云南老人頭菌多糖的提取及抗氧化活性研究

胡棟寶，王艷，楊猛，李琛

(玉溪師范學(xué)院 化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，云南 玉溪 653100)

老人頭菌，又名仙人頭，主要分布于云南、四川、西藏等地，生長(zhǎng)在云貴高原3000 m以上松杉木、油杉等針葉林中陰濕疏松的地上，目前人工無法培植, 是一種珍稀的野生食用菌。老人頭菌潔白細(xì)嫩、滋味鮮美，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)及維生素，常被用作調(diào)味品。真菌多糖具有抗菌、抗病毒、抗凝血、降血脂、降血糖、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[1]，在食品工業(yè)及調(diào)味品領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，例如：添加猴頭菇輔料制成的黑木耳復(fù)合多糖口服液能夠顯著增強(qiáng)小鼠的免疫能力[2]；香菇多糖能提高人體內(nèi)短鏈脂肪酸的含量，從而具有調(diào)節(jié)腸道菌群的能力[3]；雞腿菇多糖、靈芝多糖具有較強(qiáng)的抗氧化及降血糖功效[4]。目前，尚未見有關(guān)老人頭菌中多糖的提取及抗氧化活性的報(bào)道，為了進(jìn)一步開發(fā)利用這種野生食用菌資源，本研究以云南產(chǎn)老人頭菌為原料，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)曲面法優(yōu)化其多糖的提取工藝，此外，采用體外清除DPPH自由基、ABTS+自由基及還原三價(jià)鐵離子3種方法評(píng)價(jià)了老人頭菌多糖提取物的抗氧化活性，將為老人頭菌在調(diào)味品領(lǐng)域的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與化學(xué)試劑

野生云南老人頭菌：購自云南玉溪市野生菌市場(chǎng)，曬干粉碎后過60目篩，干燥備用；葡萄糖、濃硫酸、苯酚：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀和三氯化鐵：西隴科學(xué)股份有限公司；DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)：美國(guó)Sigma公司；抗壞血酸：天津市雙船化學(xué)試劑廠；ABTS(2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽：成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇：四川西隴化工有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

分析天平 上海奧豪斯儀器有限公司；超聲清洗儀 上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司；721可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)處理方法

1.3.1 老人頭菌多糖的提取

準(zhǔn)確稱取0.5000 g老人頭菌粉末，采用水提醇沉法超聲提取，濾液中加入3倍體積的95%乙醇于4～8 ℃放置12 h醇沉，離心，得多糖沉淀，復(fù)溶定容到25 mL，得多糖溶液。

1.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精確稱取0.0500 g葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，溶解，定容至100 mL，移取10.00 mL定容至50 mL，加純水稀釋成0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.70，0.90 mL濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加蒸餾水到2.00 mL，加1.00 mL 5%的苯酚溶液，加5.0 mL濃硫酸，搖勻，放置30 min，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度值，平行3次，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為y=54.013x+0.0045，相關(guān)系數(shù)R2=0.9992，線性擬合程度較好。

1.3.3 多糖得率的測(cè)定

取老人頭菌多糖溶液0.10 mL，加純水到2.00 mL，再加入1.00 mL 5%的苯酚溶液，加5.00 mL濃硫酸，混勻，靜置30 min，在490 nm處測(cè)吸光值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算老人頭菌多糖提取率。

多糖提取率(%)=(C×V1×V2/V3×m)×100%。

(1)

式中：C為提取液中多糖的含量(mg/mL)；V1為比色液體積(mL)；V2為定容體積(mL)；V3為供試樣品體積(mL)；m為實(shí)驗(yàn)樣品質(zhì)量(mg)。

1.4 單因素實(shí)驗(yàn)

稱取0.5000 g樣品，分別在液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1，mL/g)、超聲時(shí)間(10，20，30，40，50 min)、超聲溫度(30，35，40，45，50，55 ℃)、超聲提取次數(shù)(1，2，3次)4種不同的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行多糖的提取，參照多糖提取率測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，平行3次，計(jì)算得率[5]。

1.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析

采用Box-Behnken方法進(jìn)行四因素三水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以老人頭菌多糖提取率為指標(biāo)，確定單因素中每個(gè)因素的最佳值后，進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 The response surface experiment design

1.6 抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.6.1 清除DPPH自由基能力的測(cè)定

取2.0 mL不同濃度的老人頭菌多糖溶液(0.1，0.3，0.5，0.7，0.9，1.1 mg/mL)于比色管中，加入2.00 mL無水乙醇，加入2.00 mL 0.02 mg/mL DPPH溶液，混勻，室溫避光靜置30 min，在517 nm處測(cè)定吸光度Ai[6]；以2.00 mL超純水替代0.02 mg/mL DPPH溶液，測(cè)吸光度Aj；以超純水替代多糖溶液測(cè)吸光度Ac，平行3次實(shí)驗(yàn)。用VC作陽性對(duì)照，計(jì)算DPPH自由基清除率，公式如下：

DPPH自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%。

(2)

1.6.2 清除ABTS+自由基能力的測(cè)定

取2.00 mL不同濃度的老人頭菌多糖溶液(0.075，0.1，0.125，0.15，0.175，0.2 mg/mL)于比色管中，加入3.00 mL ABTS+工作液，搖勻，室溫下避光放置6 min，在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)吸光度記為Ai，以3.00 mL無水乙醇替代ABTS+工作液測(cè)吸光度Aj，以2.00 mL無水乙醇替代多糖溶液測(cè)吸光度Ac，平行3次實(shí)驗(yàn)，以VC作陽性對(duì)照，計(jì)算ABTS+自由基清除率，公式如下：

ABTS+自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%。

(3)

1.6.3 還原Fe3+能力的測(cè)定

取2.00 mL不同濃度的老人頭菌多糖溶液(0.075，0.1，0.125，0.15，0.175，0.2 mg/mL)，加入2.00 mL pH 6.6的磷酸緩沖溶液，再加入2.00 mL 1%鐵氰化鉀溶液，50 ℃水浴反應(yīng)20 min，冷卻后加入2.00 mL 10%三氯乙酸溶液，搖勻，取2.00 mL溶液加入2.00 mL超純水，再加入0.5 mL 0.1% FeCl3溶液，放置8 min,在700 nm處測(cè)吸光度，平行3次實(shí)驗(yàn)，以VC作為陽性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 液料比的選擇

在超聲時(shí)間30 min、超聲溫度50 ℃、提取次數(shù)2次的條件下，研究不同液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1，mL/g)對(duì)老人頭菌多糖提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 液料比對(duì)多糖提取率的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on the extraction yield of polysaccharides

由圖1可知，當(dāng)液料比達(dá)到20∶1時(shí)，多糖得率達(dá)到最大，之后逐漸下降，其原因可能是水的用量較小時(shí)，老人頭菌中的多糖溶解不夠完全，從而得率較低；當(dāng)水的用量過大時(shí)，提取出來的其他雜質(zhì)的量隨之增加，降低了多糖得率[7-8]。故選擇液料比20∶1為最佳提取條件。

2.1.2 超聲時(shí)間的選擇

在液料比20∶1(mL/g)、超聲溫度50 ℃、提取次數(shù)2次的條件下，研究不同超聲時(shí)間(10，20，30，40，50 min)對(duì)老人頭菌多糖提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of polysaccharides

由圖2可知，超聲時(shí)間在10～30 min內(nèi)多糖得率逐步增加，30 min時(shí)達(dá)到峰值，之后多糖得率開始下降,可能是因?yàn)樘崛r(shí)間過短，多糖溶解不充分，但時(shí)間過長(zhǎng)則可能會(huì)使多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而使多糖得率降低。因此，最佳的超聲時(shí)間選擇30 min。

2.1.3 超聲溫度的選擇

在液料比20∶1(mL/g)、超聲時(shí)間30 min、提取次數(shù)2次的條件下，研究不同超聲溫度(30，35，40，45，50，55 ℃)對(duì)老人頭菌多糖提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 超聲溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the extraction yield of polysaccharides

由圖3可知，超聲溫度在30～50 ℃內(nèi)多糖提取率逐步增加，50 ℃時(shí)達(dá)到頂峰，之后多糖提取率下降，其原因可能是溫度較低時(shí)多糖提取不充分，而溫度過高會(huì)導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[9-10]。故最佳超聲溫度選擇50 ℃。

2.1.4 提取次數(shù)的選擇

在液料比20∶1(mL/g)、超聲時(shí)間30 min、超聲溫度50 ℃的條件下，研究老人頭菌提取1，2，3次對(duì)老人頭菌多糖提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction times on the extraction yield of polysaccharides

由圖4可知，當(dāng)提取次數(shù)為2次時(shí)其多糖提取率達(dá)到最高，2次之后提取率開始下降，可見超聲提取次數(shù)對(duì)老人頭菌多糖提取率有著很大的影響。因此，最佳提取次數(shù)為2次。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

根據(jù)表1中的四因素三水平，生成29組實(shí)驗(yàn)，得到多糖提取率,結(jié)果見表2，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，得二次回歸方程為：Y=+2.66+0.0683A-0.0550B+0.0233C+0.0717D-0.0125AB-0.0025AC+0.0100AD-0.0425BC+0.0100BD+0.0150CD-0.2464A2-0.3814B2-0.04539C2-0.4262D2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 The response surface optimization scheme and test results

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for the response surface quadratic model

續(xù) 表

由表3可知，模型的P<0.0001，非常顯著，而失擬殘差項(xiàng)的P=0.1488>0.05為不顯著[11-12]，因此，該模型能用于老人頭菌多糖提取的預(yù)測(cè)。在一次項(xiàng)A、B、C、D 4個(gè)影響因素中，D因素的F值最大，影響極顯著，A、B、C次之，在二次項(xiàng)中C2極顯著，A2、B2、D2顯著。

2.2.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖越陡峭則顯示該因素對(duì)其影響越明顯，反之，越平坦則影響越不明顯[13-14]，見圖5～圖8。

圖5 液料比和超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour diagram of effects of liquid-solid ratio and ultrasonic time on the extraction yield of polysaccharides

圖6 液料比和超聲溫度對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface plot and contour diagram of effects of liquid-solid ratio and ultrasonic temperature on the extraction yield of polysaccharides

圖7 液料比和超聲提取次數(shù)對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface plot and contour diagram of effects of liquid-solid ratio and ultrasonic extraction times on the extraction yield of polysaccharides

圖8 超聲時(shí)間和超聲提取次數(shù)對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 Response surface plot and contour diagram of effects of ultrasonic time and ultrasonic extraction times on the extraction yield of polysaccharides

由圖5可知，超聲時(shí)間變化曲面比液料比變化曲面陡峭，說明超聲時(shí)間對(duì)老人頭菌多糖提取率的影響更大；等高線呈橢圓形表明二者交互作用顯著。由圖6可知，液料比變化曲面比超聲溫度變化曲面平緩，說明液料比對(duì)老人頭菌多糖提取率的影響較小。由圖7可知，超聲提取次數(shù)變化曲面比液料比變化曲面陡峭，說明提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響較大。

2.2.3 優(yōu)化與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

依據(jù)以上響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃徒Y(jié)果，將多糖提取參數(shù)確定為：液料比20.701∶1(mL/g),超聲時(shí)間29.243 min，超聲溫度50.151 ℃，超聲提取次數(shù)2.086次；該實(shí)驗(yàn)參數(shù)下老人頭菌多糖提取率為2.672%。應(yīng)用至實(shí)際中，調(diào)整實(shí)驗(yàn)參數(shù)為：液料比21∶1(mL/g)，超聲時(shí)間29 min，超聲溫度50 ℃，超聲提取次數(shù)2次，老人頭菌多糖得率為2.625%。

2.3 老人頭菌多糖提取物體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

2.3.1 DPPH自由基的清除能力

由圖9可知，老人頭菌多糖提取物和抗壞血酸對(duì)DPPH自由基的清除效果均隨著濃度的升高而升高，當(dāng)老人頭菌多糖濃度為1.3 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到94.22%。

圖9 不同濃度老人頭菌多糖提取物與抗壞血酸對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.9 The scavenging activity of polysaccharide extracts fromCatathelasma ventricosum and ascorbic acids with different concentrations on DPPH free radicals

2.3.2 ABTS+自由基的清除能力

圖10 不同濃度老人頭菌多糖提取物與抗壞血酸對(duì)ABTS+自由基的清除能力Fig.10 The scavenging activity of polysaccharide extracts fromCatathelasma ventricosum and ascorbic acids with different concentrations on ABTS+ free radicals

由圖10可知，老人頭菌多糖提取物和抗壞血酸均能較好地清除ABTS+自由基，且兩者的清除效果隨著濃度的升高而增強(qiáng)，當(dāng)其多糖濃度為0.2 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到90.29%。

2.3.3 還原Fe3+能力分析

圖11 不同濃度老人頭菌多糖提取物與抗壞血酸還原Fe3+能力Fig.11 The reducing activity of polysaccharide extracts from Catathelasma ventricosum and ascorbic acids with different concentrations on Fe3+

由圖11可知，隨著老人頭菌多糖濃度的升高，吸光度不斷增大，即還原力增強(qiáng)。老人頭菌多糖與VC陽性對(duì)照，老人頭菌多糖的總還原能力弱于VC。

3 結(jié)論

利用超聲波提取老人頭菌中的多糖，采取四因素三水平響應(yīng)面分析方法探討了4個(gè)因素對(duì)其多糖提取率的影響，得到老人頭菌中多糖最佳條件為：液料比21∶1(mL/g)，超聲時(shí)間29 min，超聲溫度50 ℃，提取次數(shù)2次。此外，研究了老人頭菌多糖的抗氧化活性，隨著其濃度的增加，其對(duì)DPPH、ABTS+自由基的清除作用增強(qiáng)，對(duì)Fe3+的還原能力也增強(qiáng)。