10份檸檬種質(zhì)花粉形態(tài)觀察

林秋金　王龍平　謝曉清　王美盛　林秀香

摘 ?要：為了明確檸檬不同種質(zhì)花粉的形態(tài)特征及各種質(zhì)之間的親緣關(guān)系，為檸檬種質(zhì)的鑒定和創(chuàng)新利用提供重要的參考，本研究以10份檸檬種質(zhì)的花粉為試材，通過場發(fā)射環(huán)境掃描電鏡對花粉形狀，花粉大小及花粉外壁紋飾等形態(tài)特征進(jìn)行觀察，并進(jìn)行比較分析。研究結(jié)果表明：檸檬花粉存在形式為單粒，花粉粒外部形態(tài)呈圓球形、近長球形或長球形，具有4～5條萌發(fā)孔溝，萌發(fā)孔溝沿極軸方向以等距環(huán)狀分布，溝長直達(dá)兩極。不同種質(zhì)的花粉形狀、花粉大小、花粉外壁網(wǎng)眼密度和網(wǎng)眼大小等均存在差異。極軸長33.56～41.20 μm，赤道軸長22.06～33.70 μm，花粉大?。≒×E）為844.90～1385.98 μm?；ǚ弁獗诩y飾為網(wǎng)狀雕紋，網(wǎng)脊寬為0.39～0.88 μm，網(wǎng)眼直徑為0.87～1.68 μm，網(wǎng)眼表現(xiàn)為圓形、近圓形或不規(guī)則多角形。花粉大小等級為中等，極面觀為四裂圓形或五裂圓形，赤道面觀為圓形，橢圓形或長橢圓形。10份檸檬種質(zhì)在花粉形狀、大小、外壁紋飾等方面表現(xiàn)出多樣性，可作為區(qū)分檸檬不同種質(zhì)的依據(jù)。

關(guān)鍵詞：檸檬;花粉;形態(tài)特征;掃描電鏡中圖分類號(hào)：S666.5 ??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Pollen morphology has a certain value in conservatism， so it is often used as a classification basis for plant resources. In order to clarify the pollen morphology and relationship among different lemon germplasms， which would provide an important reference for the identification and innovative utilization of different lemon germplasms. In the flowering period （February to March）， the flowers were picked up in the upper part of the crown periphery from robust plants， and the petals and calyx were removed with sterile tweezers. The anthers were placed indoors in the shade for 3 days. The pollens were collected and stored at low temperature. The pollens were used as the test materials and the morphological characteristics of pollen shape， pollen size and pollen exine ornamentation morphology were observed by the field emission environmental scanning electron microscope. Six quantitative features， including equatorial axis length， polar axis length， polar axis equatorial axis ratio， polar axis equatorial axis product， width of net ridge， mesh number were investigated. Data were normalized by DPSv3.01 software and clustered. The genetic distance was calculated as the euclidean distance， and the UPGMA method was used for the cluster analysis. The results showed that lemon pollen existed in the form of single grain， which was spherical， long spherical， nearly spherical， with 4–5 germination pore grooves. The germination pore grooves were distributed in an equidistant ring along the polar axis， and the groove length reached the two poles. The pollen shape， pollen size， mesh density and mesh diameter were different. The polar axis length was 33.56–41.20 μm. The equatorial axis length was 22.06–33.70 μm. The pollen grain （P×E） size was 844.90–1385.98 μm. The pollen exine ornamentation was reticular ornamentation. The width of net ridge was 0.39–?0.88?μm. The mesh diameter size was 0.87–1.68 μm. The mesh was round， nearly round or irregular polygon. The pollen was medium-sized， the polar view was?tetragonal or pentagonal， and the equatorial view was?round， elliptic or oblong. Ten lemon germplasms showed diversity in pollen shape， size and exine ornamentation morphology， which could be used as a basis to distinguish different lemon germplasms.?Femminello lemon （4×） had the largest pollen grain size， which was significantly larger than that of other germplasms. However， since only Femminello lemon （4×） was a ploidy variant in this study， whether the ploidy of lemon could be identified by observing the size of pollen needs further research.

lemon; pollen; morphological characteristic; SEM

： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.05.012

檸檬[?（L.）?Burm.f.]又稱檸果、洋檸檬、益母果等，為蕓香科柑橘屬常綠小喬木，果實(shí)中含有糖類、鈣、磷、鐵、鋅和維生素C、B1、B2等多種營養(yǎng)成分，還含有有機(jī)酸、黃酮類、揮發(fā)油、橙皮甙等，對人體十分有益，具有較高的食用和藥用價(jià)值?，F(xiàn)主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)的美國、巴西、意大利、阿根廷、澳大利亞等。檸檬在我國種植區(qū)主要集中在四川安岳和內(nèi)江、云南德宏，主要栽培品種為尤力克、費(fèi)米耐勞、里斯本，品種結(jié)構(gòu)單一，已不能滿足檸檬生產(chǎn)和市場的需要。近年來，各地區(qū)加大對品種引進(jìn)與選育的力度，使得資源不斷豐富。目前美國、澳大利亞、西班牙等柑橘科研大國在檸檬品種選育及砧木改良方面的研究較為深入，國內(nèi)檸檬研究與產(chǎn)業(yè)發(fā)展均相對滯后。劉文婷等引進(jìn)臺(tái)灣檸檬新品種在寧德試種及栽培，牛先前等對9份檸檬種質(zhì)資源的物候期進(jìn)行了觀測，杜玉霞等研究了施肥量對檸檬幼樹礦質(zhì)養(yǎng)分、產(chǎn)量及品質(zhì)的影響，王海鷗等探索了不同干燥方式對檸檬片干燥特性及品質(zhì)的影響，尤桂春等對13份檸檬種質(zhì)資源表型性狀遺傳多樣性進(jìn)行分析，王自然等對云南的檸檬灰霉病為害癥狀與發(fā)病適期進(jìn)行觀察，研究領(lǐng)域主要涉及引種及栽培配套技術(shù)、加工和貯藏保鮮技術(shù)、果實(shí)品質(zhì)的測定評價(jià)、資源多樣性研究等，對于檸檬花粉形態(tài)特征的研究報(bào)道較少。尤桂春等對10份檸檬種質(zhì)的花粉形態(tài)進(jìn)行了掃描電子顯微鏡觀察，并根據(jù)花粉的某一或某兩個(gè)性狀特征來區(qū)分不同的種質(zhì)，由于采用的性狀特征數(shù)量有限，很難代表不同檸檬種質(zhì)的綜合性狀特征。本研究利用掃描電鏡對10份檸檬種質(zhì)花粉形態(tài)特征進(jìn)行觀察，在綜合分析不同檸檬種質(zhì)花粉的形態(tài)學(xué)性狀指標(biāo)的基礎(chǔ)上運(yùn)用DPS?v3.01統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行聚類分析，它是基于性狀間的相關(guān)性與歐式遺傳距離大小對不同檸檬種質(zhì)遺傳親緣關(guān)系的分類，能比較客觀地反映出分類群之間的內(nèi)在遺傳關(guān)系，可為檸檬種質(zhì)的鑒定和創(chuàng)新利用方面提供重要的參考。

??材料與方法

?材料

供試材料為福建省熱帶作物科學(xué)研究所檸檬種質(zhì)資源圃收集的10份資源：泰國中果、臺(tái)灣大果、四倍體費(fèi)米耐勞、尤力克、香水檸檬、白花費(fèi)米耐勞、粗檸檬、廣東檸檬、越南青、紅花檸檬。

??方法

在盛花時(shí)期（2—3月），選擇健壯的檸檬植株，采集樹冠外圍中上部含苞待放的花蕾，用消過毒的鑷子去掉花瓣和雌蕊，只留花藥，置于室內(nèi)陰干3 d，將獲得的花粉放置于干燥管中，保存在4℃冰箱中備用。檢測時(shí)將干燥花粉均勻地撒在粘有導(dǎo)電膠的樣品臺(tái)上，用離子濺射儀進(jìn)行真空噴金鍍膜，在場發(fā)射環(huán)境掃描電鏡下進(jìn)行觀察。選擇有代表性的視野進(jìn)行觀察和拍照，500倍觀察花粉粒的群體形態(tài)，3000倍觀察花粉赤道面，3500倍觀察花粉極面，10?000倍觀察花粉外壁紋飾，并測量極軸長（P）、赤道軸長（E）、網(wǎng)脊寬度及網(wǎng)眼直徑。文中術(shù)語的描述及所定標(biāo)準(zhǔn)主要參考《孢粉學(xué)手冊》和王開發(fā)等的文獻(xiàn)。

?數(shù)據(jù)處理

每份材料選取20粒飽滿的花粉粒進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的測量，采用Excel 2007和DPS v3.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，品種間顯著性差異采用Tukey法進(jìn)行比較。選取赤道軸長、極軸長、網(wǎng)脊寬度、P/E值、P×E值、50 μm網(wǎng)眼數(shù)共6個(gè)定量特征，用DPS v3.01軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，采用歐氏距離類平均法。

??結(jié)果與分析

?檸檬花粉的萌發(fā)器官

10份檸檬種質(zhì)花粉的萌發(fā)器官均為孔溝類型（圖1），即花粉表面同時(shí)存在著孔和溝?；ǚ哿４蠖嗑哂?～5條孔溝，四倍體費(fèi)米耐勞具有5條孔溝的花粉多，四條孔溝的花粉少，臺(tái)灣大果、

尤力克檸檬和白花費(fèi)米耐勞具有5條孔溝的花粉少，4條孔溝的花粉多，其余種質(zhì)的花粉只具有4條孔溝。萌發(fā)孔溝沿極軸方向以等間距環(huán)狀分布，從極面可以觀察到4～5條，從赤道面可以觀察到1～3條，溝長直達(dá)兩極。

檸檬花粉的形態(tài)和大小

10份檸檬種質(zhì)的花粉均以單粒形式存在（圖1）。花粉粒最長軸的長度在33.56～41.20 μm之間（表1），按照埃爾特曼的劃分標(biāo)準(zhǔn)，花粉大小等級屬于中等。從極軸的長度來看，四倍體費(fèi)米耐勞最長，為41.20?μm，與香水檸檬（38.91?μm）差異顯著，與其他種質(zhì)差異極顯著;香水檸檬、廣東檸檬、紅花檸檬、越南青檸檬和臺(tái)灣大果檸檬的極軸長分別為38.91、38.36、37.56、37.39和37.26 μm，之間差異不顯著;香水檸檬與泰國中果（36.61?μm）差異顯著，與粗檸檬（35.36?μm）、尤力克檸檬（34.97?μm）和白花費(fèi)米耐勞（33.56?μm）差異極顯著。從赤道軸的長度來看，四倍體費(fèi)米耐勞最大為33.70 μm，極顯著大于其他種質(zhì)，尤力克（30.09?μm）與白花費(fèi)米耐勞（29.15?μm）差異不顯著，與其他種質(zhì)差異極顯著。從P×E值進(jìn)行花粉大小比較可以看出，四倍體費(fèi)米耐勞的花粉粒（1389.66 μm）最大，極顯著大于其他種質(zhì)。

P/E值的大小用于反映花粉的形狀，10份檸檬種質(zhì)花粉的P/E值在（1.15±0.02）～（1.75±0.08）之間（表1），依據(jù)王開發(fā)等的方法判斷其花粉粒形狀為圓球形、近長球形或者長球形。赤道面觀為長橢圓形、橢圓形或者近圓形，極面觀為四裂圓形或五裂圓形。其中廣東檸檬的P/E值最大，為1.75，與越南青檸檬（1.66）和香水檸檬（1.66）差異不顯著，與泰國中果（1.54）差異顯著，極顯著大于其他種質(zhì);尤力克、四倍體費(fèi)米耐勞和白花費(fèi)米耐勞的P/E值分別為1.16、1.24和1.15，之間差異不顯著，極顯著小于其他種質(zhì)。

?檸檬花粉外壁紋飾

從圖1中1D～10D可以看出，10份檸檬種質(zhì)花粉的外壁紋飾均為網(wǎng)狀雕紋，網(wǎng)脊平滑。網(wǎng)眼圓形、近圓形或不規(guī)則多角形，形狀多樣。網(wǎng)脊寬度、網(wǎng)眼大小和網(wǎng)眼分布密度在不同種質(zhì)間差異達(dá)極顯著（表2）。其中，尤力克和臺(tái)灣大果的網(wǎng)脊寬均為0.88 μm，二者之間差異不顯著，極顯著大于其他種質(zhì)，泰國中果和香水檸檬的網(wǎng)脊寬分別為0.42 μm和0.39 μm，極顯著小于其他種質(zhì)。50?μm網(wǎng)眼數(shù)以越南青最多，為26.91個(gè)，與紅花檸檬（23.42個(gè)）和廣東檸檬（22.87個(gè)）差異不顯著，與白花費(fèi)米耐勞（21.33個(gè)）差異顯著，極顯著多于其他種質(zhì)。而香水檸檬、泰國中果，粗檸檬、四倍體費(fèi)米耐勞、臺(tái)灣大果和尤力克網(wǎng)眼數(shù)較少，這些種質(zhì)之間差異不顯著。香水檸檬、粗檸檬和臺(tái)灣大果的網(wǎng)眼直徑比較大，分別為1.68 μm、1.68 μm和1.63?μm，白花費(fèi)米耐勞（0.87 μm）最小。

檸檬花粉的整齊度

觀察表明：泰國中果、越南青、廣東檸檬、香水檸檬和粗檸檬花粉比較整齊，其形態(tài)表現(xiàn)基本一致，均呈長球形，其中發(fā)育不良，畸形的異型花粉粒占比少（小于10%），而四倍體費(fèi)米耐勞，白花費(fèi)米耐勞、臺(tái)灣大果、尤力克和紅花檸檬花粉整齊性相對較差，空癟花粉和畸形的異型花粉占比高（40%～60%），飽滿的花粉粒有2～3種表現(xiàn)形態(tài)。

?聚類分析

利用DPS?v3.01統(tǒng)計(jì)軟件的系統(tǒng)聚類法對極軸、赤道軸、P/E、P×E、網(wǎng)脊寬、50 μm網(wǎng)眼數(shù)共6個(gè)定量特征進(jìn)行聚類分析。數(shù)據(jù)經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化后，以歐氏距離計(jì)算，其中最長距離法、WPGMA法、類平均法、可變類平均法和離差平方和法5種方法聚類結(jié)果一致，圖2為類平均法聚類圖，在遺傳距離3.0處將試驗(yàn)材料分為3個(gè)組群。第

一組包括泰國中果、粗檸檬、香水檸檬、廣東檸檬和越南青共5份種質(zhì)，該組主要特征是網(wǎng)脊窄（0.39～0.63 μm），花粉較?。?44.90～916.64 μm）;第二組為臺(tái)灣大果、尤力克、紅花檸檬和白花費(fèi)米耐勞共4份種質(zhì)，該組特征為網(wǎng)脊寬較寬（0.69～?0.88?μm），花粉較大（969.47～1054.77?μm）;第三組為四倍體費(fèi)米耐勞，特征為花粉粒大（1385.98 μm），網(wǎng)脊中等（0.69 μm）。由此可見，通過檸檬花粉形態(tài)的花粉大小、網(wǎng)脊寬度、網(wǎng)眼密度等數(shù)量特征聚類分析可大致反映不同種質(zhì)間的親緣關(guān)系。

?討論

本研究結(jié)果表明：10份檸檬種質(zhì)的花粉均以單粒形式存在，外部形狀為圓球形、近長球形和長球形，花粉大?。≒×E）為（33.56～41.20）μm×（22.06～33.70）μm，大小為中等，與武曉曉等、葉蔭民等的研究結(jié)果較為一致。而尤桂春等研究10份檸檬種質(zhì)花粉形態(tài)，認(rèn)為花粉形狀為扁球形、近球形、長球形，花粉大?。≒×E）為（10.01～ 14.84）μm×（8.63～16.56）μm，花粉大小等級為小花粉，與本研究的結(jié)果差異大。究其原因可能是：應(yīng)用掃描電鏡對花粉形態(tài)進(jìn)行觀測，對樣品的處理方式不同，導(dǎo)致觀察的結(jié)果差異很大，還可能與花粉采集的時(shí)間及測量的儀器設(shè)備不同等因素有關(guān)，導(dǎo)致研究結(jié)果缺乏可比性。

本研究結(jié)果表明10份檸檬種質(zhì)花粉的外壁紋飾為典型的網(wǎng)狀雕紋，從孢粉學(xué)進(jìn)化觀點(diǎn)看，這種網(wǎng)紋屬于比較進(jìn)化的孢粉類型。網(wǎng)脊寬度、網(wǎng)眼大小和網(wǎng)眼密度在不同的種質(zhì)之間差異達(dá)極顯著。聚類結(jié)果顯示10份檸檬種質(zhì)在遺傳距離3.8處聚為兩類，四倍體費(fèi)米耐勞（倍性變異種）單獨(dú)聚為一類，其余9份種質(zhì)聚為一類。其余9份種質(zhì)在遺傳距離3.0處又聚為兩類，其中泰國中果、粗檸檬、香水檸檬、廣東檸檬和越南青5份種質(zhì)聚為一類，臺(tái)灣大果、尤力克、紅花檸檬和白花費(fèi)米耐勞4份種質(zhì)聚為一類。而進(jìn)一步的聚類結(jié)果（紅花檸檬除外）與形態(tài)學(xué)特征較為一致。紅花檸檬從宏觀形態(tài)特征（花果實(shí)的性狀，種子數(shù)量，種子形態(tài)等）方面表現(xiàn)出與其他9份種質(zhì)差異明顯，本研究聚類分析顯示出其與白花費(fèi)米耐勞的親緣關(guān)系最近。四倍體費(fèi)米耐勞和白花費(fèi)米耐勞同為費(fèi)米耐勞檸檬的不同品系，從理論上推測它們的親緣關(guān)系應(yīng)較近，但二者在形態(tài)特征上差異很大，在本研究中四倍體費(fèi)米耐勞單獨(dú)聚為一類。研究表明用花粉形態(tài)特征進(jìn)行聚類能粗略反映不同種質(zhì)之間的遺傳距離，但難以準(zhǔn)確聚類每一份種質(zhì)，對于較為特殊的種，如倍性變異種，就難以準(zhǔn)確聚類。

已有研究發(fā)現(xiàn)，與同類二倍體植株相比，多倍體植株的器官更大，隨著染色體倍性的增加，其花粉體積也會(huì)增大。晏春耕等研究認(rèn)為苧麻的花粉大小與染色體倍性呈正相關(guān);鄧秀新等研究認(rèn)為柑桔同源及異源四倍體花粉粒體積平均為二倍體的2倍或雙親之和;張成合等研究認(rèn)為十字花科蔬菜不同倍性間，花粉大小差異十分明顯，在光學(xué)顯微鏡下通過觀測花粉的大小，便可對植株的倍性進(jìn)行比較準(zhǔn)確的鑒別，在植物多倍體育種中，可大大減少染色體數(shù)目鑒定的工作量。本研究結(jié)果表明四倍體費(fèi)米耐勞花粉粒體量最大，極顯著大于其他種質(zhì)。但是由于本研究僅四倍體費(fèi)米耐勞是倍性變異種，對于檸檬的倍性是否可以通過觀測花粉的大小來鑒別，還需要進(jìn)一步的研究。

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