TLR4／NF-κB 信號通路在SiO2所致矽肺模型肺泡巨噬細胞脂質(zhì)代謝調(diào)控中的作用

趙婧，焦卓亞，王娟，劉璐

山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，山西 汾陽 032200

作為常見的職業(yè)病，矽肺是由于長期暴露在游離二氧化硅（SiO2）中引起肺組織出現(xiàn)彌漫性纖維化病變的全身性疾病。臨床尚缺乏針對該病的根治性治療手段。肺泡炎癥性應(yīng)激、彌漫性肺纖維化、矽結(jié)節(jié)的產(chǎn)生是矽肺的主要病理改變[1]。研究表明肺泡上皮細胞炎癥性應(yīng)激是矽肺病程中的重要節(jié)點，緩解或阻斷該進程可阻滯病程；SiO2激活肺泡巨噬細胞（macrophage）是致使肺泡上皮細胞炎癥的“扳機”[2,3]。Zhang 等[4]指出，在正常生理狀態(tài)，巨噬細胞中的脂質(zhì)的攝入與代謝處于動態(tài)平衡，受粉塵中SiO2等的刺激其脂質(zhì)代謝進程受阻，巨噬細胞中脂質(zhì)沉積，促進細胞泡沫化，釋放多種炎性因子，加重肺組織損傷。Hou 等[5]報道肺泡上皮巨噬細胞過度載脂以致細胞泡沫化貫穿在整個矽肺纖維化的病理過程中。因此進一步揭示巨噬細胞脂質(zhì)代謝的調(diào)控機制，有可能阻滯矽肺的病程發(fā)展甚至是逆轉(zhuǎn)。Hegde 等[6]指出許多生化信號分子如轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、結(jié)締組織生長因子（connnective tissue growth factor，CTGF）等參與肺泡的脂質(zhì)代謝過程。近來Toll 樣受體4（Toll like receptor4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路在矽肺肺間質(zhì)纖維化中的作用引起關(guān)注。大量的動物實驗證實巨噬細胞中TLR4/NF-κB 信號被激活后，促進下游炎性介質(zhì)的釋放，加重炎性應(yīng)激以及引起更重的肺損傷[7]，但是TLR4/NF-κB 信號是否參與巨噬細胞脂質(zhì)代謝的調(diào)控，尚未有定論。本研究通過建立大鼠矽肺模型，分離并培養(yǎng)其肺泡巨噬細胞，研究TLR4/NF-κB信號對巨噬細胞脂質(zhì)代謝的調(diào)控，初步探討矽肺的病理機制，為臨床提供研究數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、主要試劑和主要儀器

實驗動物：SPF 級SD 雄性大鼠36 只，7～8 周齡，體質(zhì)量（200±20）g，從中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所采購，動物使用許可證號：SCXK（京）2018-0039；本研究經(jīng)本院實驗動物管理倫理委員會審核批準（IACUC 批準號：2019-079）。

主要試劑：二氧化硅，純度99.99%，粒徑（2.25±2.08）μm（美國Sigma 公司）。TLR4、MyD88、NF-κB抗體（德國Rebstock 公司），兔抗大鼠磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（美國Santa 公司），免疫組化試劑盒（南京建成生物有限公司），蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosinstaining，HE）試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司），酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（美國Amresco 公司），油紅O 染色試劑盒（北京華夏遠洋科技有限公司）。

主要儀器：LIOOS600T 生物顯微鏡（日本尼康公司），-80 ℃深冷冰箱（德國維根斯公司），Leica RM2135 組織切片機（德國Leica 公司），高速低溫離心機（北京六一儀器廠），實時定量PCR 儀（加拿大Delong America 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠矽肺模型構(gòu)建和分組處理 所有SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按隨機數(shù)字表法分為正常組（Normal）、模型組（Model）、抑制劑組（Inhibitor），每組12 只。矽肺模型大鼠采用如下方法制作[8]：將SiO2粉塵與生理鹽水制成懸浮液（SiO2濃度為100 mg/mL），使用前先用高壓鍋進行滅菌。將大鼠麻醉后，模型組、抑制劑組大鼠一次性氣管內(nèi)緩慢滴注（速度過快會導(dǎo)致大鼠嗆咳，呼吸困難）1 mL SiO2懸浮液，滴注過程中留意大鼠粗大濕羅音，表明已經(jīng)滴注到氣管，輕撫大鼠雙肺，使藥液分散均勻，正常組大鼠一次性滴注等劑量生理鹽水。2 周后，從模型組挑選2 只大鼠處死，取出肺，肉眼可看到橢圓形灰白色，質(zhì)地較硬的白色小結(jié)節(jié)，視為造模成功。

2 周后開始給藥，抑制劑組大鼠每天耳緣靜脈注射TAK-242（TLR4/NF-κB 信號特異性抑制劑），劑量為0.5 mg/kg，每日1 次，正常組和Model 組每天定時耳緣靜脈注射等劑量的生理鹽水。

1.2.2 支氣管灌洗液標本采集 4 周后，將大鼠誘導(dǎo)麻醉處死，無菌剝離氣管，左主支氣管處插管，以絲線結(jié)扎，以PBS 緩沖液反復(fù)沖洗左肺，收集支氣管灌洗液（bronchial lavage fluid，BALF），離心，留取上清，置入深冷冰箱中；打開大鼠胸腔，無菌操作臺上取出肺，肉眼觀察各組大鼠肺組織的解剖學(xué)變化，然后以液氮封存，置入深冷冰箱中，待測。

1.2.3 肺組織病理學(xué)改變 取出各組10%大鼠肺組織，采用10%甲醛固定24 h 切片，HE 染色，光鏡下觀察病理改變。

1.2.4 ELISA 測定大鼠BALF 中IL-6 和TNF-α 含量取出各組BALF，離心后留取上清，嚴格按照ELISA試劑盒要求進行，采用多功能酶標儀檢測各組大鼠BALF 中IL-6 和TNF-α 的含量。

1.2.5 肺泡巨噬細胞的分離 使用雙層醫(yī)用滅菌紗布過濾BALF，重復(fù)操作5 次后，離心，收集沉淀，用無血清的培養(yǎng)液沖洗3 次，每次2 min，置于培養(yǎng)皿中，加入適量RPMI1640 培養(yǎng)液，置入37 ℃，5% CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)，棄去未貼壁生長的細胞，培養(yǎng)皿中貼壁生長的即為大鼠肺泡巨噬細胞。

1.2.6 油紅O 染色觀察大鼠肺泡巨噬細胞脂滴形成調(diào)整各組肺泡巨噬細胞濃度，以3×104個/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，置入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h后，4%甲醛固定30 min，PBS 清洗2 次，每次5 min，進行油紅O 染色，無菌水清洗后，顯微鏡下觀察細胞中脂滴的形成。

1.2.7 PCR 檢測肺泡巨噬細胞中各脂質(zhì)代謝基因表達 采用RT-PCR 檢測脂質(zhì)代謝相關(guān)基因脂肪酸合成的乙酰輔酶A 羧化酶（ACC）基因、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1（SREBP）基因、脂肪酸合成酶（FAS）基因的表達。步驟如下：調(diào)整各組肺泡巨噬細胞濃度，以5×104個/孔接種于96 孔培養(yǎng)板中，置入37℃，5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h，常規(guī)提取各組細胞的總RNA，測定其純度和完整度[9,10]，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR 儀進行擴增。以2?ΔΔCt表示基因的相對表達量。

1.2.8 Western blot 檢測肺泡巨噬細胞中TLR4、MyD88、NF-κB 表達水平 調(diào)整各組肺泡巨噬細胞濃度，以1×104/孔接種于24 孔板中，置入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h，常規(guī)提取目標蛋白TLR4、MyD88、NF-κB，測定蛋白濃度，準確量取50 μg，電泳將蛋白分離，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，以（1：500）比例稀釋，維持4 ℃過夜孵育，次日，加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的二抗（1：1500），經(jīng)顯色，曝光、顯影、定影后，以GAPDH 為內(nèi)參表示蛋白的表達水平。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 16.0 軟件，作圖工具采用Graphpad5.01，組間比較采用t檢驗，P＜0.05 表示具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織損傷

HE 染色結(jié)果顯示，正常組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，未見充血、擴張、出血以及纖維增生現(xiàn)象，肺泡腔結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁厚度均勻，無水腫、增寬、滲出等，肺部微血管未見異常；模型組大鼠肺泡腔內(nèi)大量炎性細胞填充，肺泡壁增厚明顯，正常肺泡結(jié)構(gòu)數(shù)量明顯減少，間質(zhì)充血明顯，可見較多的粉塵樣物質(zhì)，出現(xiàn)結(jié)節(jié)性的細胞顆粒，部分結(jié)節(jié)纖維化明顯，呈現(xiàn)片狀分布，肺部微血管壁明顯增厚；抑制劑組大鼠肺組織的病理損傷明顯緩解，稍見結(jié)節(jié)，正常肺泡結(jié)構(gòu)數(shù)量較模型組明顯增多，見圖1。

2.2 大鼠BALF 中IL-6 和TNF-α 含量

ELISA 結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組、抑制劑組大鼠BALF 中IL-6 和TNF-α 的水平明顯升高（P＜0.05），與模型組相比，抑制劑組大鼠BALF 中IL-6 和TNF-α 的水平明顯下降（P＜0.05），見圖2。

2.3 大鼠肺泡巨噬細胞的脂滴形成

油紅染色結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組、抑制劑組大鼠肺泡巨噬細胞油紅O 陽性細胞的比例明顯升高（P＜0.05），與模型組相比，抑制劑組大鼠肺泡巨噬細胞油紅O 陽性細胞的比例明顯降低（P＜0.05），見圖3。

2.4 大鼠肺泡巨噬細胞脂質(zhì)代謝基因的表達

PCR 結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組、抑制劑組大鼠肺泡巨噬細胞中ACC、SREBP、FAS 的表達明顯升高（P＜0.05），與模型組相比，抑制劑組大鼠肺泡巨噬細胞中ACC、SREBP、FAS 的表達明顯降低（P＜0.05），見圖4。

2.5 肺泡巨噬細胞中TLR4、MyD88、NF-κB 表達水平

Western blot 結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組、抑制劑組大鼠肺泡巨噬細胞中TLR4、MyD88、NF-κB 的表達明顯升高（P＜0.05），與模型組相比，抑制劑組大鼠肺泡巨噬細胞中TLR4、MyD88、NF-κB 的表達明顯降低（P＜0.05），見圖5。

3 討論

矽肺是主要由職業(yè)暴露、自身免疫降低引起的慢性炎癥性纖維化疾病，屬于一種職業(yè)病，在我國玻璃行業(yè)、水泥行業(yè)、礦山行業(yè)、石材加工以及陶瓷行業(yè)中的發(fā)病率逐年升高，致使從業(yè)人員出現(xiàn)慢性阻塞性肺病和肺結(jié)核等諸多疾病，危害健康，嚴重影響這些行業(yè)生產(chǎn)力的提高[11]。因SiO2誘發(fā)矽肺的機制尚未完全明確，目前的治療以免疫抑制以及給予糖皮質(zhì)激素為主，不能有效控制纖維化進展[12]。因此深入研究矽肺機制，尋求其可靠的靶向位點，在臨床藥物的開發(fā)中具有重大意義。

機體肺組織對于粉塵顆粒（主要含SiO2）的清除主要是通過肺泡巨噬細胞穿過上皮細胞層易位實現(xiàn)的。因此肺泡上皮巨噬細胞的病變在矽肺機制中扮演著重要的作用。Du 等[13]研究顯示當機體暴露于SiO2環(huán)境中，作為抵御外界刺激的第一道防線，肺泡巨噬細胞借助脂質(zhì)和蛋白質(zhì)分子間的相互作用將進入組織的SiO2吞噬，但是無法將SiO2消化掉，而造成脂質(zhì)（多為膽固醇）多度負載。Fang 等[14]報道巨噬細胞膽固醇代謝紊亂，SREBP 表達升高，膽固醇合成驟增是巨噬細胞泡沫化的關(guān)鍵因素，而以脂滴形式存在的膽固醇刺激ACC 和FAS 的合成，致使巨噬細胞中脂質(zhì)攝入、酯化、排出紊亂，最終造成巨噬細胞的生物活性降低，崩解死亡。本研究構(gòu)建大鼠矽肺模型，提取、分離、培養(yǎng)肺泡中的巨噬細胞，結(jié)果顯示模型組大鼠的巨噬細胞的脂質(zhì)沉積明顯增加，脂質(zhì)代謝因子基因的表達明顯升高，進一步證實巨噬細胞的脂質(zhì)代謝在矽肺中的作用。

研究顯示巨噬細胞受吞噬的SiO2的毒性作用，釋放大量的致炎性因子，并將炎性信號逐級放大，大量炎性細胞在肺組織中浸潤，釋放更多的炎癥介質(zhì)如IL-6 和TNF-α 等，引起炎性級聯(lián)反應(yīng)，肺組織微循環(huán)正常功能受阻，上皮細胞通透性改變，內(nèi)皮細胞功能障礙明顯，致使患者肺損傷[15]。TLR4/NF-κB 信號是機體內(nèi)重要的炎癥介導(dǎo)通路。Liu 等[16]研究指出TLR4 主要在肺組織的血管內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞以及氣道上皮細胞中表達，在各種肺損傷中發(fā)揮調(diào)控作用。TLR4 極易被炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6 等激活，將胞外炎性信號遞至胞內(nèi)MyD88，募集轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，將炎性級聯(lián)放大，使NF-κB 發(fā)生核移位，啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄，釋放炎性介質(zhì)和趨化因子，發(fā)揮炎性正反饋調(diào)節(jié)，促進肺損傷的病理進程[17]。本研究中注射TLR4/NF-κB 信號特異性抑制劑TAK-242，抑制劑組大鼠的肺組織病理損傷明顯減輕，BALF 中IL-6 和TNF-α 的含量明顯下降，肺組織中TLR4、NF-κB 的表達隨之下降，說明該組大鼠的炎性應(yīng)激明顯受限。對巨噬細胞的研究結(jié)果顯示，抑制劑組巨噬細胞的脂質(zhì)沉積明顯降低，脂質(zhì)代謝基因的表達明顯下降，說明TLR4/NF-κB 信號參與巨噬細胞的脂質(zhì)代謝的調(diào)控。

綜上所述，在SiO2所致大鼠矽肺模型中，TLR4/NF-κB 信號參與肺泡巨噬細胞的脂質(zhì)代謝的調(diào)控，抑制該信號的表達，能明顯抑制矽肺的病理損傷。但是如何將這種抑制作用應(yīng)用到臨床矽肺的治療，尚需更為深入的探討。