羊源沙門氏菌的分離鑒定及致病性和耐藥性分析

王思敏，楊江峰，趙曉錕，張 雷，郭晶晶，蘭金蘋，于小杰，王 凈

(1.張家口市宣化區(qū)農業(yè)農村局，張家口 075100；2.河北北方學院動物科技學院，河北省肉羊產業(yè)技術創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟，張家口 075000)

沙門氏菌(Salmonella)是一種可引起人和動物感染的致病菌，其耐寒、耐干燥、不耐熱，在日常環(huán)境中到處存在，在不同的環(huán)境中可存活數(shù)周甚至數(shù)月。沙門氏菌被美國細菌學家丹尼爾·埃爾默·薩爾蒙(Daniel Elmer Salmon)發(fā)現(xiàn)，于1885年首次從豬中分離出腸炎沙門氏菌血清型豬霍亂弧菌[1]。到目前為止，沙門氏菌屬分為邦格沙門氏菌和腸炎沙門氏菌2種，超過2 600種不同的血清型已被分離鑒定[2]。羊沙門氏菌病是由多種血清型沙門氏菌引起羊的一種傳染病，而引起羊患病的有腸炎沙門氏菌亞種羊流產沙門氏菌[3]、雙亞利桑那腸沙門氏菌[4-6]和鼠傷寒沙門氏菌[7]可引起羊發(fā)燒、食欲不振、腹瀉及排黏稠的糞便，母羊流產、消瘦、出現(xiàn)敗血病及急性或慢性腸炎，甚至死亡[8]。羊源沙門氏菌影響了羔羊的生長發(fā)育和成活率，降低了羊的生產性能，給養(yǎng)羊業(yè)帶來很大經濟損失。同時羊源沙門氏菌具有多元化的基因，根據(jù)地區(qū)差異和氣候特征會演化出多種耐藥機制，加上人為的不合理用藥，導致菌株產生耐藥性而難以防治。因此，監(jiān)測菌株的耐藥性和致病性可提供合理的防治措施。

本試驗旨在研究張家口某地區(qū)羊源沙門氏菌的耐藥性和致病性，檢測分離株的耐藥基因和毒力基因，分析其耐藥性、致病性與相關基因的關系，以期為羊源沙門氏菌的耐藥性和分子流行病學監(jiān)測提供可靠依據(jù)，為臨床檢測和實際用藥提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標準菌株及試驗動物 試驗所用標準菌株鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028和大腸桿菌ATCC 44102均購自河南信陽萊耀生物科技有限公司。4周齡體重約20 g SPF級健康昆明雌性小鼠購自河北北方學院實驗動物中心。

1.1.2 樣品來源 2020年11月從張家口市宣化區(qū)隨機選擇了15個羊場采集150份羔羊肛拭子樣品。

1.1.3 主要試劑 緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、MH肉湯培養(yǎng)基均購自杭州百思生物技術有限公司；PBS、沙門氏菌成套生化鑒定管(SMGB)均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司；革蘭氏染色液購自深圳康泰生物制品股份有限公司；沙門氏菌屬診斷血清購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；青霉素(PEN)、阿莫西林(AMO)、復方新諾明(T/S)等藥敏片均購自常德比克曼生物科技有限公司；AxyPrep細菌基因組DNA小量試劑盒購自康寧生命科學有限公司；DNA Marker購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離鑒定

1.2.1.1 細菌分離培養(yǎng) 將肛拭子放入緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基(BPW)中，于37 ℃培育12～15 h。用接種環(huán)接種到伊紅美藍培養(yǎng)基和SS培養(yǎng)基中，于37 ℃培育24～36 h，檢測是否存在沙門氏菌菌落，分別觀察到琥珀色菌落和無色透明菌落即可[9]。挑選疑似菌落接種于LB培養(yǎng)基中，于37 ℃培育20～24 h后，4 ℃保存。

1.2.1.2 革蘭氏染色及生化鑒定 挑選純化培養(yǎng)的單菌落進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)[10]。使用沙門氏菌成套生化鑒定管試劑盒進行生化鑒定。選擇可疑菌落，接種到色氨酸肉湯(靛基質)、賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基等[11]。于37 ℃培養(yǎng)24～28 h,參照GB 4749.4-2010標準判斷結果[12]。

1.2.1.3 細菌血清型鑒定 采用玻板凝集試驗法用沙門氏菌屬診斷血清試劑盒對分離菌進行血清型鑒定[13]。

1.2.1.4 PCR擴增鑒定 使用AxyPrep細菌基因組DNA小量試劑盒提取分離菌DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)沙門氏菌屬基因invA的核苷酸序列(GenBank登錄號：MK017942.1)合成1對引物，PCR檢測鑒定分離菌株。 引物序列為：上游引物F:5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGC-3′；下游引物R：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′。預期擴增片段大小為284 bp[14]。PCR反應體系20 μL：PCR 2×TaqPlus MasterMix 10.5 μL，上、下游引物各0.75 μL，DNA模板 1.5 μL，滅菌蒸餾水6.5 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，59 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取 PCR 反應產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 分離株致病性與毒力基因相關分析

1.2.2.1 致病性試驗 將65只SPF級健康昆明小鼠分為5組，4個感染組(A、B、C、D組)和1個對照組，每株分離株為1個感染組，每組15只，對照組5只，每個感染組分為有3小組，每小組5只，分別腹腔注射不同梯度濃度的菌液0.5 mL，對照組注射等體積滅菌生理鹽水。感染后分籠喂養(yǎng)連續(xù)觀察7 d，每天隔6 h觀察1次[15]。觀察小鼠精神狀態(tài)和飲食狀態(tài)，記錄小鼠的發(fā)病和死亡數(shù)量。根據(jù)統(tǒng)計情況，按改良寇氏法公式計算小鼠半數(shù)致死量(LD50)。

LD50=lg-1[Xm-i(∑P-0.5)]

其中，Xm，最大劑量組劑量對數(shù)值；i，相鄰兩組劑量高劑量與低劑量之比的對數(shù)；∑P，各組動物死亡率之總和[16]，剖檢死亡小鼠，觀察病理變化，取感染組織進行細菌分離鏡檢。試驗結束后撲殺所有小鼠，隨機選擇試驗組和對照組小鼠剖檢和鏡檢。

1.2.2.2 毒力基因PCR擴增和測序 參考GenBank登錄的毒力基因序列和相關文獻[17-20]，設計9對引物分別擴增毒力島基因hilA、avrA、sseL、ssaQ、mgtC、siiD、sopB，腸毒素基因stn，質粒毒力基因spvR。引物信息見表1。引物均由深圳華大基因股份有限公司合成。PCR反應體系25 μL：PCR 2×TaqPlus Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各0.75 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O 9 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，退火(退火溫度見表1)45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結果，將毒力基因陽性的PCR產物送深圳華大基因股份有限公司進行測序，并與NCBI中相應的參照基因進行BLAST比對分析。

1.2.3 分離株耐藥性與耐藥基因的相關分析

1.2.3.1 藥敏試驗 采用Kirby-Bauer紙片擴散法進行藥敏試驗。用無菌棉簽將菌液均勻涂抹在MH固體培養(yǎng)基上，藥敏片粘貼到培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)20～24 h，測量抑菌圈直徑[21]。按照CLSI指定的標準進行判定。

1.2.3.2 耐藥基因PCR擴增和測序 參考GenBank登錄的耐藥基因序列和相關文獻[22-24]，設計11對引物并送深圳華大基因股份有限公司合成。引物信息見2。用AxyPrep細菌基因組DNA小量試劑盒提取DNA模板，分別擴增β-內酰胺類耐藥基因blaTEM、blaCMY、blaOXA，氟喹諾酮類耐藥基因qnrS、oqxA、oqxB，磺胺類耐藥基因sul1、sul2、sul3，四環(huán)素類耐藥基因tetB和氨基糖苷類耐藥基因aadA1。PCR反應體系25 μL：PCR 2×TaqPlus MasterMix 12.5 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O 9 μL，上、下游引物各0.75 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，退火(溫度見表1)45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結果，將耐藥基因陽性的PCR產物送深圳華大基因股份有限公司進行測序，并與NCBI中相應的參照基因進行BLAST比對分析。

表1 毒力基因PCR引物信息

表2 耐藥基因PCR引物信息

續(xù)表

2 結 果

2.1 沙門氏菌分離鑒定

2.1.1 沙門氏菌分離培養(yǎng) 對150份羔羊肛拭子樣品進行沙門氏菌分離，培養(yǎng)24 h后在SS培養(yǎng)基上呈圓形，凸起，無色半透明狀，表面圓潤光滑(圖1)，初步分離得到4株沙門氏菌N1、N2、N3、N4，分離率為4/150(2.7%)。

圖1 SS培養(yǎng)基上疑似沙門氏菌菌落形態(tài)Fig.1 Morphology of suspected Salmonella colonies on the SS medium

2.1.2 沙門氏菌鏡檢和生化鑒定 分離菌株經革蘭氏染色后顯微鏡鏡檢，可見革蘭氏陰性短桿菌，單獨存在，偶見2個一起(圖2)。生化鑒定結果顯示，甘露醇、山梨醇、衛(wèi)矛醇、賴氨酸脫羧酶陽性，色氨酸、尿素酶、氰化鉀、水楊苷、丙二酸鹽、ONPG陰性(表3)，4株分離株都符合沙門氏菌的生化特性。

圖2 分離株革蘭氏染色鏡檢圖(1 000×)Fig.2 Gram staining microscopic examination of the isolated strains (1 000×)

表3 生化試驗結果

2.1.3 沙門氏菌PCR鑒定和血清型鑒定 根據(jù)沙門氏菌屬基因invA核苷酸序列，PCR擴增4株分離株，結果表明，所有分離株均擴增出大小為284 bp的明亮條帶(圖3)，確定分離到4株沙門氏菌。對分離株進行血清型鑒定，結果顯示,4株沙門氏菌均為B群血清型，均為鼠傷寒沙門氏菌。

2.2 沙門氏菌分離株致病性與毒力基因檢測及相關分析

2.2.1 沙門氏菌分離株致病性試驗結果 試驗組小鼠感染后出現(xiàn)精神萎靡、腹瀉、食欲下降、被毛凌亂等癥狀，部分小鼠24～72 h后死亡，而對照組小鼠體征正常。試驗組小鼠剖解后表現(xiàn)腸系膜充血出血，腸壁充血變薄，腸內腫脹和充滿稀樣黑褐色糞便，說明分離株對小鼠具有致病性。測定其LD50介于5.67×107～6.45×107CFU之間，具體信息見表4。

M,DNA Marker Ⅱ;1～4,分離株N1、N2、N3和N4；+，陽性對照；-，陰性對照。下同M,DNA Marker Ⅱ;1-4,Isolates N1,N2,N3 and N4，respectively;+，Positive control;-，Negative control.The same as below圖3 沙門氏菌分離株invA基因PCR擴增結果Fig.3 PCR amplification results of invA gene of Salmonella isolates

表4 沙門氏菌分離株對小鼠的毒力

2.2.2 沙門氏菌分離株毒力基因PCR擴增及測序分析 毒力基因PCR檢測結果表明，在檢測的9種毒力基因中有6種毒力基因(avrA、sseL、mgtC、sopB、stn和spvR基因)的檢出率均為100%。檢測的另外3種毒力基因中hilA和siiD基因陽性檢出率為75%，ssaQ基因陽性檢出率為50%，毒力基因的檢出率均>50%(圖4)。9種毒力基因的測序結果經NCBI數(shù)據(jù)庫比對，相似性達96.3%以上。

2.2.3 沙門氏菌分離株毒力表型與毒力基因相關性分析 由表5可知，分離株毒力表型和毒力基因呈正相關關系，4株分離株均攜帶8種以上毒力基因，其中N4攜帶9種毒力基因，毒力最強，其余3株中，N1缺少毒力島基因ssaQ，N2缺少毒力島基因siiD，N3缺少毒力島基因hilA，毒力N3>N1>N2。

表5 沙門氏菌分離株毒力表型與毒力基因對比

2.3 羊源沙門氏菌分離株耐藥性與耐藥基因檢測結果

2.3.1 藥敏試驗結果 采用Kirby-Bauer紙片擴散瓊脂法測定分離株對10種抗菌藥物的敏感性。結果顯示，沙門氏菌分離株對復方新諾明、利福平、林可霉素、青霉素、氨芐西林耐藥率為100%；對阿莫西林的耐藥率為50%；對頭孢拉定、四環(huán)素的耐藥率為25%；對慶大霉素、環(huán)丙沙星的耐藥率為0(表6)。表明羊源沙門氏菌分離株對復方新諾明、利福平、林可霉素、青霉素和氨芐西林產生了很強的耐藥性，對環(huán)丙沙星和慶大霉素較為敏感。

表6 沙門氏菌分離株藥敏試驗結果

R,耐藥;I,中介;S,敏感

R,Resistant;I,Intermediate;S,Sensitivity

2.3.2 沙門氏菌分離株耐藥基因PCR擴增及測序分析 耐藥基因檢測結果顯示，blaTEM、qnrS、sul1、sul2基因檢出率為100%，aadA1基因檢出率為75%，blaCMY、oqxA和sul3基因檢出率均為50%，blaOXA基因檢出率為25%，而oqxB和tetB基因則未被檢出(圖5)。9種耐藥基因的測序結果經NCBI數(shù)據(jù)庫比對，相似性均達94.7%以上。

2.3.3 沙門氏菌分離株耐藥表型與耐藥基因相關性分析 由表7可知，分離株耐藥表型和耐藥基因整體呈正相關，分離株攜帶β-內酰胺類耐藥基因blaTEM、blaCMY、blaOXA越多，耐藥表型對β-內酰胺類藥物耐藥的越多；分離株攜帶2種以上磺胺類耐藥基因sul1、sul2、sul3，耐藥表型對磺胺類藥物均耐藥；4株分離株均未攜帶四環(huán)素類耐藥基因tetB，3株的耐藥表型對四環(huán)素類藥物敏感；分離株N1不攜帶氟喹諾酮類耐藥基因和氨基糖苷類耐藥基因，耐藥表型對這2類藥物都敏感；但另外3株N2、N3、N4均攜帶氟喹諾酮類耐藥基因qnrS、oqxA和氨基糖苷類耐藥基因aadA1，耐藥表型顯示對這2類藥物表現(xiàn)中介或敏感。

A～I,分別為blaTEM、blaCMY、blaOXA、qnrS、oqxA、sul1、sul2、sul3和aadA1基因A-I,blaTEM,blaCMY,blaOXA,qnrS,oqxA,sul1,sul2,sul3 and aadA1 genes,respectively圖5 沙門氏菌分離株耐藥基因PCR擴增結果Fig.5 PCR amplification of drug resistance gene of Salmonella isolates

表7 沙門氏菌分離株耐藥表型與耐藥基因對比

3 討 論

羊源沙門氏菌是一種重要的人獸共患病病原，英國動植物衛(wèi)生機構(APHA)在2017年在對羊群進行死后檢查時發(fā)現(xiàn)了一種潛在的新鼠傷寒沙門氏菌菌株，該羊群512只羊中有207只在1個月內死亡[25]。這種新的鼠傷寒沙門氏菌菌株與英國以前暴發(fā)的菌株不同，可能相差5個核苷酸多態(tài)性突變，其對所有抗生素均耐藥。這種分離株引起的疾病一旦暴發(fā)，會危及所有人類和動物。而本研究分離得到的4株羊源沙門氏菌血清型均為鼠傷寒沙門氏菌，鑒于羊源沙門氏菌潛在的危險性和羊源沙門氏菌可用數(shù)據(jù)的稀缺性，加強對羊源沙門氏菌的研究尤為重要。

沙門氏菌共有約90%的毒力基因存在于DNA中，其余10%毒力基因存在于毒力因子中，這部分主要決定該血清型致病性的結構、產物和方式[26]。其大多數(shù)編碼此類因子的基因位于沙門氏菌致病島(SPI)中，也可能在毒力質粒(pSLT)中，更確切地說在毒力質粒的spv操縱子上。但尚未明確在spv操縱子中產生的某些蛋白質的機制及其在毒力中的作用，需進行更全面的研究[27]。本試驗中4株分離株均攜帶毒力島基因avrA、mgtC、sopB、sseL和腸毒素基因stn及質粒毒力基因spvR，hilA、siiD、ssaQ基因陽性檢出率也均在50%以上。分離株毒力表型和毒力基因呈正相關，4株分離株均攜帶8種以上毒力基因，其中N4攜帶9種毒力基因，毒力表型毒力最強。宋晟等[28]分離出1株雞源沙門氏菌，該菌株共有致病基因27個，攜帶包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡致病基因、侵襲上皮細胞致病基因和介導菌株對宿主細胞的黏附致病基因等多種致病因子。張捷等[29]通過研究北京地區(qū)禽類中分離的36株沙門氏菌基因型及毒力基因，獲得11個ST型。菌株均攜帶毒力島SPI1～SPI5代表性基因，66.7%含毒性質粒spvB。沙門氏菌毒力島基因相對穩(wěn)定，但攜帶毒力基因對毒力表型的差別有一定影響。目前不同毒力基因對羊源沙門氏菌致病性影響的研究較少，需進一步研究。

藥敏試驗結果顯示，4株羊源沙門氏菌分離株對10種抗菌藥呈不同程度耐藥，且均為多重耐藥菌。分離株均對β-內酰胺類的青霉素、氨芐西林、利福平耐藥，對磺胺類的復方新諾明和大環(huán)內酯類的林可霉素也表現(xiàn)耐藥，且都攜帶2種以上的β-內酰胺酶類耐藥基因blaTEM、blaCMY、blaOXA和磺胺類耐藥基因sul1、sul2、sul3，耐藥表型和耐藥基因整體呈正相關，但有些基因可能不表現(xiàn)，與馮林等[30]和江萍等[31]研究結果相同之處是對β-內酰胺類抗生素耐藥嚴重，不同的是其分離的羊源沙門氏菌均對氟喹諾酮類耐藥嚴重，而本研究得到的羊源沙門氏菌對磺胺類抗生素存在耐藥表型和耐藥基因，檢出率較高。由此可知，由于地域不同及用藥差異，羊源沙門氏菌耐藥情況有所不同，需加強監(jiān)測，為避免羊源沙門氏菌耐藥范圍擴大，應合理規(guī)范使用抗生素。

4 結 論

本試驗分離得到4株羊源沙門氏菌，血清型均為鼠傷寒沙門氏菌，有一定致病性，毒力基因檢出率較高，均在50%以上。分離株對β-內酰胺類和磺胺類抗菌藥耐藥嚴重，耐藥表型和耐藥基因均存在，臨床用藥可考慮慶大霉素和環(huán)丙沙星作為治療藥物。