犀角地黃湯對咪喹莫特誘導的BALB/c小鼠銀屑病模型IL-23/IL-17/IL-22軸的作用機制研究

周學麗、袁世清、李春霄、左小紅、吳軍、萬鵬，

銀屑病是一種常見的以表皮角化不全、白細胞浸潤、真皮毛細血管擴張為特征的慢性遺傳性炎癥性疾病[1]。全世界各地均有銀屑病病例發(fā)生，其患病率為2-3%[2]，甚至高達4.8%[3]，其中20%患者已發(fā)展為重度銀屑病，并伴有高風險的非皮膚癌證[4]。銀屑病的發(fā)病機制非常復雜，被認為與先天和獲得性免疫反應、遺傳因素、環(huán)境因素和代謝紊亂等多種因素有關。其中，L-23/IL-17/IL-22軸是誘發(fā)銀屑病患者皮膚炎性細胞大量浸潤和表皮過度增生的主要誘因[5]。

銀屑病的傳統(tǒng)治療手段很多，但其療效卻并不令人滿意。外用藥物和光療或全身藥物的組合已經(jīng)被很好地確定為影響大面積的中到重度銀屑病的治療方案[6]，然而仍然需要新的方法和藥物來提高治療效果[7]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療銀屑病方面積累了豐富的經(jīng)驗，犀角地黃湯作為治療銀屑病的常用經(jīng)典方藥之一，其良好的臨床療效已被越來越多研究所證實[8-10]。本研究采用犀角地黃湯對咪喹莫特誘導的銀屑病模型小鼠進行干預，通過系統(tǒng)觀察和分析小鼠皮損的臨床與組織病理學改變、血清中與L-23/IL-17/IL-22軸相關的炎癥因子的表達情況等，以期探索犀角地黃湯治療銀屑病的療效機制，從而為銀屑病的中醫(yī)藥臨床防治提供有效經(jīng)驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 BALB/c小鼠，SPF級，體質量18～22g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK（川）2020-030。

1.1.2 實驗藥物 犀角地黃湯藥物組成：水牛角30 g，生地30 g，赤芍15 g，牡丹皮10 g。制備方法：稱取各藥材，用水煎煮制備，共煎煮2次，煎出液合并，濃縮到每劑藥85 ml。犀角地黃湯的人體推薦攝入量為85 g/d生藥，相當于1.42 g﹒kg-1﹒d-1生藥（成人以60 kg計）。

1.1.3 主要試劑 甲氨蝶呤片（珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司中山分公司，國藥準字H20040283），5%咪喹莫特乳膏（上海上藥信誼藥廠有限公司，國藥準字H31020644）。白細胞介素‐1β（ⅠL‐1β）、白細胞介素-17（IL-17A）、白細胞介素-22（IL-22）、白細胞介素-23（IL-23）、腫瘤壞死因子‐α（TNF‐α）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；其余常規(guī)試劑均為分析純。

1.1.4 主要儀器 酶標儀DENLEY DR AGON Wellscan MK 3（Thermo），洗板機Wellwash 4 MK2（Thermo），數(shù)字顯示隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱PYX-DHS（上海躍進醫(yī)療器械廠），離心機TGL-16B（上海安亭科學儀器廠），移液槍Thermo labsystems、漩渦混合器XW-80A（上海青浦滬西儀器廠），電熱恒溫鼓風干燥箱DHG-9023A（上海精宏實驗設備有限公司），連續(xù)分液器（TOMOS LIFE SCIENCE Group），高通量組織研磨器（寧波新芝）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及給藥方法 將60只BALB/c小鼠隨機分為6組，每組10只，即：正常組、模型組、甲氨蝶呤（2 mg﹒kg-1﹒d-1）對照組、犀角地黃湯低（8.7 g﹒kg-1﹒d-1）、中（17.4 g﹒kg-1﹒d-1，相當于臨床等效劑量）、高（34.8 g﹒kg-1﹒d-1）劑量組。以戊巴比妥鈉（36 mg/kg）經(jīng)腹腔注射麻醉后，進行小鼠背部脫毛，面積2×3cm，休息3天后開始實驗。

除正常組涂抹凡士林外，其余各組每日在小鼠裸露背部涂抹5%咪喹莫特（IMQ）乳膏，劑量為62.5 mg，每日1次。間隔4小時后，各組給予相應藥物灌胃，每日2次，連續(xù)8天?？瞻捉M和模型組給與等量的生理鹽水。

1.2.2 PASI評分 依據(jù)銀屑病皮損嚴重程度指數(shù)（PASI）評分標準，每日照相記錄和評價小鼠皮損處紅斑、鱗屑及浸潤程度的情況積分。三項癥狀評分分別為0-4分。其中0：無癥狀；1：輕度；2：中度；3：重度；4：極其嚴重。三者評分之和為總評分，0-12分，總評分越高表示皮損越嚴重。

1.2.3 皮損取材 各組小鼠于給藥8 d后取材，摘雙側眼球取血，同時按照九格法剪取各組相對應皮損處組織保存待用。最后采用戊巴比妥鈉（36 mg/kg）腹腔注射麻醉處死小鼠。

1.2.4 蘇木精-伊紅（HE） 取出小鼠背部皮膚組織后進行酒精梯度脫水，二甲苯透明，用石蠟包埋后制備切片。使用蘇木精-伊紅（HE）染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察表皮變化。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA法）檢測對各組小鼠血清中ⅠL‐1β、IL-17A、IL-22、IL-23 和TNF‐α等炎性細胞因子進行定量分析，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.6 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用IBM SPSS26.0和Graphpad Prism8.0軟件進行統(tǒng)計分析。同一時間多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較用LSD法，檢驗水準α=0.05，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 犀角地黃湯對IMQ誘導的小鼠銀屑病樣皮損的影響

根據(jù)PASI評分標準，實驗第3天起，模型組小鼠背部皮膚開始出現(xiàn)紅斑、鱗屑等皮損，其程度隨實驗進行而逐漸加重，至第8天最為嚴重，表現(xiàn)為大面積紅斑、被覆鱗屑、明顯浸潤等。與模型組比較，正常組皮膚無明顯變化，甲氨蝶呤組紅斑和鱗屑等銀屑病樣癥狀均明顯減輕，犀角地黃湯各劑量組表現(xiàn)出與甲氨蝶呤組相同的發(fā)展趨勢。PASI評分顯示，除正常組外，其余各組分值均逐日有不同程度的增加；與模型組比較，犀角地黃湯各劑量組與甲氨蝶呤組評分均有所降低，其PASI總分自第3天起差異開始具有統(tǒng)計學意義（F=3.107，P＜0.05）。提示犀角地黃湯在該模型中具有抑制銀屑病樣皮損產(chǎn)生的作用（見圖1、圖2）。

2.2 犀角地黃湯對咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮損組織學的影響

HE染色結果顯示（見圖3），正常組、模型組、甲氨蝶呤組和犀角地黃湯低、中、高劑量組的皮膚組織狀態(tài)具有明顯差異。與正常組比較，模型組可見表皮角化過度及融合性角化不全，顆粒層增厚，牟羅微膿腫，真皮淺層炎癥細胞浸潤，真皮血管擴張，扭曲、充盈，表皮散在中性粒細胞浸潤，呈銀屑病型增生，提示造模成功。與甲氨蝶呤組效果相近，犀角地黃湯高、中劑量組明顯改善IMQ誘導的銀屑病樣皮損。

2.3 犀角地黃湯對咪喹莫特誘導的銀屑病小鼠血清中IL-23/IL-17/IL-22軸等相關炎性細胞因子表達的影響

與正常組相比，模型組小鼠的血清中ⅠL‐1β、IL-17A、IL-22、IL-23 和TNF‐α均大量表達。與模型組相比，甲氨蝶呤組和犀角地黃湯各劑量組均顯著抑制了ⅠL‐1β、IL-17A、IL-22、IL-23 和TNF‐α炎性細胞因子的過量表達（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義。但與甲氨蝶呤組相比，犀角地黃湯各組的抑制作用相近（P＞0.05），低、中、高劑量組之間作用亦相近（P＞0.05），差異無統(tǒng)計學意義（見圖4）。

3 討論

銀屑病是一種T細胞介導的慢性炎癥性皮膚病，病理特征主要為表皮角質形成細胞過度增殖和異常分化[11,12]，臨床以紅斑和銀白色鱗屑為主要表現(xiàn)。2008 年我國開展的一次大規(guī)模銀屑病流行病學調查[13]發(fā)現(xiàn)，我國銀屑病標化患病率為0.47%，提示我國銀屑病患病率呈現(xiàn)上升趨勢。由于銀屑病病因復雜、病程長、易復發(fā)，常給病人帶來生理、心理、社會等多方面的不良影響，嚴重影響病人的生活質量[14]。然而，銀屑病的臨床治療難度較大，部分治療方案不僅效果欠佳，還可導致嚴重的不良反應[15]。不僅如此，銀屑病的治療費用還頗為昂貴，根據(jù)美國全美銀屑病基金會的數(shù)據(jù)顯示，每年直接和間接用于銀屑病的費用已經(jīng)超過了110億美元[16]，其中尤以生物療法最為昂貴[17]。因此，為了篩選出療效優(yōu)良、副作用小、費用低廉的治療藥物，有必要進一步開展傳統(tǒng)中醫(yī)藥防治銀屑病的相關機制研究。本研究采用咪喹莫特誘導成功建立了銀屑病小鼠模型。根據(jù)PASI評分和HE染色結果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，犀角地黃湯各劑量組紅斑、鱗屑、浸潤等銀屑病樣癥狀均明顯減輕，與甲氨蝶呤組效果相近，提示犀角地黃湯在該模型中具有抑制銀屑病樣癥狀產(chǎn)生的作用。

以往的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，銀屑病皮損中Th17細胞數(shù)量增加，IL-17A、IL-22、IL-23等細胞因子水平升高，在銀屑病發(fā)病機制中起主要作用[18-20]。IL-17能誘導角質形成細胞表達趨化因子如CCL20、CXCL1等[21,22]，它們可以招募更多的炎癥細胞到達銀屑病的皮膚病灶。同時，這些炎癥細胞或者角質形成細胞又能產(chǎn)生TNF‐α、ⅠL‐1β、IL-6等細胞因子，反過來刺激樹突狀細胞產(chǎn)生IL-23，從而形成一個炎癥應答級聯(lián)放大的循環(huán)體系[23]。此外，角質形成細胞還具有細胞因子受體，可作為活化的T淋巴細胞來源的IL-17和IL-22的靶標，從而促進角質形成細胞的增殖、異常分化和進一步產(chǎn)生細胞因子[24]。本研究小組通過ELISA法檢測各組小鼠血清中ⅠL‐1β、IL-17A、IL-22、IL-23 和TNF‐α等炎癥因子含量，結果提示，與模型組比較，犀角地黃湯各劑量組可以降低銀屑病樣小鼠上述炎癥因子的表達。

綜上所述，作為中醫(yī)藥涼血消斑法的代表方劑，犀角地黃湯可以改善咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮損，其機制可能與降低L-23/IL-17/IL-22軸相關炎性細胞因子，從而發(fā)揮抗炎功能有關。