基于Akt/eNOS通路探討延胡索乙素對缺氧/復氧誘導的心臟微血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用

馬新豫，關玲霞，張國坡

恢復冠狀動脈血流是臨床治療缺血性心臟病的常用手段，但血流灌注后易誘發(fā)新的心臟損傷，這一現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[1]。MIRI中最先受累部位是心臟微血管內(nèi)皮細胞(cardiac microvascular endothelial cells，CMECs)，內(nèi)皮細胞損傷被認為是觸發(fā)MIRI的重要因素[2-3]。因此，尋找有效減輕和改善CMECs損傷的措施對治療MIRI具有重要意義。延胡索乙素是中草藥延胡索的有效成分之一，多用于臨床鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜[4]。有研究指出，延胡索乙素可通過抑制氧化應激和鈣敏感受體/磷脂酶C-γ1途徑減輕大鼠肺血管內(nèi)皮細胞凋亡，實現(xiàn)對內(nèi)皮細胞損傷的保護[5]，但其對CMECs損傷的作用報道鮮見。既往研究顯示，激活蛋白激酶B(Akt)/內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)通路是延胡索乙素發(fā)揮保護MIRI的重要機制[6]；而Akt/eNOS通路活化異常與CMECs損傷密切相關[7]。本研究旨在探討胡索乙素對缺氧(hypoxia，H)/復氧(reoxygenation，R)所致CMECs損傷的影響，為延胡索乙素保護MIRI提供新的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 細胞：大鼠CMECs，購自武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號：CP-R135，使用專用培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

試劑：CMECs專用培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號：CM-R135)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量檢測試劑盒和大鼠白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司，貨號：BC0685，BC0170，BC0025，SEKR-0005，SEKR-0002，SEKR-0009)；Akt抑制劑LY294002(北京普洛麥格生物技術有限公司，貨號：V1201)，Akt、磷酸化(phosphorylated，p)-Akt、eNOS、p-eNOS、B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、活化的Caspase-3(cleaved-Caspase 3，C-Caspase-3)抗體(中國Abcam，貨號：ab38449，ab8933，ab76198，ab76199，ab32124，ab32503，ab184787，ab214430)。

儀器：細胞缺氧實驗系統(tǒng)(北京世聯(lián)博研科技有限公司，型號：MIC-101)，酶標儀(山東競道光電科技有限公司，型號：JD-SY96A)，流式細胞儀(北京眾力挽生物科技有限公司，型號：FACSCanto Ⅱ)。

1.2 細胞培養(yǎng)及H/R模型構(gòu)建 參照文獻[8]構(gòu)建H/R模型：以5% CO2和95% N2預處理無血清培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，放入缺氧箱內(nèi)缺氧處理3 h后，再常規(guī)復氧處理2 h。

1.3 細胞計數(shù)Kit-8(CCK-8)法檢測大鼠CMECs活力[9]將對數(shù)生長期的大鼠CMECs以每孔2×104個細胞密度接種至96孔細胞板上，加入100 μL終濃度為0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL和320 μg/mL的延胡索乙素；孵育48 h后，加入10 μL CCK-8試劑孵育2 h后，使用酶標儀于450 nm波長處檢測細胞吸光度(A)值，細胞存活率=(實驗組A-調(diào)零組A)/(對照組A-調(diào)零組A)×100%。

1.4 實驗分組及處理 實驗分為7組。正常對照組：正常培養(yǎng)不做處理；模型組：構(gòu)建H/R模型；溶媒對照組：以溶媒二甲基亞砜(DMSO)預處理2 h后行H/R處理；延胡索乙素低劑量組：以20 μg/mL延胡索乙素預處理2 h后行H/R處理；延胡索乙素中劑量組：以40 μg/mL延胡索乙素預處理2 h后行H/R處理；延胡索乙素高劑量組：以80 μg/mL延胡索乙素預處理2 h后行H/R處理；延胡索乙素高劑量+Akt抑制劑組：以80 μg/mL延胡索乙素和20 μmol/L LY294002預處理2 h后行H/R處理。

1.5 檢測大鼠CMECs LDH、SOD、MDA、IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及Caspase-3活性 收集1.4處理結(jié)束后的各組大鼠CMECs及其上清液，分別參照各試劑盒說明書檢測各組大鼠CMECs LDH、SOD、MDA、IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及Caspase-3活性。

1.6 流式細胞術檢測大鼠CMECs凋亡率 收集1.4處理結(jié)束后的各組大鼠CMECs，調(diào)整細胞密度為5×105個/mL。取細胞懸液200 μL于EP管中，避光條件下加入5 μL異硫氰酸熒光素標記的膜聯(lián)蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ-FITC)、5 μL碘化丙啶(PI)溶液室溫孵育15 min；補加200 μL上樣緩沖液后，上流式細胞儀檢測各組大鼠CMECs凋亡率[10]。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blotting)檢測大鼠CMECs中Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS、Bcl-2、Bax、Caspase-3、C-Caspase-3蛋白表達 收集1.4中處理結(jié)束后的各組大鼠CMECs，加入裂解液提取總蛋白后，參照二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒說明書檢測蛋白濃度。將變性蛋白樣品按照每孔60 μg行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳；待電泳分離結(jié)束后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白樣品轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上；采用5%脫脂奶粉封閉1 h后，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS、Bcl-2、Bax、Caspase-3、C-Caspase-3特異性一抗在4 ℃下孵育過夜；次日，以二抗孵育2 h后，化學發(fā)光法暗室內(nèi)顯影曝光；運用Quantity One軟件分析各組大鼠CMECs中Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS、Bcl-2、Bax、Caspase-3、C-Caspase-3蛋白表達水平，其中GAPDH為內(nèi)參照。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度延胡索乙素對大鼠CMECs存活率的影響 CCK-8檢測結(jié)果顯示：經(jīng)5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL延胡索乙素作用后CMECs存活率同對照0 μg/mL比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；經(jīng)160 μg/mL、320 μg/mL延胡索乙素作用后CMECs存活率較對照0 μg/mL明顯降低(P<0.05)。詳見圖1。與正常對照組比較，模型組CMECs存活率明顯降低(P<0.05)，而溶媒對照組和模型組CMECs存活率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與溶媒對照組比較，延胡索乙素作用后CMECs存活率差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且呈先升高后降低的趨勢；其中，當延胡索乙素濃度在80 μg/mL時，CMECs存活率最高，40 μg/mL和20 μg/mL次之。詳見圖2。因此，選取20 μg/mL、40 μg/mL和80 μg/mL延胡索乙素作為低劑量、中劑量、高劑量進行后續(xù)實驗。詳見圖2。

與0 μg/mL比較，＊ P<0.05。

模型組與正常對照組比較，＊P<0.05；延胡索乙素各劑量組與溶媒對照組比較，#P<0.05。

2.2 延胡索乙素對H/R誘導的大鼠CMECs LDH、SOD和MDA水平的影響 與正常對照組比較，模型組CMECs LDH和MDA水平明顯升高(P<0.05)，且SOD水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，溶媒對照組CMECs LDH、SOD和MDA水平差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與溶媒對照組比較，延胡索乙素作用后CMECs LDH和MDA水平明顯降低(P<0.05)，SOD水平明顯升高(P<0.05)，且呈延胡索乙素劑量依賴性；給予LY294002作用后，高劑量延胡索乙素對H/R誘導的大鼠CMECs LDH、MDA和SOD水平的影響明顯受到抑制(P<0.05)。詳見表1。

表1 延胡索乙素對H/R誘導的大鼠CMECs LDH、SOD和MDA水平的影響(±s，n=9)

2.3 延胡索乙素對H/R誘導的大鼠CMECs IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠CMECs IL-6、IL-1β和TNF-α水平均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，溶媒對照組大鼠CMECs IL-6、IL-1β和TNF-α水平差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與溶媒對照組比較，給予低劑量、中劑量和高劑量延胡索乙素作用后大鼠CMECs IL-6、IL-1β和TNF-α水平呈劑量依賴性降低(P<0.05)；而給予LY294002作用后，高劑量延胡索乙素對H/R誘導的大鼠CMECs IL-6、IL-1β和TNF-α水平的抑制作用明顯削弱(P<0.05)。詳見表2。

表2 延胡索乙素對H/R誘導的大鼠CMECs IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影響(±s，n=9) 單位：pg/mL

2.4 延胡索乙素對H/R誘導的大鼠CMECs凋亡的影響 模型組CMECs凋亡率和Caspase-3活性較正常對照組明顯升高(P<0.05)；溶媒對照組和模型組CMECs凋亡率和Caspase-3活性比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；給予低劑量、中劑量、高劑量延胡索乙素作用后，CMECs凋亡率和Caspase-3活性呈劑量依賴性降低；而給予LY294002作用后，高劑量延胡索乙素對H/R誘導的大鼠CMECs凋亡率和Caspase-3活性的抑制作用明顯減弱(P<0.05)。詳見圖3、表3。

圖3 流式細胞儀檢測各組大鼠CMECs凋亡情況

表3 延胡索乙素對H/R誘導的大鼠CMECs凋亡率及Caspase-3活性的影響(±s，n=9)

2.5 延胡索乙素對H/R誘導的大鼠CMECs中Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS、Bcl-2、Bax、Caspase-3、C-Caspase-3蛋白表達的影響 與正常對照組比較，模型組CMECs中p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS、Bcl-2蛋白表達水平明顯降低，且Bax、C-Caspase-3/Caspase-3蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；而溶媒對照組和模型組之間上述指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與溶媒對照組比較，低劑量、中劑量、高劑量延胡索乙素作用后大鼠CMECs中p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS、Bcl-2蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，而Bax蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性；中劑量、高劑量延胡索乙素作用后C-Caspase-3/Caspase-3蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；給予LY294002作用后，高劑量延胡索乙素對H/R誘導的大鼠CMECs中p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS、Bcl-2蛋白表達水平和Bax、C-Caspase-3/Caspase-3蛋白表達水平的影響得到明顯逆轉(zhuǎn)(P<0.05)。詳見圖4。

模型組與正常對照組比較，＊ P<0.05；延胡索乙素各劑量組與溶媒對照組比較，#P<0.05；延胡索乙素高劑量+Akt抑制劑組與延胡索乙素高劑量組比較，△ P<0.05。

3 討 論

微血管內(nèi)皮細胞在維持微血管通透性和內(nèi)外物質(zhì)能量交換等過程中發(fā)揮著重要作用[11]；CMECs受損所致的功能異常與MIRI發(fā)生密切相關[3]。研究顯示，MIRI發(fā)生與炎癥反應、氧化應激和心肌細胞凋亡等密切相關[12]；在炎癥和氧化應激等刺激下，內(nèi)皮細胞可釋放黏附分子、趨化因子和細胞因子等，引起血管收縮、白細胞聚集、血栓形成阻礙復流，進而加重MIRI[2，13]；另外，MIRI可產(chǎn)生大量的氧自由基，而氧自由基的過度積累可增加線粒體膜的通透性，促進凋亡誘導因子的釋放，引起細胞凋亡[3]。本研究中，H/R誘導下，大鼠CMECs氧化應激指標LDH、MDA水平和促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及細胞凋亡率、促凋亡因子Caspase-3活性、Bax蛋白表達水平均明顯升高，而抗氧化應激指標SOD、抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達水平均明顯降低。該結(jié)果與Chen等[14]和Zhang等[15]研究中H/R刺激可引起CMECs炎癥反應、氧化應激和凋亡的結(jié)果相一致。結(jié)果表明，H/R可誘導CMECs損傷。

延胡索乙素因?qū)π哪X缺血再灌注損傷有較大的改善作用而備受關注[16]。近年來，有研究報道，延胡索乙素可能通過抗氧化、抗炎和抗凋亡機制來保護氯胺酮誘導的小鼠學習記憶障礙[17]；延胡索乙素對大鼠主動脈內(nèi)皮細胞有依賴性和非依賴性血管舒張作用，可通過Akt/eNOS信號通路等途徑改善血管功能障礙[18]。本研究以20 μg/mL、40 μg/mL和80 μg/mL延胡索乙素作用后發(fā)現(xiàn)，H/R誘導的CMECs LDH、MDA、IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及細胞凋亡率、Caspase-3活性和C-Caspase-3/Caspase-3蛋白水平、Bax蛋白表達水平均明顯降低，而SOD水平和Bcl-2蛋白表達水平均明顯升高。提示延胡索乙素可抑制H/R誘導的CMECs氧化應激、炎癥反應和凋亡保護CMECs損傷。

Akt是參與該通路的關鍵因子，激活后可促進包括eNOS在內(nèi)的多種靶蛋白的表達，在細胞生長、代謝和凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[19]。Akt/eNOS信號通路活化異常與MIRI發(fā)生密切相關，一直是MIRI研究的熱點[20]。Akt/eNOS信號通路還可調(diào)控細胞氧化應激、炎癥反應和凋亡參與H/R誘導的CMECs損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，H/R誘導下，CMECs中Akt、eNOS磷酸化水平降低，而給予20 μg/mL、40 μg/mL和80 μg/mL延胡索乙素作用后，CMECs中Akt、eNOS磷酸化水平明顯升高；另外，給予Akt通路抑制劑LY294002作用后，80 μg/mL延胡索乙素對CMECs中Akt、eNOS磷酸化水平以及對CMECs氧化應激、炎癥和凋亡的影響明顯逆轉(zhuǎn)。提示延胡索乙素可通過激活Akt/eNOS信號通路抑制H/R誘導的CMECs氧化應激、炎癥反應和凋亡。

綜上所述，延胡索乙素可通過抑制炎癥、氧化應激反應和減輕細胞凋亡保護H/R誘導的大鼠CMECs損傷，其作用機制可能與激活Akt/eNOS通路有關；然而，延胡索乙素保護CMECs損傷的作用機制是否還與其他通路或基因的調(diào)控有關，有待后續(xù)進一步探討。