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    一株傳統(tǒng)牦牛酸乳源醋酸桿菌鑒定及產(chǎn)酸條件優(yōu)化

    2022-06-05 02:21:46李咪咪龍虎陳煉紅
    中國調(diào)味品 2022年6期
    關(guān)鍵詞:產(chǎn)酸量產(chǎn)酸醋酸

    李咪咪,龍虎,陳煉紅

    (西南民族大學 食品科學與技術(shù)學院,成都 610041)

    牦牛乳營養(yǎng)價值高,乳中含有豐富的脂肪、蛋白質(zhì)、非脂乳固體、礦物質(zhì)等,其含量均比其他牛乳高[1]。牦牛乳發(fā)酵制得的牦牛酸乳因其特有的風味而受到歡迎,酸乳中富含乳酸、氨基酸、不飽和脂肪酸等物質(zhì),具有調(diào)節(jié)人體腸道菌群、促進腸道蠕動、調(diào)節(jié)血壓、降低膽固醇等功能[2]。酸乳中的微生物具有多樣性,其中以乳酸菌為優(yōu)勢菌群,同時還存在酵母菌和醋酸桿菌,丁武蓉[3]、張和平[4]均在自然發(fā)酵乳制品的研究中發(fā)現(xiàn)并分離得到醋酸桿菌。

    醋酸菌(acetic acid bacteria)是食醋發(fā)酵生產(chǎn)過程中的主要產(chǎn)酸菌,是一種革蘭氏陰性細菌,能夠?qū)⒁掖佳趸梢宜?,該菌最初來源于傳統(tǒng)發(fā)酵釀醋中[5-6]。若使醋酸菌生長繁殖良好,除了提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)即六大營養(yǎng)素之外,還要提供合適的培養(yǎng)條件,如培養(yǎng)溫度、乙醇濃度和pH等[7-8],改變這些培養(yǎng)條件,會導致醋酸菌發(fā)生變形甚至死亡。利用菌株形態(tài)觀察和生理生化特性的鑒定方法不能準確地鑒定醋酸菌,其原因是醋酸菌各種屬間菌株的菌落形態(tài)和生理生化特性區(qū)別較不明顯,因此若要準確鑒定醋酸菌到菌種,還需對菌株進行基因測序相結(jié)合。

    本研究以從牦牛乳中分離得到的一株疑似醋酸菌的菌株為試驗材料,根據(jù)其形成菌膜的特性,通過形態(tài)學觀察、生理生化特征鑒定和16S rRNA序列分析方法,鑒定其歸屬。再對其培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,以乙醇濃度、培養(yǎng)溫度、pH值和培養(yǎng)基為影響因素,利用正交試驗尋找該菌株最佳的產(chǎn)酸培養(yǎng)條件,為新醋研發(fā)提供了理論支持。

    1 材料與方法

    1.1 菌種和培養(yǎng)基

    1.1.1 菌株來源

    從高原牦牛乳中分離出一株菌,編號CS-63,保存于西南民族大學生命科學與技術(shù)學院102實驗室。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    1.1.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

    1%酵母浸提物、1%葡萄糖、0.05% MgSO4、0.01% ZnSO4、0.1% K2HPO4。

    1.1.2.2 YPG培養(yǎng)基

    0.5%酵母浸提物、0.3%葡萄糖、0.2%蛋白胨、pH 6.8。

    1.1.2.3 發(fā)酵液體培養(yǎng)基

    1%酵母浸提物、1%葡萄糖、0.3%蛋白胨。

    1.1.2.4 平板培養(yǎng)基

    1%酵母浸提物、1%葡萄糖、1%碳酸鈣、2%瓊脂、pH 4.5,使用前加3%無水乙醇。

    1.2 常用試劑與儀器

    NaOH、HCl、酚酞試劑、無水乙醇、FeCl3:成都康迪生物技術(shù)有限公司。

    PL-303型分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;SW-CJ-IF型單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;UV-6100型分光光度計 上海美譜達公司;凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司;TC-512 PCR型擴增儀 英國Techne公司;804R型冷凍離心機 德國Eppendorf公司;LX-B35L型高壓滅菌鍋 深圳市佳博特實驗設(shè)備有限公司。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 醋酸菌菌落形態(tài)觀察

    在無菌條件下,取1 mL樣品在9 mL質(zhì)量分數(shù)為0.9%的NaCl溶液中稀釋10倍,充分混勻,以10倍稀釋法對其進行梯度稀釋。待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右,向直徑9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)倒入20~25 mL,待冷凝后,吸取1 mL的 10-5,10-6,10-7稀釋液涂布于無菌培養(yǎng)皿中,倒置于30~37 ℃溫箱內(nèi),使之干燥以便于單菌落的出現(xiàn)。取單菌落,在上述無冷凝水的平板一側(cè)邊緣處,涂抹在直徑約為1 cm大小的面積上;反復操作以劃滿整個平板為宜,倒置平板,于30 ℃培養(yǎng)1~2 d,出現(xiàn)單菌落。觀察其菌落形態(tài),記錄包括形狀、大小、表面、隆起形狀、菌落及培養(yǎng)基的顏色等指標。

    1.3.2 醋酸菌理化鑒定

    將菌株CS-63在YPG培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后,對菌株進行革蘭氏染色試驗、接觸酶試驗、乙醇氧化試驗、氧化酶試驗、淀粉水解試驗及葡萄糖氧化試驗,具體操作方法參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》及《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9-10]。

    產(chǎn)酸定性試驗:檢測方法參照李素燕的測定方法[11]。

    1.3.3 醋酸菌的16S rRNA鑒定

    1.3.3.1 醋酸菌基因組DNA的提取

    采用天根生化細菌基因組DNA提取試劑盒提取單個菌株的基因組DNA。提取的基因組DNA可用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測純度和濃度。

    1.3.3.2 醋酸菌16S rRNA基因的PCR擴增

    PCR擴增16S rRNA基因引物為細菌通用引物FA-27F(5′-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)與RA-1495R(5′-AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)。

    16S rRNA基因的PCR反應(yīng)條件:預變性94 ℃,5 min;變性94 ℃,1 min;退火58 ℃,1 min;延伸72 ℃,2 min;循環(huán)30次,末端延伸72 ℃,10 min;4 ℃保溫。

    1.3.3.3 16S rRNA PCR產(chǎn)物測序分析

    擴增結(jié)束后,取約5 μL的PCR擴增產(chǎn)物加1 μL 6×Loading Buffer,使用質(zhì)量分數(shù)為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,電壓5 V/cm,電泳液為1×TAE。如果擴增條帶在1500 bp處清晰并且沒有拖尾、彌散現(xiàn)象,說明PCR擴增成功。將PCR 擴增產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司成都測序部進行雙向測序。

    1.3.3.4 16S rRNA基因同源性比對

    使用DNA Star 5.01 軟件中的SeqMan模塊對測序得到的兩條16S rRNA基因序列進行整理、拼接、校準,得到1450 bp左右的有效序列。然后將拼接后的序列運用NCBI(National Center for Biotechnology Information)中的同源性比對工具BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)將所得測序結(jié)果與GenBank上已知地位的醋酸菌株進行對比,并結(jié)合形態(tài)學特征確定待測菌株種屬。

    1.3.3.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

    將與菌株CS-63對應(yīng)的16S rRNA基因序列從GenBank中下載下來,然后運用Clustal W多重比對得到菌株間的同源性相似百分比。再使用MEGA 5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,通過鄰接法(Neighbor-Joining)進行系統(tǒng)發(fā)育分析,并進行1000次重復的Boot-straps統(tǒng)計檢驗。

    1.3.4 醋酸菌培養(yǎng)條件優(yōu)化

    1.3.4.1 不同培養(yǎng)基對菌株產(chǎn)酸量的影響

    配制好培養(yǎng)基,在121 ℃下滅菌15 min,冷卻后將菌株分別接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和YPG培養(yǎng)基中,于30 ℃下靜置培養(yǎng)5 d,取2 mL發(fā)酵液,測定產(chǎn)酸量,每組設(shè)置3個平行。

    醋酸菌株產(chǎn)酸量的測定與計算:檢測方法參照李文等的測定方法[12]。

    1.3.4.2 不同乙醇濃度對菌株產(chǎn)酸量的影響

    將發(fā)酵培養(yǎng)基在121 ℃下滅菌15 min,無菌條件下冷卻到室溫,向培養(yǎng)基中加入無水乙醇,使培養(yǎng)基乙醇的終濃度為 3%、4%、5%、6%、7%,將菌株CS-63分別接種于不同乙醇濃度的培養(yǎng)基中,每個乙醇濃度設(shè)定3組平行試驗,在30 ℃下靜置培養(yǎng) 5 d,取2 mL發(fā)酵液,測定產(chǎn)酸量。

    1.3.4.3 不同培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酸量的影響

    設(shè)定培養(yǎng)溫度梯度分別為 4,25,30,37,41 ℃,其他條件不變,靜置培養(yǎng)5 d,每個溫度設(shè)定3組平行,取2 mL發(fā)酵液,測定產(chǎn)酸量。

    1.3.4.4 不同pH對菌株產(chǎn)酸量的影響

    用0.1 mol/L NaOH溶液和0.1 mol/L HCl溶液將培養(yǎng)基的pH分別調(diào)成3,4.5,5.5,6.5,7.5,其他條件不變,在30 ℃條件下靜置培養(yǎng)5 d,取2 mL發(fā)酵液,測定產(chǎn)酸量,每個pH設(shè)置3組平行。

    1.3.4.5 正交試驗分析表

    在上述單因素試驗的基礎(chǔ)上,將培養(yǎng)基、pH、溫度和乙醇濃度設(shè)為試驗因素,利用L9(34)正交試驗,根據(jù)菌株產(chǎn)酸量的多少,分析各因素對醋酸產(chǎn)量的影響,優(yōu)化菌株CS-63的培養(yǎng)條件。正交試驗因素水平表見表1。

    表1 正交試驗因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal test

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌珠的鑒定

    2.1.1 理化鑒定

    菌株CS-63的生理生化試驗結(jié)果見表2。

    表2 醋酸菌理化鑒定結(jié)果Table 2 The physicochemical identification results of Acetobacter

    由表2可知,菌株CS-63革蘭氏染色為陰性,能夠產(chǎn)酸,能夠利用乙醇;氧化酶、接觸酶和葡萄糖氧化試驗為陽性,不能使淀粉水解,由此初步鑒定結(jié)果可以判定其為醋酸桿菌屬。

    2.1.2 16S rRNA鑒定

    2.1.2.1 菌種DNA提取及16S rRNA擴增結(jié)果

    DNA濃度和OD260/280的測定:純DNA樣品的OD260/280值在1.8~2.0之間。經(jīng)過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測見圖1。

    圖1 PCR反應(yīng)結(jié)果圖Fig.1 PCR reaction results

    由圖1可知,疑似醋酸菌菌株的PCR擴增后在大約1500 bp處有一條清晰明亮的條帶,并且沒有彌散現(xiàn)象和明顯非特異擴增現(xiàn)象,說明菌株的16S rRNA基因擴增產(chǎn)物可以滿足測序的要求。

    2.1.2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建與分析

    為了鑒定待測菌株,通過BLAST在NCBI中分析所有待測菌株的16S rRNA基因的核苷酸序列,以與模式菌株序列同源性大于99%為種的鑒定閾值,通過MEGA 5.2構(gòu)建醋酸菌模式株和分離株系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究和系統(tǒng)進化樹,見圖2和圖3。

    圖2 菌株CS-63同源性分析Fig.2 Homology analysis of CS-63 strain

    圖3 菌株CS-63系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of CS-63 strain

    通過序列對比、系統(tǒng)發(fā)育樹及同源性分析發(fā)現(xiàn),菌株CS-63與模式菌株Acetobactersyzygii(HM217935.1/HM218259.1)聚為一類,且同源性達到99.9%,與它們親緣關(guān)系最近,因此可以將菌株CS-63歸為蒲桃醋酸桿菌(Acetobactersyzygii)。

    2.2 醋酸菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

    2.2.1 不同培養(yǎng)基對菌株產(chǎn)酸量的影響

    圖4 不同培養(yǎng)基對菌株產(chǎn)酸量的影響Fig.4 Effects of different culture media on the acid yield of the strain

    由圖4可知,YPG培養(yǎng)基中產(chǎn)量最低,為0.45 g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基中都含有酵母浸提物和葡萄糖兩種共同成分,且比例相同,但發(fā)酵培養(yǎng)基中含有蛋白胨,而基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不含有,由此可推測發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨對該菌株的產(chǎn)酸可能具有促進作用;YPG培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基含有共同的成分:酵母浸提物、葡萄糖和蛋白胨,但這3種營養(yǎng)物質(zhì)的比例不同,在發(fā)酵培養(yǎng)基中這3種物質(zhì)的比例是10∶10∶3,在YPG培養(yǎng)基中的比例是5∶3∶2,由此可推測培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的比例不同也可能影響菌株CS-63的產(chǎn)酸特性。

    2.2.2 不同乙醇濃度對產(chǎn)酸量的影響

    圖5 不同乙醇濃度對菌株產(chǎn)酸量的影響Fig.5 Effects of different ethanol concentrations on the acid yield of the strain

    由圖5可知,隨著乙醇濃度的增大,菌株CS-63的產(chǎn)酸量呈先上升后下降的趨勢。菌株在乙醇體積分數(shù)為起始濃度3%時,醋酸菌產(chǎn)酸量為3.45 g/L;當乙醇濃度增大到4%時,菌株產(chǎn)酸量達到峰值,為4.65 g/L;當培養(yǎng)基的乙醇濃度達到5%后菌株產(chǎn)酸量開始下降,當乙醇體積分數(shù)達到6%時產(chǎn)酸量下降明顯,這可能是由于酒精有抑制細菌生長的作用,無水乙醇含量過高會抑制醋酸菌的繁殖代謝,導致菌株CS-63產(chǎn)酸量下降,因此菌株CS-63產(chǎn)酸的最佳乙醇體積分數(shù)為4%。譚才鄧等[13]、孫萬里[14]對腐爛水果中醋酸菌的產(chǎn)酸量進行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當乙醇濃度為4%時菌株產(chǎn)酸量最大,與本研究結(jié)論一致;李華敏等[15]對蘋果醋中醋酸菌的產(chǎn)酸量進行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株產(chǎn)酸的最佳乙醇濃度為6%,與本研究的結(jié)論有所出入,這可能是由于不同的菌株生長有不同的營養(yǎng)需求。

    2.2.3 不同培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酸量的影響

    圖6 不同培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酸量的影響Fig.6 Effects of different culture temperatures on the acid yield of the strain

    由圖6可知,菌株CS-63的產(chǎn)酸量隨著溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。該菌株在4 ℃時幾乎不產(chǎn)酸,這可能是由于在該溫度下,醋酸菌幾乎不能生長;在30 ℃時產(chǎn)酸量達到峰值,為2.48 g/L;當溫度超過30 ℃,產(chǎn)酸量出現(xiàn)下降趨勢;當溫度升高到41 ℃時,產(chǎn)酸量只有0.75 g/L,這可能是由于過高的溫度抑制了醋酸菌的生長,且高溫也會對酶的活性產(chǎn)生影響,因此可得知該菌株產(chǎn)酸的最佳溫度是30 ℃。武斌等[16]研究了巴氏醋桿菌在不同溫度下的產(chǎn)酸特性,結(jié)果表明30 ℃是該菌株的最適培養(yǎng)溫度;盧夢瑤等[17]研究了酵素中醋酸菌對不同溫度的適應(yīng)性,結(jié)果表明在30 ℃時產(chǎn)酸量最高,均與本研究結(jié)論相一致。

    2.2.4 不同pH值對產(chǎn)酸量的影響

    圖7 不同pH對菌株產(chǎn)酸量的影響Fig.7 Effects of different pH values on the acid yield of the strain

    由圖7可知,菌株CS-63的產(chǎn)酸量隨著pH的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,pH為3時產(chǎn)酸量最少,為2.55 g/L;當pH升高到5.5時,產(chǎn)酸量達到峰值,為18.45 g/L;當pH達到6.5后,產(chǎn)酸量急劇下降,當pH繼續(xù)升高達到7.5時,產(chǎn)酸量只有7.95 g/L。該菌株在pH過高或過低時產(chǎn)酸量均很低,說明該菌株在過酸、過堿環(huán)境下不宜生長繁殖和代謝,且機體中的大多數(shù)反應(yīng)與酶有關(guān),過酸、過堿都會導致酶活力降低,從而導致產(chǎn)酸速率和產(chǎn)酸量下降,由此可知菌株CS-63產(chǎn)酸的最佳pH為5.5.劉曉棟等[18]研究了醋酸菌As1.41在不同pH條件下的最高產(chǎn)酸量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當pH為5.5時菌株產(chǎn)酸量達到最大,均與本研究結(jié)論相一致。

    2.3 正交試驗結(jié)果分析

    表3 以醋酸菌產(chǎn)量為檢測指標的正交試驗結(jié)果表Table 3 The orthogonal test results with acetic bacteria yield as the detection index

    由表3可知,各因素影響菌株CS-63產(chǎn)酸的主次順序為pH>乙醇濃度>培養(yǎng)基>培養(yǎng)溫度,得出最佳工藝條件為A3B1C1D3。由正交表得到的最佳工藝參數(shù)為A3B1C1D3,與試驗中產(chǎn)酸量最高的第7組A3B1C2D3不相符,因此需要驗證試驗A3B1C1D3和A3B1C2D3。

    驗證試驗結(jié)果:組合A3B1C1D3的產(chǎn)酸量為15.4 g/L,組合A3B1C2D3的產(chǎn)酸量為14.7 g/L,即A3B1C1D3組優(yōu)于A3B1C2D3組。因此可得醋酸菌CS-63的最佳產(chǎn)酸條件為:25 ℃下在乙醇濃度為5%,pH 4.5的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

    3 結(jié)論

    本研究以菌株CS-63為對象,采用生理生化特征與16S rRNA保守序列分析相結(jié)合的方法對其進行鑒定,最終確定其為蒲桃醋酸桿菌(Acetobactersyzygii);對該菌株的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,分別研究了菌株CS-63在不同培養(yǎng)基、乙醇濃度、培養(yǎng)溫度和pH下的產(chǎn)酸量,并以不同培養(yǎng)基、乙醇濃度、培養(yǎng)溫度和pH為試驗因素進行正交分析,最終得出該菌株的最佳產(chǎn)酸培養(yǎng)條件為:25 ℃下在乙醇濃度為5%,pH 4.5的發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖1%,蛋白胨0.3%,酵母提取物1%)中培養(yǎng)。

    目前對蒲桃醋酸桿菌的研究鮮少,本文對該菌株的鑒定及最適產(chǎn)酸條件的研究,可為后續(xù)該菌株在實際應(yīng)用中提供數(shù)據(jù)支撐,同時也為工藝上采用純菌發(fā)酵奠定基礎(chǔ),但本研究只選取了4個影響因素來研究該菌株的產(chǎn)酸特性,具有一定局限性,為更好地將其應(yīng)用到實際生活中,日后還可對該菌株進行更加全面的研究,探索其他影響因素對其生長繁殖和產(chǎn)酸的影響,比如接種量、不同碳源、初始乙酸濃度、礦化度等;或研究該菌株的酒精轉(zhuǎn)換率、遺傳穩(wěn)定性等;或經(jīng)誘變得到耐高溫、耐高乙醇、耐高乙酸的菌種。

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