巨石斑魚與斜帶石斑魚線粒體基因組測序及物種有效性分析

梁日深, 楊杰鑾, 謝瑞琳, 陳厚樺, 李江濤, 秦真東, 林 蠡, 李清清

(1. 仲愷農業(yè)工程學院動物科技學院， 廣東 廣州 510225； 2. 廣東省水環(huán)境與水產品安全工程技術研究中心， 廣東 廣州 510225；3. 廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點實驗室， 廣東 廣州 510225； 4. 廣州市水產病害與水禽養(yǎng)殖重點實驗室， 廣東 廣州 510225)

魚類線粒體基因組(Mitochondrial DNA，mtDNA)與其他脊椎動物相似，為閉合環(huán)狀的雙鏈DNA分子，由重鏈(H鏈)和輕鏈(L鏈)組成，能進行自我復制、轉錄和翻譯[1]。目前已報道的魚類線粒體基因組大多編碼37個基因(包括13個蛋白編碼基因、22個tRNA基因、2個rRNA基因)以及一個非編碼控制區(qū)(D-loop區(qū))[2]。與核基因相比，線粒體基因組具有母系遺傳、進化速度快、結構簡單等特點，成為生物種群遺傳、系統(tǒng)演化等方面研究的重要分子標記[3]，廣泛應用于魚類物種起源、分子系統(tǒng)進化、遺傳多樣性和物種分子鑒定等領域的研究分析。

巨石斑魚(Epinephelustauvina)與斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)隸屬于硬骨魚綱(Actinopterygii)鱸形目(Perciformes)鮨科(Serranidae)石斑魚屬(Epinephelus)，主要分布于熱帶印度洋和太平洋近海，我國見于南海諸島和臺灣海域[4-6]。形態(tài)上，巨石斑魚在個體發(fā)育過程中，體色斑紋與多種石斑魚存在趨同現(xiàn)象，特別是與斜帶石斑魚，兩者在體色、體形、斑紋等特征非常相似，表現(xiàn)為身體較修長，體表呈棕黑或棕黃色，身體與各鰭覆有許多橙紅色或紅棕色圓斑，尾鰭圓形等，利用形態(tài)學分類的方法不易將二者清晰區(qū)分。在養(yǎng)殖生產中，兩者曾相互混淆，俗稱“青斑”[7]。形態(tài)分類學上也有不少研究將斜帶石斑魚誤認為是巨石斑魚的情況。如Ben-Tuvia曾指出地中海中有關巨石斑魚的洄游研究報道，其物種應該是斜帶石斑魚[8-9]。Sachithanandam等[10]分析了安達曼海巨石斑魚及斜帶石斑魚群體樣品，指出安達曼海及附近海域分布的巨石斑魚其實是斜帶石斑魚的誤鑒。Tan等[11]也指出中國南海及安達曼海魚類分類資料中，巨石斑魚與斜帶石斑魚存在誤鑒情況。在分子系統(tǒng)進化研究上，也出現(xiàn)巨石斑魚與斜帶石斑魚分類地位存在爭議的情況。如在朱世華利用Cytb基因構建的石斑魚屬系統(tǒng)進化樹上，巨石斑魚與斜帶石斑魚的親緣關系十分接近，兩者聚為一支，序列差異率只有1%[12]；周佳怡對中國沿海石斑魚亞科魚類DNA條形碼分析也得到相似結果，兩種魚的遺傳距離小于0.020[13]。而Craig等[14]綜合線粒體基因與核基因對石斑魚亞科魚類分子系統(tǒng)進化研究，發(fā)現(xiàn)巨石斑魚與斜帶石斑魚在進化樹上的聚類位置相距較遠，兩者位于不同分支。Schoelinck等[15]、Ma等[16]在石斑魚亞科分子系統(tǒng)學研究中也認為兩者親緣關系相對較遠。在GenBank數(shù)據(jù)庫中，也有部分上傳的巨石斑魚COⅠ基因序列與斜帶石斑魚序列相似性為99%以上的情況。至于兩者親緣關系是否十分接近，還是可能存在物種誤鑒，需要對更多的基因序列信息進行比較分析才能進一步驗證。目前有關巨石斑魚線粒體基因組全長信息暫未公布，本研究通過測定巨石斑魚與斜帶石斑魚線粒體基因組全長信息，從分子水平比較巨石斑魚與斜帶石斑魚線粒體基因組的差異，結合形態(tài)特征數(shù)據(jù)分析，驗證巨石斑魚與斜帶石斑魚之間的物種有效性及親緣關系，厘清物種鑒定爭議問題。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究的巨石斑魚與斜帶石斑魚樣品主要采集于廣東深圳水產碼頭。根據(jù)《中國魚類系統(tǒng)檢索》[5]、《臺灣魚類志》[6]、《Goupers of the World》[17]等資料對樣品進行形態(tài)分類鑒定及詳細數(shù)據(jù)測量，樣品取肌肉于95%酒精中固定，用于基因組DNA提取。另外，從GenBank下載目前已測定上傳的其他石斑魚亞科魚類線粒體全長序列，用于后續(xù)系統(tǒng)進化樹的構建及分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 取約0.1 g的樣品肌肉組織，利用海洋動物總基因組DNA提取試劑盒(天根生化)，按照說明書操作進行提取，提取的基因組DNA用80 μL滅菌水溶解。采用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。同時每種DNA樣品各取1 μL于核酸測定儀進行濃度測定，并選擇OD260/OD280數(shù)值為1.8左右的DNA樣品用于后續(xù)實驗，確保提取的DNA濃度及純度滿足測序要求。

1.2.2 線粒體基因組序列擴增與測序 參考目前已經(jīng)公布的石斑魚線粒體基因組序列進行比對分析，在保守序列區(qū)設計可擴增覆蓋整個線粒體基因組的引物。引物信息見表1。PCR反應總體積為50 μL，其中PCR MasterMix混合液(TAKARA)25 μL，滅菌水21 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL。擴增條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，50～58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1～2 min，35～38個循環(huán)，最后72 ℃再延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，選取擴增成功的樣品，使用PCR產物純化試劑盒(天根生化)進行純化回收，送天一輝遠生物技術有限公司進行序列測定。

表1 巨石斑魚與斜帶石斑魚線粒體基因組擴增引物Table 1 Primers used for complete mitogenome amplication of E. tauvina and E. coioides

1.2.3 基因組序列測定及分析 測序所得序列利用DNA Star軟件進行比對、拼接與組裝，輔以人工分析調整，拼裝成完整全長序列。采用CGview軟件繪制線粒體基因組環(huán)狀結構圖。結合GenBank下載的石斑魚亞科魚類線粒體全長序列，利用Clustal X、MEGA7.0、MegAlign等軟件對蛋白質編碼基因、tRNA和rRNA進行識別與注釋，利用tRNAscan-SE Search Server軟件對tRNA二級結構進行預測。利用MEGA 7.0軟件分析巨石斑魚與斜帶石斑魚線粒體基因組堿基組成與變異、遺傳距離差異、密碼子使用偏好性等信息。利用Model-Test 2.1.5進行最佳進化模型預測， 使用RAxML 8.0軟件基于最大似然法(Maximum likelihood，ML)構建進化樹。

2 結果

2.1 巨石斑魚與斜帶石斑魚的形態(tài)特征比較

根據(jù)《中國魚類系統(tǒng)檢索》、《臺灣魚類志》、《Grou-pers of the world》等形態(tài)學分類資料中對巨石斑魚及斜帶石斑魚的描述，結合作者對本研究采集的巨石斑魚及斜帶石斑魚樣品的觀察比較，匯總出可區(qū)分巨石斑魚及斜帶石斑魚的形態(tài)學特征數(shù)據(jù)(見表2)，這些數(shù)據(jù)用于后續(xù)兩種石斑魚形態(tài)與分子水平結合比較分析。

表2 巨石斑魚與斜帶石斑魚形態(tài)特征區(qū)分表Table 2 Comparison analysis of morphological characteristics between E. tauvina and E. coioides

2.2 巨石斑魚和斜帶石斑魚線粒體基因組成與排列

巨石斑魚和斜帶石斑魚線粒體基因(mtDNA)全長分別為16 787 bp(GenBank登錄號：MW194890)和16 798 bp(GenBank登錄號：MW752082)，整體呈雙鏈環(huán)狀，由一條重鏈(H strand)與一條輕鏈(L strand)組成(見圖1)。與絕大多數(shù)脊椎動物線粒體基因組一樣，兩者mtDNA基因組包含37個基因(包括13個蛋白編碼基因、22個tRNA基因和2個rRNA基因)和1個D-loop非編碼控制區(qū)(見表3)。其中L鏈上有9個基因，包括tRNA-Gln、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Tyr、tRNA-Ser(TGA)、tRNA-Glu、tRNA-Pro和ND6，剩余的28個基因均位于H鏈上。兩種石斑魚大部分基因序列長度及間隔重復情況一致，少數(shù)基因存在差異(見表3)。

表3 巨石斑魚與斜帶石斑魚線粒體基因組結構組成Table 3 Main structures of complete mitogenome in E. tauvina and E. coioides

圖1 巨石斑魚與斜帶石斑魚線粒體基因組結構圖Fig.1 Mitogenome map of E. tauvina and E. coioides

巨石斑魚和斜帶石斑魚的線粒體基因組中均存在11處間隔區(qū)，間隔長度分別為75和78 bp，其中最大間隔出現(xiàn)在tRNA-Asn和tRNA-Cys這二者之間，分別為43和41 bp。此外，兩者基因組中相鄰基因還存在重疊現(xiàn)象(巨石斑魚8處，斜帶石斑魚6處)，即tRNA-Ile與tRNA-Gln(1 bp)，ATPase8與ATPase6(10 bp)，ATPase6與COⅢ(1 bp)，ND4L與ND4(7 bp)，ND5與ND6(4 bp)，tRNA-Thr與tRNA-Pro(2 bp、1 bp)，前者在16SrRNA與tRNA-Leu(TAA，3 bp)，tRNA-Cys與tRNA-Tyr(1 bp)間也存在重復，其中最大重疊區(qū)域在ATPase8和ATPase6之間。其余基因對排列緊密，無間隔與重疊情況。

兩種石斑魚線粒體基因組的核苷酸組成如表4所示，其中巨石斑魚堿基含量為：A：4 853個(28.91%)、G：2 708個(16.13%)、C：4 846個(28.87%)、T：4 380個(26.09%)，A+T=55.00%，C+G=45.00%。斜帶石斑魚mtDNA全長為16 798 bp，其堿基含量為：A：4 779個(28.45%)、G：2 773個(16.51%)、C：4 664個(27.76%)、T：4 582個(27.28%)，A+T=55.73%，C+G=44.27%。兩種石斑魚的堿基組成A+T>C+G，并表現(xiàn)出明顯的反G偏倚。

表4 巨石斑魚與斜帶石斑魚線粒體基因組的核苷酸組成Table 4 Base composition of complete mitogenomes in E. tauvina and E. coioides

2.3 蛋白質編碼基因分析

巨石斑魚與斜帶石斑魚線粒體基因組13個蛋白編碼基因總長度均為11 428 bp，占線粒體全長的68.1%和68.0%。除了ND6基因以外，兩種石斑魚蛋白編碼基因均位于H鏈上。起始密碼子除了COⅠ基因(GTG)、ATPase6基因(巨石斑魚為TTG，斜帶石斑魚為CTG)外，其他蛋白編碼基因起始密碼子均為ATG。終止密碼子除ND5、ND6基因(巨石斑魚為TAG，斜帶石斑魚為TAA)，兩種石斑魚的其余基因均以TAA(ND1、COⅠ、ATPase8、ATPase6、ND4L)、不完全終止密碼子TA(COⅢ)或T(ND2、COⅡ、ND3、ND4、Cytb)這3種魚類mtDNA中常見終止密碼子組成。兩種石斑魚相對同義密碼子使用情況(RSCU)如圖2所示。除去起始和終止密碼子，巨石斑魚和斜帶石斑魚的密碼子使用數(shù)分別為3 767和3 787個。其中，在密碼子第三位中，巨石斑魚C的使用頻率最高(1 355個)，斜帶石斑魚則是A的使用頻率最高(1 257個)，AT使用頻率均高于GC。兩種石斑魚密碼子使用分析情況如圖3所示，亮氨酸1(Leu1)的使用率最高(14.50%和14.23%)，其次為異亮氨酸(Ile)(9.48%和9.37%)，半胱氨酸(Cys)的使用率最低，分別為0.72%和0.77%。

(每種氨基酸對應的左側柱狀圖為巨石斑魚，右側柱狀圖為斜帶石斑魚。For each amino acid, the histogram on the left represent E. tauvina, the histogram on the right represent E. coioides.)圖2 巨石斑魚和斜帶石斑魚線粒體基因組的同義密碼子使用情況Fig.2 Relative synonymous codon usage (RSCU) of the mitogenome in E. tauvina and E. coioides

(每種氨基酸對應的左側柱狀圖為巨石斑魚，右側柱狀圖為斜帶石斑魚。For each amino acid, the histogram on the left represent E. tauvina, the histogram on the right represent E. coioides.)圖3 巨石斑魚和斜帶石斑魚線粒體基因組的氨基酸組成Fig.3 Amino acid composition of the mitogenome in E. tauvina and E. coioides

2.4 rRNA和tRNA基因分析

巨石斑魚與斜帶石斑魚rRNA基因由12SrRNA和16SrRNA組成，均位于tRNA-Phe和tRNA-Leu(TAA)基因之間，中間由tRNA-Val基因隔開。其中12SrRNA堿基長度分別為956和953 bp，16SrRNA長度分別為1 711和1 707 bp。與其他基因相比，兩種石斑魚的rRNA堿基組成并沒有明顯的反G偏倚現(xiàn)象，G含量(20.66%、20.98%)與T含量(21.67%、21.65%)相差不大，A含量相對較多。

巨石斑魚與斜帶石斑魚22個tRNA基因大小范圍在67～76 bp之間，總長度為1 566和1 558 bp。除tRNA-Val、tRNA-Cys、tRNA-Asp、tRNA-His、tRNA-Ser(GCT)、tRNA-Glu、tRNA-Thr外，其余tRNA基因長度在兩種石斑魚中均相同。其中位于L鏈的基因有8個，位于H鏈的基因有14個。利用tRNAscan-SE軟件對兩種石斑魚22個tRNA二級結構進行預測，結果顯示兩者中均有21個tRNA基因能形成典型的三葉草形結構，包括7對堿基組成的受體臂(氨基酸臂)，5對堿基組成的TψC臂，5對堿基組成的反密碼臂及3～4對堿基組成的DHU臂，而兩者的tRNA-Ser(GCT)基因的二級結構均缺少DHU臂。

2.5 控制區(qū)及WANCY區(qū)域

與大部分硬骨魚類相似，巨石斑魚與斜帶石斑魚的線粒體基因組中也存在輕鏈復制起始區(qū)(Origin of light strand replication，OL)，位于5個tRNA基因簇(WANCY區(qū)域)中的tRNA-Asn與tRNA-Cys之間，其中巨石斑魚OL序列由43個堿基組成(5’-TCCCCCGCCTAACTCTTATTGAGTTTGAGTAGGC GGGGGAAGT-3’)，而斜帶石斑魚由41個堿基組成(5’-TCCTCCGCCTACTATTTATGTTTAAATAGGCGGAGGAAAGC-3’)，均能折疊成穩(wěn)定的莖環(huán)二級結構，其保守結構為5’-GGCGG-3’。兩種石斑魚的控制區(qū)(D-loop區(qū))均位于tRNA-Pro和tRNA-Phe基因間，長度分別為1 080和1 098 bp，不參與基因編碼，而是調節(jié)mtDNA的復制和轉錄的片段。此序列顯示出極大的AT偏好性，A+T含量為66.57%(巨石斑魚)和69.03%(斜帶石斑魚)，G+C含量僅為33.43%(巨石斑魚)和30.97%(斜帶石斑魚)。

2.6 巨石斑魚和斜帶石斑魚物種間線粒體基因組序列比較分析

利用MEGA7.0軟件對巨石斑魚與斜帶石斑魚的序列進行比較分析，分析序列包括全基因組序列和常用于分子系統(tǒng)進化、親緣關系研究的分子標記序列(13個蛋白編碼基因、2個rRNA基因和D-loop區(qū))，結果如表5所示，其中13個編碼蛋白基因都統(tǒng)一去掉終止密碼子。從表5可知，巨石斑魚與斜帶石斑魚線粒體全長分別為16 787和16 798 bp，兩基因組之間相差11個堿基?；贙imura-2-Parameter模型計算兩線粒體基因組遺傳距離為0.150，基因組存在較大差異。在13個蛋白質編碼基因、2個rRNA基因及D-loop區(qū)這16個分子標記序列中堿基差異在24～322 bp之間，遺傳距離差異為0.059～0.406。其中，兩種石斑魚的D-loop區(qū)差異最大，在約1 000 bp的序列長度中，存在322個堿基變異，遺傳距離達0.406。12SrRNA和16SrRNA基因序列最為保守，兩者堿基差異分別為55和96 bp，遺傳距離分別為0.061和0.059。13個蛋白編碼基因遺傳距離在0.129～0.241之間，其中差異最大為ND6，遺傳距離高達0.241，在519 bp序列中共有104 bp的堿基變異。COⅡ是差異最小的，遺傳距離為0.129，在690 bp序列中含80 bp的堿基變異。在目前比較通用的物種鑒定標記COⅠ及Cytb基因，兩基因在兩種石斑魚中堿基差異分別為188和177 bp，遺傳距離分別為0.137和0.182，一般認為同一物種之間Cytb及COⅠ遺傳距離不超過0.020，該結果顯示巨石斑魚與斜帶石斑魚已遠超出種以上水平。

表5 巨石斑魚與斜帶石斑魚線粒體基因組 16個基因序列比較分析Table 5 Analysis 16 gene sequences between E. tauvina and E. coioides

2.7 巨石斑魚與斜帶石斑魚分子系統(tǒng)進化關系分析

基于線粒體基因組12個蛋白編碼基因序列，以鮨科魚類吉氏低紋鮨(Hypoplectrusgemma)、燕赤鮨(Chelidopercahirundinacea)作為外類群，利用最大似然法將巨石斑魚、斜帶石斑魚與GenBank下載的其他31種石斑魚亞科魚類蛋白編碼序列構建分子系統(tǒng)進化樹(見圖4)。除去外類群，33種石斑魚亞科魚類共聚為5個分支。其中，石斑魚屬并未形成單系，與部分其他屬的種類聚成兩個平行分支，其中褐石斑魚、云紋石斑魚、縱帶石斑魚等10種石斑魚屬與光腭鱸屬、駝背鱸屬、下美鮨屬、鳶鮨屬的種類聚為一支(分支Ⅰ)，位于進化樹頂部，而另外10種石斑魚聚為分支Ⅱ中；分支Ⅲ由煙鱸屬與九棘鱸屬組成；分支Ⅳ為側牙鱸屬，分支Ⅴ為鰓棘鱸屬，進化地位最為原始，位于進化樹基部。本研究的巨石斑魚以100%支持率與蜂巢石斑魚(Epinephelusmerra)聚在一起，位于分支Ⅱ，而斜帶石斑魚以100%支持率與馬拉巴石斑魚(Epinephelusmalabaricus)聚在一起，位于分支Ⅰ，兩種石斑魚的分類地位相對較遠。

圖4 基于12個蛋白編碼基因序列利用最大似然法構建的33種石斑魚的分子系統(tǒng)進化樹Fig.4 Molecular phylogenetic trees of 33 groupers constructed using maximum likelihood method based on 12 protein coding gene sequences

3 討論

3.1 巨石斑魚與斜帶石斑魚線粒體全基因組分析

巨石斑魚與斜帶石斑魚的線粒體基因組結構呈雙鏈閉合環(huán)狀，全序列共編碼37個基因(22個tRNA基因、13個編碼蛋白基因和2個rRNA基因)和一個非編碼的控制區(qū)序列。整個線粒體基因組基因排列順序與大部分硬骨魚類的結構一致，各基因長度也相差不大[18-20]。巨石斑魚和斜帶石斑魚mtDNA的基因分布都呈非均一性，其中tRNA-Gln、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Tyr、tRNA-Ser(TGA)、tRNA-Glu、tRNA-Pro8個tRNA基因和ND6基因位于L鏈，其余基因均在H鏈，與連總強等[21]所指出的大多數(shù)魚類L鏈和H鏈編碼情況一致。位于H鏈上的線粒體基因更易發(fā)生水解和氧化，而13個編碼蛋白基因僅ND6基因位于L鏈上，說明了其相對穩(wěn)定性和特殊性[22]。

巨石斑魚與斜帶石斑魚線粒體全基因組的堿基均表現(xiàn)出明顯的反G偏倚現(xiàn)象，G堿基含量分別為16.13%和16.51%，與其他硬骨魚類如牙鱈(Merlangiusmerlangus，16.2%)[23]、小黃魚(Larimichthyspolyactis，16%)[24]等線粒體基因中的G堿基含量相近，符合典型脊椎動物堿基組成特點[25-26]。兩種石斑魚的編碼蛋白基因中絕大部分基因起始密碼子為ATG，COⅠ基因起始密碼子為GTG，與大部分硬骨魚類線粒體基因組一致。而ATPase6基因則以TTG(巨石斑魚)和CTG(斜帶石斑魚)作為起始密碼子，此情況在Zhuang等[27]的研究中也有報道。終止密碼子存在TAA、TAG及不完全密碼子TA、T四種類型，與大多數(shù)硬骨魚類相同[21]，當中部分不完全終止密碼子可在轉錄mRNA后由3’端的多聚腺苷酸化作用形成完整的TAA終止密碼子[28-29]。部分魚類出現(xiàn)過不同于以上4種類型的特殊終止密碼子，如銀龍魚(Osteoglossumbicirrhosum)為AGG，蝴蝶魚(Pantodonbuchholzi)為AGA等[30]，這些差異與突變有助于從分子水平鑒別不同物種，分析不同物種的分類關系及進化地位。

3.2 巨石斑魚和斜帶石斑魚物種親緣關系分析

形態(tài)上，由于巨石斑魚和斜帶石斑魚體色、體型、斑紋等特征異常相似，在形態(tài)分類、養(yǎng)殖生產上均存在兩者混淆的情況。Ben-Tuvia[8]關于地中海巨石斑魚以及Tan等[11]關于中國南海及安達曼海魚類的分析記錄中均存在巨石斑魚與斜帶石斑魚的誤鑒。在分子水平研究中，朱世華[12]利用Cytb基因、周佳怡[13]基于DNA條形碼所構建的石斑魚屬系統(tǒng)進化樹上，巨石斑魚與斜帶石斑魚緊密聚在一起，親緣關系相近。而Craig等[14]、schoelinck等[15]、Ma等[16]關于石斑魚亞科分子系統(tǒng)進化研究中兩種石斑魚的分類位置相距較遠，位于不同的分支，遺傳差異較大。本研究根據(jù)采集的樣品材料，結合《中國魚類系統(tǒng)檢索》[5]、《臺灣魚類志》[6]、《Groupers of the world》[17]等資料，比對分析了兩種石斑魚的形態(tài)學特征性狀，總結出可有效區(qū)分兩種石斑魚的較典型差異特征，如巨石斑魚最后四根背鰭基部有一大型黑斑或為一組小黑點，而斜帶石斑魚沒有；巨石斑魚不具有第一鰓弓側骨片，斜帶石斑魚具有；巨石斑魚幽門盲囊數(shù)為16～18個，斜帶石斑魚為50～60個。這些差異特征可作為區(qū)分巨石斑魚和斜帶石斑魚的有效形態(tài)分類性狀。

在線粒體基因組信息方面，巨石斑魚與斜帶石斑魚的線粒體全長分別為16 787和16 798 bp，序列共存在11 bp長度差異，兩者在部分基因的長度及序列間隔與重疊信息也存在區(qū)別(見表3)。另外，篩選兩種石斑魚mtDNA中常用于分子系統(tǒng)進化研究的標記序列：13個蛋白編碼基因、2個rRNA及D-loop序列比對分析，揭示了兩者序列存在巨大差異。兩種石斑魚16個基因兩兩之間的遺傳距離差異范圍在0.059(16SrRNA)到0.406(D-loop)之間。Hebert[31]曾對11個門13 320個物種COⅠ序列進行研究，認為0.020(2%)的COⅠ遺傳距離可以區(qū)分不同物種，種內序列差異極少超過0.020，大多數(shù)低于0.010(1%)。Avise與Walker[32]也確定了0.020(2%)的Cytb遺傳距離可以區(qū)分不同物種。本研究中巨石斑魚和斜帶石斑魚COⅠ及Cytb遺傳距離差異達到了0.137和0.182，遠大于0.020(2%)的臨界值，其它14種基因在兩種石斑魚之間的遺傳距離差異全部大于2%，包括序列進化相對保守的12SrRNA與16SrRNA，這揭示巨石斑魚與斜帶石斑魚在分子水平上存在很大的遺傳差異，遠超出種以上水平?；?2個蛋白編碼基因構建的分子系統(tǒng)進化樹，巨石斑魚以100%支持率與蜂巢石斑魚聚在一起，位于第Ⅱ分支，而斜帶石斑魚與馬拉巴石斑魚聚在一起，位于第Ⅰ分支，分類地位相對較遠。研究結果與Craig等[14]、Schoelinck等[15]、Ma等[16]基于多個標記構建的石斑魚系統(tǒng)進化樹結果一致，巨石斑魚與斜帶石斑魚位于兩個不同的獨立分支。王穎匯[33]對中國近海分布的部分石斑魚類分子系統(tǒng)研究中也表明，巨石斑魚與斜帶石斑魚外部形態(tài)雖然相近，但兩者在進化樹上的位置相距甚遠。顯示兩種石斑魚雖然外部形態(tài)特征異常相似，但分子水平序列信息差異巨大，兩者不能混淆為同一物種。但目前也有不少關于巨石斑魚與斜帶石斑魚在分子水平十分接近的研究結果。Govindaraju等[34]基于RAPD標記技術對印度洋沿岸7種石斑魚分類關系研究發(fā)現(xiàn)，斜帶石斑魚、巨石斑魚和馬拉巴石斑魚聚為同一分支，遺傳距離也十分接近。周佳怡[13]基于DNA條形碼COⅠ基因石斑魚分類研究，巨石斑魚與斜帶石斑魚、馬拉巴石斑魚、青石斑魚均交錯聚集在同一分支，其認為這4種石斑魚可能是近期輻射進化的結果。Sachithanandam等[10]基于DNA條形碼研究分析了安達曼海巨石斑魚和斜帶石斑魚的差異，結合NCBI上下載的巨石斑魚COⅠ序列共同分析，發(fā)現(xiàn)安達曼海巨石斑魚與斜帶石斑魚聚為同一個分支，遺傳距離小于2%，而NCBI上下載采集于西太平洋的巨石斑魚卻位于其他分支，且與斜帶石斑魚的遺傳距離大于10%。其認為安達曼海及附近海域分布的巨石斑魚是斜帶石斑魚的誤鑒，來自太平洋的巨石斑魚是真正的巨石斑魚，因此需要對安達曼海區(qū)的石斑魚物種重新定義與歸類。

目前，巨石斑魚與斜帶石斑魚在形態(tài)與分子水平研究上均存在爭議。本研究綜合分析石斑魚的相關分類資料，揭示兩種石斑魚在形態(tài)上存在一定的區(qū)別特征。綜合線粒體基因組序列遺傳分歧度分析，兩者在基因序列水平存在巨大差異，已超出物種間的遺傳變異。研究結果表明，無論從外部形態(tài)上，還是從分子水平上進行判斷，兩種石斑魚是存在較大差異的獨立物種。至于目前部分研究認為巨石斑魚與斜帶石斑魚親緣關系十分接近，其原因是物種的誤鑒，還是物種近期的輻射進化，還是不同海區(qū)巨石斑魚群體存在多樣性差異，還需要進一步研究落實。建議在全球存在巨石斑魚分布的不同海區(qū)采集巨石斑魚群體，針對不同地理種群進行分子標記分析，厘清不同巨石斑魚群體的遺傳多樣性差異，進而最終確定巨石斑魚的種質情況。