加味平胃口服液提取工藝研究

陳昱驍，李煥娟，席曉花，郝 潔，周德剛，司紅彬

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530004；2.洛陽惠中獸藥有限公司，洛陽 471003)

雞傳染性腺胃炎是由多種因素混合感染所引起的一種具有傳染性的綜合征。該病在中國最早由王永坤等[1]于1996年在山東、江蘇等地發(fā)現(xiàn)，目前在國內(nèi)已成流行趨勢，給養(yǎng)雞業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。加味平胃口服液是用于治療家禽傳染性腺胃炎等病癥的復(fù)方口服液，其依據(jù)傳統(tǒng)中獸醫(yī)理論，結(jié)合現(xiàn)代中藥藥理研究，在經(jīng)典方劑平胃散[2-3]的基礎(chǔ)上加減而成，由蒼術(shù)、厚樸、陳皮、木香、苦參、枳殼和甘草七味藥組成。其功能為益氣健脾，消食開胃，主治家禽采食及飲水減少、生長遲緩或停滯、飼料轉(zhuǎn)化率低及飼料消化不充分等癥狀。

揮發(fā)油是中藥發(fā)揮療效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一，但其提取工藝一直是限制含揮發(fā)油制劑質(zhì)量的瓶頸問題。傳統(tǒng)含揮發(fā)油的芳香性藥物多以武火迅速煮沸，數(shù)分鐘后，改用文火略煮，盡量避免久煎?，F(xiàn)代揮發(fā)油的提取方法有水蒸氣蒸餾法、溶劑法、壓榨法和吸收法、微波法、超聲法、超臨界流體萃取法和亞臨界水提取法等，其中水蒸氣蒸餾法以水為溶劑，設(shè)備簡單，易操作且成本較低，是目前制藥企業(yè)普遍采用的通用方法。劉巧明等[4]通過正交試驗(yàn)考察清肺口服液的水提方法，結(jié)果最佳提取工藝為8倍水浸泡1 h,回流提取2次,每次1.5 h；喬紅培等[5]采用L9(34)正交試驗(yàn)，分別對揮發(fā)油提取工藝和水提工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果揮發(fā)油提取工藝為加6倍量的石油醚，浸泡12 h，超聲震蕩提取1 h；水提工藝為加10倍水煎煮，煎煮3次，每次1 h。本研究采用類似方法先將蒼術(shù)、厚樸、陳皮、木香和枳殼五味藥材進(jìn)行揮發(fā)油提取，藥渣混合剩余藥材進(jìn)行水煎煮提取。

臨床試驗(yàn)表明加味平胃口服液效果顯著、可靠。本研究采用正交試驗(yàn)等方法，確定加味平胃口服液科學(xué)合理、高效量產(chǎn)的提取工藝，以期為加味平胃口服液量產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材

蒼術(shù)、厚樸、陳皮和枳殼均購自河南省修之合藥業(yè)有限公司；木香購自河南省三禾藥業(yè)有限公司；苦參購自甘肅惠森藥業(yè)有限公司；甘草購自安徽聚草中藥飲片股份有限公司；以上藥材經(jīng)鑒定符合《中華人民共和國獸藥典》2020年版有關(guān)規(guī)定?？鄥A對照品、氧化苦參堿對照品和柚皮苷對照品均購自中國食品藥品鑒定研究院。

1.2 主要試劑及儀器

乙腈購自Fisher公司；甲醇購自天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；乙酸銨購自西隴科學(xué)股份有限公司；三氯甲烷購自煙臺(tái)市雙雙化工有限公司。

U3000型高效液相色譜儀購自Thermo公司；1260型高效液相色譜儀購自安捷倫公司；Water，C18 5 μm，4.6 mm×250 mm型色譜柱購自XBridge?公司；100-5-C18，4.6 mm×250 mm型色譜柱購自Kromassil公司；DEKW-S-4型水浴鍋購自北京永光明公司；KQ5200DA型超聲清洗儀購自昆山市超聲儀器有限公司；XSR205型和AB265-S型電子分析天平均購自梅特勒托利多公司；RV8旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自IKA公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵購自鞏義予華儀器有限責(zé)任公司；DFT-100手提式粉碎機(jī)購自溫嶺市林大機(jī)械有限公司；DZTW調(diào)溫電熱套購自北京市永光明醫(yī)療器械有限公司。

1.3 揮發(fā)油提取工藝研究

1.3.1 飲片粒度處理 稱取2/5個(gè)處方量的蒼術(shù)、厚樸、陳皮、木香和枳殼，共4份，第1份飲片不處理直接投料，第2份飲片切成1～2 cm后投料，第3份飲片粉碎至全部通過12目篩后投料，第4份飲片粉碎過12目篩后用濾紙包埋之后投料。分別將上述飲片投料于三頸瓶中，加入10倍量水，連接揮發(fā)油提取器，待沸騰后開始計(jì)時(shí)，共蒸餾10 h，每1 h讀取揮發(fā)油的量，繪制曲線圖，比較不同飲片粒度揮發(fā)油提取量的差異[6-7]。

1.3.2 揮發(fā)油提取工藝正交試驗(yàn) 選定溶劑倍量(A)、浸泡時(shí)間(B)和煎煮時(shí)間(C)3個(gè)因素，每個(gè)因素各取3個(gè)水平，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，選用揮發(fā)油提取量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最佳揮發(fā)油提取工藝條件[8-9]。主要因素水平見表1。

根據(jù)1.3.1試驗(yàn)結(jié)果，按處方比例稱取1/5個(gè)處方量的蒼術(shù)、厚樸、陳皮、木香和枳殼，置三頸瓶中，連接揮發(fā)油提取器，按照表1因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，提取結(jié)束后讀取揮發(fā)油提取量[10]。

表1 揮發(fā)油提取工藝正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.3 揮發(fā)油提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取1/5個(gè)處方量的蒼術(shù)、厚樸、陳皮、木香、枳殼飲片，平行3份，采用正交試驗(yàn)所優(yōu)選的揮發(fā)油提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，讀取揮發(fā)油提取量[11]。

1.4 水煎煮提取工藝研究

1.4.1 水煎煮提取工藝正交試驗(yàn) 選定溶劑倍量(A)、煎煮時(shí)間(B)和提取次數(shù)(C)3個(gè)因素，每個(gè)因素各取3個(gè)水平，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)[12]，選用柚皮苷含量和苦參總堿含量(苦參堿+氧化苦參堿總含量)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最佳提取工藝條件[13]。主要因素水平見表2。

根據(jù)1.3.1試驗(yàn)結(jié)果，按處方比例稱取1/5個(gè)處方量的蒼術(shù)、厚樸、陳皮、木香和枳殼，置三頸瓶中，連接揮發(fā)油提取器，按照1.3.2確定的揮發(fā)油提取工藝提取揮發(fā)油，餾液8層紗布濾過，藥渣合并1/5個(gè)處方量的苦參和甘草，按照表2因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，提取液8層紗布濾過，合并濾液及餾液，60～70 ℃減壓濃縮至1 g/mL[14]。

表2 水煎煮提取工藝正交試驗(yàn)因素水平表

1.4.2 加味平胃口服液中柚皮苷含量測定

1.4.2.1 色譜條件 色譜柱：Water，XBridge?C18，4.6 mm×250 mm，5 μm；柱溫為30 ℃，以乙腈-水(20∶80)為流動(dòng)相，檢測波長為283 nm，流速為1 mL/min。

1.4.2.2 對照品溶液的制備 取柚皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為0.1 mg/mL的溶液，濾過，取續(xù)濾液。

1.4.2.3 供試品溶液及陰性對照溶液配制 取加味平胃口服液，精密移取2 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置，上清液濾過，取續(xù)濾液。另取缺枳殼的陰性對照同法制成陰性對照溶液。

1.4.2.4 測定 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液與陰性對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀進(jìn)行測定[15-16]。

1.4.3 加味平胃口服液中苦參總堿含量測定

1.4.3.1 色譜條件 色譜柱：Kromassil，100-5-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm；柱溫為30 ℃，以乙腈-[0.01 mol/L乙酸銨溶液(濃氨試液調(diào)pH 8.1)](3∶2)為流動(dòng)相 A，0.01 mol/L乙酸銨溶液(濃氨試液調(diào)pH 8.1)為流動(dòng)相 B，按照表3程序進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為225 nm，流速為1 mL/min[17]。

表3 洗脫梯度表

1.4.3.2 對照品溶液的制備 取苦參堿對照品、氧化苦參堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為苦參堿0.04 mg/mL、氧化苦參堿0.008 mg/mL的混合溶液，過濾，取續(xù)濾液。

1.4.3.3 供試品溶液及陰性對照溶液配制 取加味平胃口服液，精密移取5 mL，置分液漏斗中，加30 mL水和1 mL氨水，混勻，加三氯甲烷振搖提取2次，每次25 mL，合并三氯甲烷液，減壓濃縮至干，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液。另取缺苦參的陰性對照同法制成陰性對照溶液。

1.4.3.4 測定 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液與陰性對照溶液各5 μL，注入液相色譜儀進(jìn)行測定[16]。

1.4.4 水煎煮提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 按處方比例稱取1/5個(gè)處方量的飲片，平行3份，先按確定的揮發(fā)油提取工藝提取揮發(fā)油，餾液8層紗布濾過，藥渣合并苦參、甘草，再采用正交試驗(yàn)所優(yōu)選的水煎煮提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，提取液8層紗布濾過，合并濾液及餾液，60～70 ℃減壓濃縮并分別定容至1 g/mL，檢測柚皮苷含量、苦參總堿含量[18]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

揮發(fā)油提取工藝篩選中以揮發(fā)油提取量為指標(biāo)，通過正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ進(jìn)行分析，采用極差法進(jìn)行最佳因素排序，并得出最優(yōu)組合。

水煎煮提取工藝篩選中以柚皮苷含量和苦參總堿、含量為指標(biāo)，設(shè)定加權(quán)系數(shù)分別為0.4和0.6，采用綜合加權(quán)評(píng)分法，計(jì)算出各次試驗(yàn)的綜合評(píng)分。具體評(píng)分方法：以柚皮苷含量最大的一次試驗(yàn)判為100分，按照每次試驗(yàn)柚皮苷含量與最大柚皮苷含量的比例，計(jì)算各自柚皮苷含量指標(biāo)中的得分。 同法，計(jì)算每次試驗(yàn)的苦參總堿含量得分。最后按照兩項(xiàng)指標(biāo)的加權(quán)系數(shù)，計(jì)算出各次試驗(yàn)的綜合評(píng)分[19]。

綜合評(píng)分=(柚皮苷含量/柚皮苷最大含量)×100×0.4+(苦參總堿含量/苦參總堿最大含量)×100×0.6

根據(jù)綜合評(píng)分結(jié)果，通過正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ進(jìn)行分析，采用極差法進(jìn)行最佳因素排序，并得出最優(yōu)組合。

2 結(jié) 果

2.1 揮發(fā)油提取工藝

2.1.1 飲片粒度對揮發(fā)油量的影響 從揮發(fā)油量來看，飲片粉碎后的提取效果最好，1～2 cm的飲片次之，飲片不處理和飲片粉碎后包埋的效果最差(圖1)。綜合成本、對環(huán)境的影響及實(shí)際操作等因素選擇1～2 cm的飲片更為合理。從每小時(shí)揮發(fā)油量的變化趨勢來看，揮發(fā)油在提取9 h后趨勢變緩，可將正交試驗(yàn)中煎煮時(shí)間最長定為10 h。

圖1 揮發(fā)油提取量曲線圖Fig.1 Volatile oil extraction volume curve

2.1.2 揮發(fā)油提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果 正交試驗(yàn)結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。極差直觀分析結(jié)果表明，影響揮發(fā)油提取因素大小為C>B>A,即煎煮時(shí)間(C)>浸泡時(shí)間(B)>溶劑倍量(A)。經(jīng)方差分析，煎煮時(shí)間對提取效果有極顯著影響(P<0.01)；而浸泡時(shí)間和溶劑倍量對提取效果影響較小，各水平間差異不顯著。

綜合分析以上結(jié)論，影響提取效果的因素順序?yàn)椋篊>B>A，且C3>C2>C1，A1=A3>A2，B1>B2=B1，所以優(yōu)選出來的工藝為A1B1C3，即8倍水，不浸泡，煎煮10 h。

表4 揮發(fā)油提取正交試驗(yàn)及直觀分析結(jié)果

表5 揮發(fā)油正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

2.1.3 揮發(fā)油提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 3份1/5處方量的藥材揮發(fā)油提取量結(jié)果分別為1.2、1.2和1.3 mL，說明揮發(fā)油提取工藝穩(wěn)定。

2.2 水煎煮提取工藝

2.2.1 水煎煮提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果 正交試驗(yàn)結(jié)果見表6，方差分析結(jié)果見表7。根據(jù)以上結(jié)果可知，在所選因素水平范圍內(nèi)，提取次數(shù)(C)>煎煮時(shí)間(B)>溶劑倍量(A)，其中提取次數(shù)對柚皮苷含量和苦參總堿含量有顯著影響(P<0.05)，且C3>C2>C1；溶劑倍量和煎煮時(shí)間對其無顯著影響(P>0.05)。綜合考慮，優(yōu)選提取工藝為A2B2C3。確定水煎煮工藝為8倍水，煎煮1.5 h，提取3次。

2.2.2 水煎煮提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 由表8可知，柚皮苷含量分別為3.61、3.59和3.63 mg/mL，RSD為0.6%，苦參總堿含量分別為1.23、1.21和1.25 mg/mL，RSD為1.7%，表明該工藝穩(wěn)定，可行。

表6 水煎煮正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析結(jié)果

表7 水煎煮正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

表8 水煎煮提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

中藥提取的目的是將藥材活性成分從中藥材中最大限度地分離，從而達(dá)到有效成分與雜質(zhì)非活性成分的分離[20]?，F(xiàn)代研究表明，揮發(fā)油具有抗炎、抗病毒、解熱鎮(zhèn)痛等作用，是中藥發(fā)揮療效的重要物質(zhì)之一[21]。藥材粉碎粒度對于揮發(fā)油的提取有較大影響，本研究中飲片粉碎后的提取效果最好，1～2 cm的飲片次之，飲片不處理和飲片粉碎后包埋的效果最差，由于藥材粉碎能耗較高，易產(chǎn)生粉塵與噪聲，且煎煮過程易粘壁糊鍋，既耗時(shí)耗力，又污染環(huán)境；1～2 cm的飲片最后提取總量和飲片粉碎后的相差不大，且1～2 cm的飲片相對來說更易處理；故選擇1～2 cm的飲片更為合理。李志平[22]在對枳殼、木香混合藥材揮發(fā)油提取工藝的研究時(shí)對藥材的粉碎粒度研究中將藥材粉碎成8、10、12、20和24目，結(jié)果在藥材粒度10～12目時(shí)，揮發(fā)油提取率為最佳。與本研究結(jié)果相似，粗粉提取效果最好，藥材粉碎太細(xì)或太粗都不利于揮發(fā)油提取。本研究利用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油方法簡單易操作，文獻(xiàn)報(bào)道揮發(fā)油一般提取時(shí)間為7～10 h[23-25]，結(jié)合本試驗(yàn)揮發(fā)油提取正交試驗(yàn)結(jié)果，煎煮時(shí)間對提取效果有極顯著影響，因此確定揮發(fā)油提取時(shí)間為10 h。

揮發(fā)油提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果表明，影響揮發(fā)油提取因素最大的為煎煮時(shí)間，對提取效果有極顯著影響；而浸泡時(shí)間和溶劑倍量對提取效果影響較小，各水平間差異不顯著，驗(yàn)證試驗(yàn)所制得的揮發(fā)油相對穩(wěn)定，工藝過程可控性強(qiáng)、重復(fù)性較好。龐春燕等[26]在不同煎煮條件對加味銀翹方煎出率的影響的研究中考察溶劑倍量、浸泡時(shí)間和煎煮時(shí)間3個(gè)因素，同樣是煎煮時(shí)間對提取率影響最大。

水煎煮提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果表明，在對溶劑倍量、煎煮時(shí)間和提取次數(shù)3個(gè)因素考察中，提取次數(shù)>煎煮時(shí)間>溶劑倍量。李萍等[27]在正交試驗(yàn)法優(yōu)選參芪益氣口服液提取工藝研究中，選定3因素相同的情況下，確定影響因素主次為提取次數(shù)>提取時(shí)間>加水量，與本研究結(jié)果一致，說明提取次數(shù)對水煎煮工藝影響最大。加味平胃口服液中可將藥材分為兩部分，一部分為蒼術(shù)、厚樸、陳皮、木香、枳殼含有揮發(fā)油成分的藥材，另一部分為苦參、甘草不含有揮發(fā)油成分的藥材。水煎煮正交試驗(yàn)中的考察指標(biāo)，從含有揮發(fā)油成分的藥材中選取枳殼中柚皮苷含量作為考察指標(biāo)，從不含有揮發(fā)油成分的藥材中選取苦參中的苦參堿和氧化苦參堿總含量作為考察指標(biāo)。因枳殼經(jīng)過揮發(fā)油提取時(shí)經(jīng)過了一定時(shí)間的煎煮，其中部分有效成分已被提取出來，所以將柚皮苷的權(quán)重系數(shù)設(shè)置為0.4，苦參堿和氧化苦參堿總含量的權(quán)重系數(shù)設(shè)置為0.6[28-29]。采用綜合加權(quán)評(píng)分法，計(jì)算出各次試驗(yàn)的綜合評(píng)分。趙增成等[19]對銀連解毒口服液的提取工藝研究中同樣采用了加權(quán)評(píng)分的方法。本研究工廠化生產(chǎn)時(shí)，揮發(fā)油提取時(shí)間過久，耗能大等問題后續(xù)需結(jié)合工廠設(shè)備進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究通過對提取方法、提取流程的試驗(yàn)驗(yàn)證，明確了加味平胃口服液的提取工藝為蒼術(shù)、厚樸、陳皮、木香、枳殼五味藥材切成1～2 cm大小，8倍水，水蒸氣蒸餾10 h提取揮發(fā)油，收集揮發(fā)油和餾液備用，藥渣加苦參、甘草，8倍水，煎煮1.5 h，提取3次，濾過，合并餾液及濾液，60～70 ℃減壓濃縮至1 g/mL。該工藝穩(wěn)定、高效、易操作，為加味平胃口服液的規(guī)?；a(chǎn)提供了工藝參考和技術(shù)借鑒。