基于轉(zhuǎn)錄組的荔枝泛素結(jié)合酶基因家族的鑒定及表達分析

董晨　李金枝　鄭雪文　王弋　李偉才

摘 ?要：泛素結(jié)合酶在泛素化級聯(lián)反應(yīng)中居于中心位置，是連接泛素活化酶和泛素連接酶的橋梁，在泛素化系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本研究基于荔枝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，利用生物信息學方法對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫泛素結(jié)合酶UBC基因家族進行鑒定，最終得到28個LcUBC基因家族成員。通過熒光定量PCR技術(shù)對LcUBC基因家族在‘妃子笑’荔枝不同組織中進行時空表達分析，并對花穗對照和烯效唑處理花穗發(fā)育的不同時期進行表達分析。結(jié)果表明：LcUBC基因家族成員對應(yīng)所編碼的氨基酸數(shù)分布在85～1146 aa之間，等電點大小在4.03～9.61之間，5個LcUBC蛋白為穩(wěn)定蛋白，其余均為不穩(wěn)定蛋白。2個LcUBC蛋白定位于細胞質(zhì)，2個LcUBC蛋白定位于細胞質(zhì)和細胞核，1個LcUBC蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其余蛋白均定位于細胞核。系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明，LcUBC蛋白分為10個亞家族;28個LcUBC基因家族成員在不同組織的表達量存在差異;烯效唑處理‘妃子笑’荔枝花穗與對照相比，烯效唑處理21?d后，LcUBC基因家族成員的多個基因表達量較高。這是在轉(zhuǎn)錄組水平分析LcUBC基因家族成員，本研究結(jié)果對今后該基因家族的分類、克隆和功能研究提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：荔枝;泛素結(jié)合酶;基因家族;表達分析中圖分類號：S667.1??????文獻標識碼：A

?

Ubiquitin-conjugating enzymes play a central role in the ubiquitination cascade. They are the bridge between ubiquitin activating enzymes and ubiquitin ligases， and play a key role in the ubiquitination system. Through the local BLAST search and keyword search of transcriptome database， 32 ubiquitin-conjugating enzyme gene family members， including 5 ?and 28 ?genes， were obtained through smart screening of conserved domains. Only –??was studied in the article. Based on the litchi transcriptome database， the ubiquitin-conjugating enzyme gene family was identified by bioinformatics methods， and the temporal and spatial expression of ubiquitin-conjugating enzyme gene family in different tissues and organs of Feizixiao litchi was analyzed by the fluorescence quantitative PCR technology. Meanwhile， the expression of the control and uniconazole treatment at different stages of flower development was analyzed. The results showed that the amino acids were 85–1146?aa. The isoelectric point ranged?from 4.03 to 9.61. Five LcUBC proteins were?stable， and the others?LcUBC proteins were?unstable. Two LcUBC proteins were located in cytoplasm， two LcUBC proteins?in cytoplasm and nucleus， one?LcUBC protein in endoplasmic reticulum and the rest LcUBC proteins?in nucleus. There were?great differences in the length of the protein and the changes in the characteristics of the protein， indicating that the proteins of the ubiquitin protease gene family had?different characteristics. In the multiple sequence alignment， all 28?LcUBC?genes contained an evolutionarily highly conserved amino acid residue cysteine active site， and the C-terminal tryptophan （W） located behind the cysteine active site.?The 28 LcUBC proteins?were also highly conserved， and the “HPNI” conserved motif was located 7–10 amino acids before the active site of cysteine. The?LcUBC?gene?family was predicted to contain 10 conserved motifs. There were?certain differences in the number and types of conserved motifs contained in the members of the LcUBC?gene family. Among them， the conserved motifs 1 and 2 were?very important conserved motifs in the LcUBC domain. Phylogenetic analysis showed that the?litchi?UBC protein was divided into 10 subfamilies， namely UBC1， UBC2/11， UBC3/7， UBC4/5， UBC6， UBC8， UBC10/12， UBC13， UBC14， UBC15.?The 28?genes were?expressed in at least one tissue， and the expression levels of different genes in different tissues?were?different. Among them， the expression of ，， and ?in seeds?were?significantly higher than that of other tissues， and the expression of7 in male flowers was significantly higher than that of other tissues. The expression level of female flowers of ?and ?was significantly higher than that of other tissues， and ?was highly expressed in pericarp and old leaves. Compared with the control， the expression levels of LcUBC?genes in different developmental stages of Feizixiao litchi flower spikes treated with uniconazole were higher at 21 days after the treatment with Uniconazole. This is the first time that the?litchi?UBC?gene family was?analyzed at the transcriptome level. The results of the study would?provide some referrences for future studies on the classification， cloning and function of this gene family.

?Sonn.; ubiquitin-conjugating enzyme; genes family; expression analysis

： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.05.002

荔枝（Sonn.）是熱帶、亞熱帶發(fā)展中國家的最重要的作物之一。目前荔枝產(chǎn)業(yè)已成為中國華南熱作產(chǎn)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)之一，對中國南方農(nóng)村經(jīng)濟的發(fā)展和熱區(qū)農(nóng)民收入水平的提高發(fā)揮了舉足輕重的作用。2018年是我國有史以來最豐產(chǎn)的一年，據(jù)不完全統(tǒng)計，全國荔枝種植面積約為54.2萬hm，產(chǎn)量約為301萬t，種植面積排在蘋果、柑橘、梨、葡萄和桃之后，屬于大宗果樹，但從總產(chǎn)量來看卻還算“小水果”。2018年荔枝結(jié)果面積按照總種植面積的80%計算，平均單產(chǎn)不足7.0 t/hm。‘妃子笑’具有花穗長、花量大、坐果率低的特點，坐果率低是其生產(chǎn)中亟待解決的一個“瓶頸”問題，調(diào)控坐果的分子機理是當今果實發(fā)育領(lǐng)域研究的一個熱點問題。

泛素-蛋白酶體途徑（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）廣泛存在于真核生物中，并且在維持細胞功能、細胞周期運轉(zhuǎn)、抵御環(huán)境脅迫、胚胎發(fā)育、激素響應(yīng)和衰老等方面發(fā)揮著重要的作用。在泛素化過程中，關(guān)鍵酶主要包括泛素活化酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）和泛素-蛋白連接酶（E3）。編碼E2及E2-like的基因已報道37個，根據(jù)結(jié)構(gòu)和序列的相似性可分為12個亞家族或14個組，E2-like基因8個。E2蛋白的典型特征是包含一個長約140～200 aa的保守催化結(jié)構(gòu)域——UBC結(jié)構(gòu)域，內(nèi)含有1個高度保守的半胱氨酸活性位點，另外還存在一類UEV（ubiqutin E2 variants）蛋白，該蛋白家族在序列和結(jié)構(gòu)上與泛素結(jié)合酶相似，但是缺少半胱氨酸催化位點，其功能也與典型的泛素結(jié)合酶蛋白有所不同。E2多以基因家族的形式存在，參與許多植物生理活動。泛素結(jié)合酶在泛素化級聯(lián)反應(yīng)中居于中心位置，是連接泛素活化酶和泛素連接酶的橋梁，在泛素化系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。

目前，對E2基因的研究多集中在對DNA的修復進程。如在核酸修復途徑中，UBC35/UBC36和 Mms2p/Uev1a蛋白形成復合物，在賴氨酸位點催化形成泛素鏈，來引發(fā)核酸修復的信號轉(zhuǎn)導，完成對受損核酸的修復。UBC13協(xié)同E3連接酶RNF 8相互作用形成復合物，DNA損傷信號通過依賴泛素化的信號途徑來傳遞至染色質(zhì)，引發(fā)染色質(zhì)蛋白的磷酸化，促使RNF 8-UBC 13復合物定位到受損傷的核酸部位，產(chǎn)生泛素鏈后觸發(fā)DNA修復信號通路，使RAP 80蛋白和整個Brca1A復合物定位到受損傷的DNA部位，對損傷的DNA進行修復。另外還有研究表明RNF 8-UBC 13復合物可獨立的行使底物蛋白的泛素化，并促進DNA損傷的調(diào)節(jié)子53BP1蛋白的積累。

泛素結(jié)合酶在植物衰老和果實發(fā)育過程中起重要作用。PICTON等首次從番茄中克隆到泛素結(jié)合酶基因，研究發(fā)現(xiàn)泛素結(jié)合酶基因在番茄葉片衰老和果實成熟過程中表達。香蕉采后早期抑制差減文庫中篩選得到香蕉中的泛素結(jié)合酶基因，該基因介導細胞內(nèi)小的調(diào)節(jié)蛋白的降解，與酵母中的UBC 4/UBC 5結(jié)合，推測該基因可能通過影響果實成熟過程中淀粉酶的活性或含量而參與對淀粉降解的調(diào)控，在果實成熟衰老的分解代謝中發(fā)揮作用。2013年日本學者研究表明，大豆近等基因系成熟基因座等位基因?qū)蛐偷男揎椏梢蕴峁┬缕贩N，與對照相比，新品種花期較晚且產(chǎn)量高，可以適應(yīng)不同的緯度環(huán)境，并可保留原來的種子質(zhì)量。WANG等研究發(fā)現(xiàn)，番茄中2個E2基因（和）參與調(diào)控番茄果實成熟，但具體分子調(diào)控機制尚不清楚。DONG等研究香蕉花后果實不同發(fā)育階段E2基因家族的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E2基因家族不同成員在果實發(fā)育不同階段行使功能，推測這些基因在果實發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。陳曙等研究低磷處理下玉米幼苗不同組織中基因的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因具有組織表達特異性，在葉片中大量表達，推測基因是通過調(diào)控玉米對磷元素吸收和轉(zhuǎn)運間接影響光合作用效率。

通過對擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫搜索顯示，基因以多拷貝形式存在，造成E2蛋白功能冗余，這可能是使基因的研究進展不大的主要原因。近年來，隨著基因組測序技術(shù)的不斷提高，越來越多的植物完成全基因組的測序工作，越來越多的植物物種中泛素結(jié)合酶基因家族在基因組學上得到鑒定，如玉米、可可、水稻、葡萄、普通油茶和香蕉等。目前，關(guān)于荔枝基因家族的研究有XTH、ARF基因家族，關(guān)于荔枝泛素結(jié)合酶基因家族僅僅研究了基因。

本研究基于荔枝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，利用生物信息學方法對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫UBC基因家族進行鑒定，并通過熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)對LcUBC基因家族在‘妃子笑’荔枝不同組織中進行時空表達分析，并對花穗對照和烯效唑處理花穗發(fā)育的不同時期進行表達分析，挖掘關(guān)鍵的LcUBC基因家族成員，為今后LcUBC基因功能的研究奠定基礎(chǔ)。本研究結(jié)果將為從蛋白質(zhì)降解方面深化荔枝坐果機理的研究和生產(chǎn)上調(diào)控荔枝坐果技術(shù)措施提供理論依據(jù)。

材料與方法

?材料

供試品種為‘妃子笑’荔枝，取自廣東省湛江市麻章區(qū)湖光鎮(zhèn)湖秀路一號南亞熱帶作物研究所荔枝栽培示范園，荔枝UBC蛋白序列來源于本課題組前期構(gòu)建的‘妃子笑’花穗發(fā)育轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（GenBank accession SRP092890）。

?方法

1.2.1 ?LcUBC基因家族的鑒定與分析??利用模式植物擬南芥和水稻UBC序列作為探針序列，運用本地Blast軟件對荔枝測序轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的unigene進行搜索;同時，利用關(guān)鍵詞“Ubiquitin-?conjugating enzymes”和“UBC”直接檢索，得到所有可能的UBC序列后，對檢索結(jié)果進行整合分析，去除重復序列后，利用Pfam在線軟件對序列保守結(jié)構(gòu)域進行鑒定，去除不含LcUBC基因家族保守結(jié)構(gòu)域的序列。

1.2.2 ?LcUBC蛋白的基本理化性質(zhì)、序列比對和進化分析??運用ProtParam在線軟件（http：//web.?expasy.org/protparam/）分析預測LcUBC蛋白序列的分子量、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪指數(shù)和疏水性等基本的理化性質(zhì);采用Plant-mPLoc Server在線軟件（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/?plant-multi/#）分析LcUBC蛋白的亞細胞定位;運用MEME?4.12.0在線軟件（http：//meme.nbcr.net/?meme/）分析LcUBC家族蛋白的保守基序，參數(shù)設(shè)置：基序的最大數(shù)目設(shè)置為10， 基序長度設(shè)為6～150個氨基酸，其他參數(shù)為默認值。通過MEGA?6.0的MUSCLE程序比對氨基酸多重序列，參數(shù)為程序默認參數(shù)。利用多重序列比對產(chǎn)生的LcUBC保守結(jié)構(gòu)域145個氨基酸殘基后續(xù)進行NJ（Neighbor-Joining）分析。采用MEGA?6.0軟件構(gòu)建進化樹，Bootstrap值設(shè)為1000次重復，以獲得更為可靠的分支聚類，其他參數(shù)為默認參數(shù)。

1.2.3 ?LcUBC基因家族在花穗調(diào)控下的表達特征分析??選擇樹齡相同、長勢相近的‘妃子笑’荔枝樹，分別選取荔枝樹的不同組織如嫩葉、根、莖、老葉、雌花、雄花、果肉、果皮、種子，液氮速凍后存放于–80℃冰箱中，用于RNA的提取。

花穗處理：選擇樹齡相同、長勢相近的‘妃子笑’荔枝樹，當花穗長度抽生至約18?cm時，進行如下操作：（1）對照組（CK），不做任何處理;（2）烯效唑（Un）處理，用50?mg/L烯效唑（品牌：四川國光，有效成分含量5%）噴施，噴至葉面滴水;分別取對照及烯效唑處理后0、7、14、21、28、35、42?d的花穗，液氮速凍后存放于–80℃冰箱中，用于RNA的提取。

選用前期課題組篩選的為內(nèi)參，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組中注釋的LcUBC的核苷酸序列，利用在線軟件Primer?3?plus設(shè)計熒光定量引物（表1），通過Blast分析引物的特異性，引物序列委托廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成。將處理好的材料按照RNA提取標準進行磨樣，采用華越洋生物科技有限公司RAN提取試劑盒QK型，分別對根、莖、嫩葉、老葉、雌花、雄花、果肉、果皮、種子和花穗的總RNA進行提取，提取1?μL檢測RNA的質(zhì)量和濃度，樣品符合要求后利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qPCR分析采用SYBR Premix Ex Taq?（TaKaRa）試劑盒，Roche480Ⅱ定量PCR系統(tǒng)（瑞士），采用384孔板，qPCR反應(yīng)體系為10?μL，其中cDNA?1?μL（相當于25?ng總RNA），10?μmol/L基因特異性引物1?μL，2×SYBR Premix ExTaq?5?μL，最后用ddHO補足10?μL。qPCR反應(yīng)條件：50℃預變性2?min，95℃預變性2?min;95℃變性15?s，56℃退火15?s，72℃延伸30?s，共55個循環(huán)。每個樣品3個重復。采用2法計算基因相對表達量。

結(jié)果與分析

?基因家族的鑒定

首先對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的本地Blast進行比對檢索和關(guān)鍵詞搜素，再通過SMART對保守結(jié)構(gòu)

域進行篩選，最終得到28條LcUBC蛋白序列。為了便于研究，按照轉(zhuǎn)錄組中的基因ID大小前后順序統(tǒng)一為LcUBC蛋白編號為LcUBC 1～LcUBC 28（表2），對應(yīng)所編碼的氨基酸數(shù)分布在85～ 1149?aa之間;預測的理論分子量大小范圍在9.668～102.307?kDa之間。等電點大小范圍在4.03～9.61之間，其中 18個LcUBC蛋白的等電點小于7，顯酸性;10個LcUBC蛋白等電點大于7，顯堿性;LcUBC蛋白平均等電點小于7，表明UBC蛋白為弱酸性，在酸性的亞細胞環(huán)境中發(fā)揮作用。不穩(wěn)定指數(shù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5個LcUBC蛋白（LcUBC?4、LcUBC 9、LcUBC 18、LcUBC 23和LcUBC 25）的不穩(wěn)定指數(shù)小于40，為穩(wěn)定蛋白，其余均為不穩(wěn)定蛋白。平均親水系數(shù)結(jié)果表明，除了LcUBC 4蛋白疏水，其余均為親水蛋白。亞細胞定位分析結(jié)果表明，LcUBC 7和LcUBC 16蛋白定位于細胞質(zhì)，LcUBC 1和LcUBC 24蛋白定位于細胞質(zhì)和細胞核，LcUBC 6蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其余蛋白均定位于細胞核。綜合上述分析結(jié)果，無論從氨基酸序列的長度還是蛋白的特性變化分析，LcUBC蛋白都有很大差異，這表明LcUBC基因家族蛋白具有不同特性。

?基因家族蛋白保守基序分析

通過多重序列比對LcUBC基因家族的氨基酸序列全長，比較不同LcUBC家族成員間UBC保守結(jié)構(gòu)域的特點（圖1），多重序列比對中，28個基因均含有進化上高度保守的氨基酸殘基半胱氨酸的活性位點，位于半胱氨酸活性位點后的C-端色氨酸（W）在28個LcUBC蛋白中也高度保守，“HPNI”保守基序位于半胱氨酸活性位點之前的7～10位氨基酸。

通過在線軟件MEME分析LcUBC蛋白中的保守基序，結(jié)果見圖2。預測LcUBC基因家族中含有10個保守基序，LcUBC基因家族成員之間所包含的保守基序數(shù)目及種類存在一定的差異。在LcUBC基因家族中有25個成員含Motif?1基序，有15個成員含Motif 2基序。通過SMART分析Motif?1、Motif 2為LcUBC蛋白結(jié)構(gòu)域中非常重要的保守基序。

為進一步了解LcUBC基因家族成員之間的進化關(guān)系，利用模式物種擬南芥中的37個AtUBC和酵母中的13個ScUBC同荔枝中的28個LcUBC構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖3），結(jié)果表明，荔枝中的28個LcUBC分為10個亞家族，分別為UBC1、UBC2/11、UBC3/7、UBC4/5、UBC6、UBC8、UBC10/12、UBC13、UBC14、UBC15，其中UBC14和UBC15在酵母基因組中缺失，推測UBC14和UBC15是植物中特有的或是酵母進化過程中丟失。

??基因家族時空表達分析

UBC參與DNA的損失修復、生長、發(fā)育及脅迫響應(yīng)等方面，為了研究LcUBC基因家族在不同發(fā)育過程中的功能，分析9個不同組織（如嫩葉、嫩莖、果皮、種子、根、雄花、老葉、雌花、果肉）中基因的表達情況（圖4）。在植物正常的發(fā)育過程中，不是所有的基因在不同組織部位都表達，28個LcUBC基因家族成員中至少在某一個組織部位表達（圖5），推測這些基因有可能是在生物脅迫或非生物脅迫條件下表達。其中，在種子中的表達顯著高于其他組織，在雄花中的表達上顯著較高于其他組織，在雌花中的表達量顯著高于其他組織，在果皮和老葉中高表達。

??基因家族在花穗調(diào)控表達模式

利用qPCR分析LcUBC基因家族在荔枝花穗調(diào)控的表達量（圖5），結(jié)果表明，與對照相比，LcUBC基因家族在烯效唑處理后表達量存在顯著變化，經(jīng)烯效唑處理后，在7、14、21、28、35 d表達量上調(diào)，在21?d表達量最高，在35?d表達量最高，表達呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在21?d表達量最高。與對照相比表達有變化，但差異不顯著。

??討論

本研究參考擬南芥和水稻UBC家族基因的信息，基于烯效唑處理荔枝花穗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用生物信息學方法全面分析鑒定LcUBC基因家族。結(jié)果共鑒定出28個LcUBC基因家族成員，并對其基本理化性質(zhì)、亞細胞定位進行了分析。通過對LcUBC基因家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析可看出，LcUBC蛋白的結(jié)構(gòu)域具有高度的保守性，包含典型的保守結(jié)構(gòu)域UBC domain，且含有半胱氨酸活性位點，這與香蕉中UBC蛋白的分析結(jié)果一致。

通過轉(zhuǎn)錄組及qPCR的結(jié)果分析，在荔枝的時空表達和烯效唑處理后的花穗調(diào)控中，大多數(shù)LcUBC基因家族的表達水平發(fā)生了變化，推測這些基因很可能通過參與激素信號轉(zhuǎn)導途徑或調(diào)控果實相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的水平，進而影響荔枝果實成熟過程中的各種生理變化。在種子中表達量較高，推測這5個LcUBC家族基因在果實種子發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用;在雌花中表達量較高，在雄花中表達量較高，推測這7個LcUBC家族基因在果實花發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用;在老葉中表達量較高，而在果皮中表達量較高。多個LcUBC家族基因的表達水平在烯效唑處理后第21天的表達量較高，這表明LcUBC基因家族在該時期調(diào)控荔枝花穗發(fā)育過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。該研究結(jié)果為進一步研究LcUBC基因家族的生物學功能奠定了堅實的基礎(chǔ)。

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