66]。乙酰膽堿(ACh)是神經(jīng)系統(tǒng)的重要神經(jīng)遞質(zhì)之一，存在于神經(jīng)肌肉連接處、內(nèi)臟運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的突觸和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等位置，對(duì)維持水生生物的肌肉功能具有重要作用，其含量的改變會(huì)顯著影響肌肉收縮進(jìn)而改變行為活動(dòng)[67-68]。AChE作為水解酶，存在于神經(jīng)和肌肉細(xì)胞之間的突觸間隙，能使ACh快速水解有效地中止突觸傳遞[69]。當(dāng)大型溞暴露于殺蟲劑胺甲萘?xí)r，AChE活性會(huì)忽然顯著下降，但由于補(bǔ)償機(jī)制即AChE合成的刺激，其活性會(huì)在20 h內(nèi)恢復(fù)到60%左右，由于這種恢復(fù)是有限的，AChE活性會(huì)隨著暴露時(shí)間再次顯著下降，從而導(dǎo)致ACh在突觸間隙內(nèi)的濃度升高誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂[69-70]。AChE活性的抑制會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)末梢激活紊亂、神經(jīng)傳導(dǎo)能力喪失和生物體癱瘓等現(xiàn)象，進(jìn)而表現(xiàn)為多動(dòng)、協(xié)調(diào)性喪失、抽搐和癱瘓等多種行為變化最終死亡[71]。Ren等[72]的研究驗(yàn)證了上述結(jié)果，當(dāng)大型溞暴露于高濃度敵敵畏時(shí)，AChE活性在6 h內(nèi)顯著降低并表現(xiàn)出游泳能力喪失直至沉入容器底部。由上述研究可知，神經(jīng)系統(tǒng)損傷會(huì)使大型溞喪失運(yùn)動(dòng)和攝食能力，從而造成致命影響，這可能是大型溞死亡率上升的主要原因。此外，隨著殺蟲劑種類的日益豐富，研究人員發(fā)現(xiàn)新煙堿類、有機(jī)氯類、苯基吡唑類和除蟲菊酯等殺蟲劑也能顯著抑制AChE活性，并對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)軸突、突觸前和突觸后的靶點(diǎn)具有不良影響[73]。因此，AChE活性可以作為大型溞響應(yīng)殺蟲劑毒性作用的生物標(biāo)志物，為揭示新興殺蟲劑對(duì)大型溞等水生動(dòng)物的毒性作用機(jī)制提供了參考依據(jù)。

3.2 殺蟲劑類EDCs對(duì)大型溞生物基因表達(dá)的影響

隨著分子生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域中組學(xué)工具的廣泛應(yīng)用，通過常見的DNA微陣列技術(shù)、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)和定量實(shí)時(shí)PCR驗(yàn)證等組學(xué)技術(shù)手段來揭示污染物及其代謝產(chǎn)物與核酸和酶等生物大分子之間的相互作用關(guān)系，以識(shí)別改變的生物途徑和潛在的生物標(biāo)記物[74]，為表征外源物質(zhì)的毒性作用模式和識(shí)別作用途徑提供基礎(chǔ)。有研究將大型溞暴露于甲維鹽48 h后測(cè)定了整體轉(zhuǎn)錄組的變化和蛻皮受體的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)改變了神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的蛻皮、擾亂了能量穩(wěn)態(tài)、抑制DNA修復(fù)和誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡途徑與大型溞的蛻皮頻率和存活率下降有關(guān)[75]。

通過基因表達(dá)水平的變化，以驗(yàn)證生理指標(biāo)與特定基因功能之間的關(guān)系，并揭示其作用機(jī)理，為生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供依據(jù)。通過總結(jié)目前的研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)，基于抗氧化防御中酶活性、基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)來揭示生物體表型變化與分子作用機(jī)制之間關(guān)系的研究較為廣泛。

通過整理文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，已有大量的研究表明具有保幼激素活性的殺蟲劑能在分子水平上顯著地影響大型溞，并通過相關(guān)的生物標(biāo)志物將轉(zhuǎn)錄組和有害表型反應(yīng)聯(lián)系起來。例如，Kim等[44]利用寡核苷酸DNA微陣列技術(shù)發(fā)現(xiàn)，苯氧威的暴露濃度與卵黃蛋白原基因的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，當(dāng)苯氧威的暴露濃度為0.01 μg·L-1時(shí)，卵黃蛋白原基因的表達(dá)水平比對(duì)照組低約75%。同時(shí)，Toyota等[16]也證明了大型溞暴露于保幼激素類似物后，新生兒數(shù)量的減少歸因于卵黃蛋白原基因表達(dá)的抑制，但具體的作用機(jī)理仍不清楚。由此可見，為胚胎發(fā)育提供能量的卵黃蛋白原基因可用作評(píng)估殺蟲劑對(duì)大型溞繁殖毒性的重要生物標(biāo)志物。保幼激素酯酶和保幼激素環(huán)氧化物水解酶是2種保幼激素降解酶，主要用于維持昆蟲體內(nèi)正常的保幼激素滴度[76]。有研究表明當(dāng)大型溞暴露于烯蟲酯、保幼醚和中、高濃度的苯氧威時(shí)，保幼激素環(huán)氧化物水解酶的表達(dá)上調(diào)，而保幼激素酯酶的表達(dá)沒有變化[77]。然而，當(dāng)大型溞暴露于苯蟲醚時(shí)保幼激素酯酶的表達(dá)會(huì)顯著上調(diào)。因此可知，保幼激素降解酶對(duì)具有保幼激素活性的化學(xué)物質(zhì)具有不同的選擇性[40]，能夠用作殺蟲劑暴露下潛在的生物標(biāo)志物。

將水溞的整個(gè)基因組表達(dá)水平的改變用于分析殺蟲劑的作用機(jī)理，了解孤雌生殖的遺傳基礎(chǔ)及其對(duì)基因方面的影響。然而，關(guān)于大型溞的雄性誘導(dǎo)機(jī)制和性別分化的相關(guān)研究仍然較少。法尼酸甲酯是一種內(nèi)源性的保幼激素，它在雄性新生兒中的含量顯著高于雌性新生兒。此外，已經(jīng)有研究證明法尼酸甲酯信號(hào)的傳導(dǎo)可以通過不利環(huán)境刺激來確定大型溞新生兒的性別[78-79]。淡水枝角大型溞在短日照條件下會(huì)產(chǎn)生雄性大型溞，這是由于NMDA型離子型谷氨酸受體信號(hào)的激活促進(jìn)了法尼酸甲酯的合成。當(dāng)大型溞暴露于外源性法尼酸甲酯時(shí)，蛋白激酶C可能與法尼酸甲酯信號(hào)的傳導(dǎo)有關(guān)[80]。此外，保幼激素含量在誘導(dǎo)大型溞性別決定中也發(fā)揮著重要作用。Masteling等[62]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)大型溞暴露于硫丹硫酸鹽、烯蟲乙酯時(shí)會(huì)以濃度依賴的方式產(chǎn)生雄性后代。其中，當(dāng)大型溞暴露于保幼激素Ⅲ并產(chǎn)生雄性新生兒時(shí)，基因Dsx1和Dsx2的表達(dá)均上調(diào)，這一過程有助于黃體形成過程中的性別決定，且當(dāng)雄性新生兒發(fā)育至性成熟時(shí)，基因Dsx2的表達(dá)會(huì)顯著增加[81]。由此可知，具有保幼激素活性的殺蟲劑是通過干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)來影響大型溞的生殖發(fā)育。但就目前的研究現(xiàn)狀而言，仍有許多與性別分化與生殖相關(guān)的基因是未知的，需要通過基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究來進(jìn)一步了解。

4 展望(Prospect)

近些年，關(guān)于殺蟲劑對(duì)大型溞的毒理學(xué)研究已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)展，但目前的大多數(shù)研究?jī)H局限于殺蟲劑對(duì)水生蚤類的表型影響，關(guān)于其生態(tài)毒性效應(yīng)研究仍缺乏系統(tǒng)性，因此，今后可在以下2個(gè)方面做進(jìn)一步的研究。

首先，已開展的研究大多是針對(duì)一種污染物對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)，關(guān)于2種及2種以上不同污染物復(fù)合毒性的研究相對(duì)較少。在自然環(huán)境中，通常是多種化學(xué)物質(zhì)共同存在，考慮到所研究問題的現(xiàn)實(shí)性，應(yīng)該更加關(guān)注殺蟲劑的復(fù)合毒性。例如，有研究通過構(gòu)建模型等方法研究氟苯達(dá)唑與芬苯達(dá)唑?qū)Υ笮蜏械幕旌隙拘裕軌蚋鼫?zhǔn)確系統(tǒng)地評(píng)價(jià)污染物質(zhì)對(duì)生態(tài)環(huán)境所造成的危害[82]。

其次，殺蟲劑大多是難降解的污染物質(zhì)，會(huì)在自然環(huán)境中長(zhǎng)期存在并且不斷累積，因此會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生慢性毒性。但是，部分污染物質(zhì)毒性較弱，需要經(jīng)過多個(gè)世代的暴露后才會(huì)對(duì)后代產(chǎn)生毒性作用，因此有必要對(duì)污染物進(jìn)行多代研究來更準(zhǔn)確地揭示其作用機(jī)制，應(yīng)用長(zhǎng)期和多代暴露方法來評(píng)估殺蟲劑對(duì)生態(tài)環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

通訊作者簡(jiǎn)介：李琦(1974—)，女，博士，教授，主要研究方向?yàn)榄h(huán)境有機(jī)污染物和重金屬的污染控制及修復(fù)、水資源和水環(huán)境安全。