• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    溴氰菊酯對稀有鮈鯽早期生命階段發(fā)育和內(nèi)分泌干擾毒性

    2022-06-02 01:45:18姜錦林呂建偉曹少華劉仁彬石佳奇單正軍
    中國環(huán)境科學(xué) 2022年5期
    關(guān)鍵詞:溴氰菊酯除蟲菊仔魚

    姜錦林,呂建偉,曹少華,劉仁彬,石佳奇,龍 濤,單正軍

    溴氰菊酯對稀有鮈鯽早期生命階段發(fā)育和內(nèi)分泌干擾毒性

    姜錦林*,呂建偉,曹少華,劉仁彬,石佳奇,龍 濤,單正軍

    (生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所,國家環(huán)境保護(hù)土壤環(huán)境管理與污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210042)

    采用半靜態(tài)水體暴露方式研究了水中溴氰菊酯對稀有鮈鯽早期生命階段的發(fā)育毒性與內(nèi)分泌干擾效應(yīng).結(jié)果表明,影響稀有鮈鯽胚胎孵化的LOEC(最低可觀察效應(yīng)濃度)>3.0μg/L;影響稀有鮈鯽仔魚發(fā)育畸形和死亡指標(biāo)的LOEC和NOEC(無可觀察效應(yīng)濃度)分別為1.0和0.33μg/L.低至0.04μg/L的溴氰菊酯暴露便可顯著下調(diào)稀有鮈鯽幼魚體內(nèi)雄激素受體基因(AR)表達(dá)量并上調(diào)甲狀腺激素受體基因(TRβ)表達(dá)量;0.11μg/L的溴氰菊酯暴露可以下調(diào)稀有鮈鯽幼魚體內(nèi)雄激素受體基因(AR)、雌激素受體基因(ER1、ER2b)和芳香烴受體基因(AhR1a)的表達(dá)量,并上調(diào)甲狀腺激素受體基因(TRβ)表達(dá)量;0.33μg/L的溴氰菊酯可以下調(diào)稀有鮈鯽幼魚體內(nèi)雄激素受體基因(AR)、雌激素受體基因(ER1、ER2b)、芳香烴受體基因(AhR1a、AhR1b、AhR2)的表達(dá)量,并誘導(dǎo)甲狀腺激素受體基因(TRβ)表達(dá)量的上調(diào).上述作用濃度水平已經(jīng)處于多個天然水體中溴氰菊酯的檢出濃度范圍,因此,關(guān)于水體殘留溴氰菊酯對魚類的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)必須予以重視.

    溴氰菊酯;稀有鮈鯽;早期生命階段;發(fā)育毒性;內(nèi)分泌干擾

    擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是一種高效殺蟲劑,在全球范圍內(nèi)使用歷史較長,由于其疏水性較強(qiáng),易富集在水生生物體內(nèi),且對水生生物的毒性較大,故對水生生態(tài)系統(tǒng)存在一定風(fēng)險.溴氰菊酯是擬除蟲菊酯類農(nóng)藥中對蟲類毒力最高的一種,在我國較為常見,被廣泛用于農(nóng)林漁業(yè)病蟲害防治.鑒于其健康風(fēng)險,溴氰菊酯被美國環(huán)保局確定為首要控制使用的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥之一[1],近期研究也發(fā)現(xiàn)溴氰菊酯及其代謝產(chǎn)物在人體尿液及母乳中廣泛存在,流行病學(xué)研究結(jié)果顯示,體內(nèi)溴氰菊酯可能和小兒智力發(fā)育障礙,小兒孤僻癥相關(guān),這可能和哺乳動物早期發(fā)育的神經(jīng)元對溴氰菊酯暴露具有高度敏感性有關(guān)[2].一般來說,擬除蟲菊酯類農(nóng)藥在哺乳動物和高等脊椎動物體內(nèi)的代謝較快,可快速被清除,但在水生生物體內(nèi)的代謝和排泄能力較低,毒性較高.作為最早使用擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的國家,美國很早就開始關(guān)注擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對水生態(tài)環(huán)境帶來的影響[3].

    由于擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用,近年來世界上越來越多的水體環(huán)境中檢測到擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的存在[4–10].由于此類農(nóng)藥在我國的使用量較大,水環(huán)境中殘存的農(nóng)藥可能會對水生生物造成有害影響.急性研究表明,大部分?jǐn)M除蟲菊酯類類農(nóng)藥對枝腳類等浮游生物、蝦類和魚類的毒性等級處于高毒,且總體上,對前兩者(枝腳類和蝦類)的毒性高于后者(魚類).如溴氰菊酯對多刺裸腹溞的24h- LC50為0.133μg/L[11];溴氰菊酯和氰戊菊酯對凡納對蝦的24h-LC50分別為0.20和0.17μg/L[12].而溴氰菊酯對花鰻鱺和黔東南田魚(鯉)的96h-LC50分別為7.67[13]和5.38μg/L[14],聯(lián)苯菊酯對真鯛的24h-LC50為2.5μg/L[15].以上研究表明擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對水生態(tài)風(fēng)險不可忽視.目前針對菊酯類農(nóng)藥對水生生物的致毒機(jī)理和毒性效應(yīng)特征研究相對較少,研究表明溴氰菊酯在48h內(nèi)可通過氧化損傷途徑對克氏原螯蝦機(jī)體產(chǎn)生毒性作用[16];另有研究表明溴氰菊酯對中華絨螯蟹免疫系統(tǒng)有顯著影響[17],且對中華絨螯蟹血細(xì)胞有較強(qiáng)的DNA損傷作用[18].此外,諸多研究揭示溴氰菊酯處理對水生魚類具有神經(jīng)、心血管和生殖毒性,且對魚類的運(yùn)動有負(fù)面影響[19].

    稀有鮈鯽()是一種中國特有的淡水魚類,主要生活于支流的溝渠等小水體中,分布于中國四川省漢源縣等地,具有性周期短、易于飼養(yǎng)、對化學(xué)物質(zhì)敏感等優(yōu)點(diǎn),是進(jìn)行化學(xué)品毒性測試和環(huán)境水樣毒性實(shí)驗(yàn)的理想材料[20,21].本研究選擇稀有鮈鯽作為供試生物,研究溴氰菊酯暴露對稀有鮈鯽早期生命階段的發(fā)育毒性和內(nèi)分泌相關(guān)核受體基因表達(dá)干擾效應(yīng),以期為豐富溴氰菊酯的水生生物毒性效應(yīng)特征和毒性機(jī)制研究,及其更完善的水生態(tài)風(fēng)險評估打下基礎(chǔ).

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    儀器:繁殖盒(北京愛生科技發(fā)展有限公司);1L玻璃魚缸(配蓋,三合祖平玻璃儀器廠);人工氣候箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);體視顯微鏡(Leica,S8APO);手持式組織勻漿機(jī);離心機(jī)(Sigma 2-16PK);核酸蛋白質(zhì)測定儀(Beckman-DU800); PCR儀(Bio-Rad DNAEngine);熒光定量PCR儀(Bio-Rad CFX96TMReal-Time System).

    試劑:98.2%溴氰菊酯原藥,購自江蘇農(nóng)博生物科技有限公司;二甲基亞砜(DMSO),購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;RNA提取試劑盒RNAprep Pure Micro Kit(TIANGEN,Beijing,China);反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace qPCR PT Kit(TOYOBO,Tokyo,Japan);實(shí)時熒光定量PCR試劑盒ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme,Q711-02).

    1.2 受試材料

    供試魚種為稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus),品種為封閉群IHB.種魚購自中國科學(xué)院水生生物研究所,引入批號為稀有鮈鯽20180728,從該批次的養(yǎng)殖群體中選擇健康、體表無損傷、體質(zhì)健壯的成魚為親魚,飼養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中14d,溫度(25±2)°C,每天14h光照,溶解氧大于空氣飽和濃度的60%,每日定時投喂豐年蟲2次(08:00、16:00).

    將雌雄親魚以1:1比例配對,每日觀察雌雄魚的行為,當(dāng)觀察到雄魚追逐雌魚時,將雌雄魚撈出,人工受精方式獲取受精卵.試驗(yàn)開始前在顯微鏡下隨機(jī)抽樣觀察,確認(rèn)本批受精卵處于單細(xì)胞期.

    試驗(yàn)用水為曝氣處理24h以上的除氯自來水,水溫為(25±1)°C,pH值控制在6.5~7.5,光/暗比為14h/10h,溶解氧360%,水質(zhì)硬度為145.0mg/L(以CaCO3計).

    1.3 暴露實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 試驗(yàn)藥液配制 準(zhǔn)確稱取0.0509g 98.2%溴氰菊酯原藥,加10.0mL DMSO,用試驗(yàn)用水溶解并定容至500mL,得到濃度為100.0mg/L溴氰菊酯貯備溶液.使用時將貯備溶液分別稀釋為1.0mg/L和100.0μg/L的稀釋溶液,再進(jìn)一步稀釋為各暴露組溶液.吸取100.0μL DMSO,用試驗(yàn)用水稀釋定容至1.0L,得到濃度為0.1mL/L的溶劑對照組.受試物溶液每隔72h更新一次,受試物溶液體積1L.

    1.3.2 魚類早期生命階段毒性試驗(yàn) 根據(jù)稀有鮈鯽幼魚(受精卵孵出后1月齡)急性毒性預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,將早期生命階段毒性試驗(yàn)試驗(yàn)處理組濃度分別設(shè)置為0.04,0.11,0.33,1.0,3.0μg/L,同時設(shè)置不含受試物的空白對照組和一組二甲基亞砜(DMSO)溶劑對照組.受試溶液穩(wěn)定性測試結(jié)果表明,在半靜態(tài)試驗(yàn)條件(換水頻率為72h)下,試驗(yàn)過程中受試物濃度的變化小于初始測試濃度的±20%,符合半靜態(tài)試驗(yàn)質(zhì)控要求,因此試驗(yàn)采用半靜態(tài)試驗(yàn)法.

    試驗(yàn)期間,受試溶液體積為1L,容器內(nèi)溶液的負(fù)荷率不超過5g/L.每一濃度處理組和對照組90粒卵,分為3個平行.魚卵受精后開始試驗(yàn),在胚盤開始分裂前將胚胎浸在試驗(yàn)溶液中.試驗(yàn)期限:孵育期3d,孵出后28d,共計31d.光暗比為14h:10h,溫度24.2~ 25.8°C,溶解氧81.8%~96.8%.親魚飼喂豐年蝦,剛出生仔魚飼喂草履蟲,幼魚飼喂孵出48h的鹵蟲幼體.第一次仔魚飼喂在產(chǎn)卵后第6d開始.在每次更換試驗(yàn)液時清理試驗(yàn)容器.試驗(yàn)期間,記錄胚胎孵化情況,每24h觀察記錄胚胎及幼魚畸形、死亡情況,并清理死亡胚胎和幼魚.

    1.4 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)方法

    暴露31d后,用液氮速凍各處理濃度組和對照組稀有鮈鯽幼魚并提取魚體總RNA.按照RNA提取試劑盒說明書提取暴露31d后幼魚的總RNA,用核酸蛋白質(zhì)儀測定RNA的濃度和純化質(zhì)量,再按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,得到互補(bǔ)DNA(cDNA).最后按照實(shí)時熒光定量PCR試劑盒說明書在冰上配制20μL反應(yīng)體系,反應(yīng)程序:95°C預(yù)變性30s;95°C 10s,60°C 30s,共40個循環(huán);融解曲線采集程序使用儀器默認(rèn)的采集程序.所用基因引物序列如表1.

    表1 實(shí)時熒光定量PCR引物序列

    1.5 數(shù)據(jù)處理

    相對基因表達(dá)量采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計算,其中ΔΔCt由公式(1)計算得到:

    ΔΔCt=(Cttarget-Ctactin)·t-(Cttarget-Ctactin)·0(1)

    式中:Ct表示循環(huán)閾值;Cttarget表示目標(biāo)基因的Ct值;Ctactin表示內(nèi)參基因的Ct值;t代表任意時間點(diǎn);0表示經(jīng)β-actin基因校正后1倍量的目標(biāo)基因表達(dá).

    在滿足正態(tài)分布和方差齊性的前提條件下,采用單因素方差分析法(One-way ANOVO)和最小顯著性檢驗(yàn)法(LSD)分析處理組和對照組之間的差異顯著性(<0.05為差異顯著,用*表示),否則采用非參數(shù)檢驗(yàn)來檢驗(yàn)組間差異的顯著性,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)表示.用Origin 9.1軟件作圖.

    2 結(jié)果與分析

    2.1 溴氰菊酯對稀有鮈鯽胚胎孵化和仔魚發(fā)育影響

    稀有鮈鯽胚胎孵出48~72h后逐漸孵化,到96h孵化全部完成,各濃度處理組孵化率與對照組的孵化率不存在顯著性差異,所以0.04~3.0μg/L的溴氰菊酯對稀有鮈鯽的孵化無顯著影響.如圖1所示,3.0μg/L濃度組4~5d時,孵化出的仔魚開始出現(xiàn)畸形,可以觀察到的畸形終點(diǎn)指標(biāo)包括仔魚軀體彎曲和體軸彎曲等;1.0μg/L濃度組6~7d時,孵化出的仔魚開始出現(xiàn)畸形,可以觀察到的畸形終點(diǎn)指標(biāo)包括卵黃囊水腫和尾部彎曲(144h),以及心包水腫(168h)等;其余濃度組基本未出現(xiàn)仔魚畸形的情況.從第10d開始,畸形的仔魚開始死亡,故統(tǒng)計了4~9d各濃度組的畸形率變化情況,結(jié)果見圖2.與對照組相比,1.0和3.0μg/L濃度組的稀有鮈鯽畸形率隨暴露時間延長而顯著升高,而暴露在其它幾組較低的濃度組的仔魚相比對照組則無顯著差異.

    圖1 溴氰菊酯暴露對稀有鮈鯽仔魚的致畸效應(yīng)

    A為正常仔魚(CK,144h);B為卵黃囊水腫、尾部彎曲(1.0μg/L,144h);C為卵黃囊水腫(1.0μg/L,168h);D為心包水腫(1.0μg/L,168h);E為軀體彎曲(3.0μg/L,144h);F為體軸彎曲(3.0μg/L,144h)

    圖2 溴氰菊酯對稀有鮈鯽畸形率的影響

    2.2 溴氰菊酯對稀有鮈鯽幼魚死亡率影響

    1.0與3.0μg/L濃度組的稀有鮈鯽在暴露第9d時出現(xiàn)數(shù)量較多的畸形,死亡率結(jié)果如圖3所示,從第10d開始,畸形的仔魚開始死亡,到第13d時,1.0與3.0μg/L濃度組的稀有鮈鯽仔魚基本全部死亡.試驗(yàn)結(jié)束后,對31d各暴露組稀有鮈鯽死亡率做了統(tǒng)計,結(jié)果顯示,除1.0和3.0μg/L濃度組外,暴露在其它幾組較低濃度組的仔魚死亡率相比對照組無顯著性差異.綜合發(fā)育與死亡終點(diǎn)指標(biāo),溴氰菊酯對稀有鮈鯽的LOEC(最低可觀察效應(yīng)濃度)為1.0μg/L,NOEC (無可觀察效應(yīng)濃度)為0.33μg/L.

    圖3 溴氰菊酯暴露對稀有鮈鯽仔魚死亡率影響

    2.3 溴氰菊酯對稀有鮈鯽幼魚性激素受體基因表達(dá)的影響

    選取雄激素受體(AR)和雌激素受體(ERs)作為溴氰菊酯對稀有鮈鯽幼魚發(fā)育過程中的生殖內(nèi)分泌干擾機(jī)制的研究對象.如圖4所示,在經(jīng)溴氰菊酯暴露31d后,各濃度組稀有鮈鯽幼魚體內(nèi)AR基因的相對表達(dá)量與對照組相比均顯著下降,分別為對照組的0.77倍、0.65倍、0.37倍(數(shù)值分別對應(yīng)0.04, 0.11,0.33μg/L濃度組).測定溴氰菊酯對稀有鮈鯽幼魚發(fā)育過程中體內(nèi)ERs表達(dá)情況,結(jié)果表明,0.11, 0.33μg/ L濃度組稀有鮈鯽幼魚體內(nèi)ER1、ER2b基因的相對表達(dá)量與對照組相比均顯著下降,分別為0.69、0.42倍(0.11μg/L組別)和0.74、0.50倍(0.33μg/ L組別),而0.04μg/L濃度組稀有鮈鯽幼魚體內(nèi)ER1、ER2b基因的相對表達(dá)量與對照組相比無顯著差異.各濃度組溴氰菊酯對ER2a基因的相對表達(dá)量無顯著影響.

    圖4 溴氰菊酯對稀有鮈鯽幼魚性激素受體基因表達(dá)影響

    2.4 溴氰菊酯對稀有鮈鯽幼魚甲狀腺激素受體基因表達(dá)的影響

    通過溴氰菊酯暴露后稀有鮈鯽幼魚體內(nèi)甲狀腺激素受體TRα和TRβ基因的表達(dá)情況,分析溴氰菊酯對稀有鮈鯽幼魚甲狀腺干擾效應(yīng).如圖5所示,在經(jīng)溴氰菊酯暴露31d后,各濃度組稀有鮈鯽幼魚體內(nèi)TRβ基因的相對表達(dá)量與對照組相比均顯著上升,分別為對照組的2.66倍、3.07倍、4.41倍(數(shù)值分別對應(yīng)0.04,0.11,0.33μg/L濃度組),而各濃度組溴氰菊酯對TRα基因的相對表達(dá)量無顯著影響.

    圖5 溴氰菊酯對稀有鮈鯽幼魚甲狀腺激素受體基因表達(dá)影響

    2.5 溴氰菊酯對稀有鮈鯽幼魚芳香烴受體基因表達(dá)的影響

    通過溴氰菊酯暴露后稀有鮈鯽幼魚發(fā)育過程中體內(nèi)芳香烴受體基因AhRs表達(dá)情況,分析稀有鮈鯽暴露溴氰菊酯后芳香烴受體介導(dǎo)毒性反應(yīng)的影響.如圖6所示,0.11和0.33μg/L濃度組稀有鮈鯽幼魚體內(nèi)AhR1a基因的相對表達(dá)量與對照組相比均顯著下降,下降程度分別為0.68倍和0.50倍;而0.04μg/L濃度組稀有鮈鯽幼魚體內(nèi)AhR1a基因的相對表達(dá)量與對照組相比無顯著差異.0.33μg/L濃度組稀有鮈鯽幼魚體內(nèi)AhR1b基因和AhR2基因的相對表達(dá)量與對照組相比均顯著下降,分別為0.44倍和0.59倍,而0.04和0.11μg/L濃度組稀有鮈鯽幼魚體內(nèi)AhR1b、AhR2基因的相對表達(dá)量與對照組相比均無顯著差異.

    3 討論

    擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是繼有機(jī)氯、有機(jī)磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯之后的第三代農(nóng)藥,具有高效廣譜,對哺乳動物低毒和低殘留的優(yōu)點(diǎn),在農(nóng)業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用,且其使用量逐年增加.其中,溴氰菊酯是最常見的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥品種.擬除蟲菊酯類農(nóng)藥進(jìn)入水環(huán)境的方式有3種,一種是施于農(nóng)田的農(nóng)藥通過沉降及地表徑流等方式進(jìn)入水體環(huán)境中[22];一種是由于農(nóng)藥的不恰當(dāng)使用,如在魚類養(yǎng)殖時使用擬除蟲菊酯類農(nóng)藥進(jìn)行清塘工作,使其直接進(jìn)入養(yǎng)殖水體中;還有一種是活性成分隨人類使用的蚊香、驅(qū)蚊水殘渣隨生活污水進(jìn)入水體.近年來,由于擬除蟲菊酯農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用,世界上越來越多的水體環(huán)境中檢測到擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的存在[4–6].此外,國內(nèi)九龍江口[7]、官廳水庫[8]、梁灘河流域[9]和珠江三角河網(wǎng)[10]等水體環(huán)境中也均有擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的檢出,其中溴氰菊酯檢出濃度范圍為ND~106.3ng/L.由于溴氰菊酯等農(nóng)藥對水生生物具有較高的毒性,水環(huán)境中殘存的溴氰菊酯可能會對魚類造成不利影響.已有研究表明,斑馬魚幼魚在溴氰菊酯脅迫下出現(xiàn)體長縮短、頭眼面積減小和孵化率增加等現(xiàn)象,其頭部、身體、心臟和尾部區(qū)域產(chǎn)生不同程度的凋亡,溴氰菊酯顯著誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子flk1和fli-1以及心肌發(fā)育相關(guān)基因myl7呈劑量依賴性下降,增加了斑馬魚幼魚的趨觸性行為,引起了類似焦慮的行為[23].暴露在溴氰菊酯中的鰱魚出現(xiàn)不同程度的行為失調(diào),肝、鰓、腦、肌肉組織中總蛋白含量顯著降低,全身皮質(zhì)醇和血糖水平顯著升高[24].最近的研究還發(fā)現(xiàn),20和40μg/L的溴氰菊酯處理顯著阻礙了斑馬魚胚胎魚鰾前體細(xì)胞和組織層的形成,因此損害了斑馬魚魚鰾的發(fā)育[19].目前對環(huán)境濃度范圍該類農(nóng)藥是否能引起魚類的發(fā)育和內(nèi)分泌干擾毒性方面的研究還相對較少.本研究將處于早期生命階段的稀有鮈鯽胚胎暴露于0.04~3.0μg/L的溴氰菊酯溶液中,發(fā)現(xiàn)考察濃度范圍內(nèi)溴氰菊酯對稀有鮈鯽胚胎的孵化無顯著影響(LOEC>3.0μg/L),但暴露于1.0和3.0μg/L的溴氰菊酯溶液7~9d后,大量仔魚出現(xiàn)畸形癥狀,暴露31d后的幼魚死亡率分別為96.7%和100%,綜合來看,影響稀有鮈鯽仔魚發(fā)育畸形和死亡指標(biāo)的LOEC和NOEC分別為1.0和0.33μg/L.由此可見0.33~1.0μg/L濃度水平的溴氰菊酯水環(huán)境賦存濃度可能會對水生魚類幼體造成畸形和死亡風(fēng)險.從內(nèi)分泌干擾終點(diǎn)指標(biāo)(性激素受體基因表達(dá)和甲狀腺激素受體基因表達(dá))來看,低至0.04μg/L的溴氰菊酯濃度已經(jīng)對稀有鮈鯽幼魚內(nèi)分泌指標(biāo)造成了干擾,而該濃度水平已處在當(dāng)下諸多天然水體的檢出濃度范圍,這需引起重視.

    性激素受體包括雄激素受體(AR)和雌激素受體(ERs),本研究選取這兩類受體基因作為溴氰菊酯對稀有鮈鯽幼魚發(fā)育過程中的生殖內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的研究對象.AR和ERs通常在魚類的性腺和腦中表達(dá),屬于核受體超家族成員之一[25].現(xiàn)有研究表明,一些化合物會影響性激素核受體的表達(dá),從而對水生生物造成類雌激素效應(yīng).例如,有機(jī)氯農(nóng)藥會與靶細(xì)胞上的雌激素結(jié)合,對內(nèi)源性雌激素造成影響[26].擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對生殖內(nèi)分泌的干擾機(jī)制可能包括對性激素合成和代謝干擾、類雌激素效應(yīng)、抗雄激素效應(yīng)等.現(xiàn)有的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥干擾類雌激素和抗雄激素活性的研究表明,對于雄激素受體基因,高效氯氟氰菊酯、氰戊菊酯和氯菊酯暴露均會抑制斑馬魚幼魚體內(nèi)AR的表達(dá),表現(xiàn)出一定的抗雄激素效應(yīng);對于雌激素受體基因,高效氯氟氰菊酯暴露會上調(diào)斑馬魚幼魚體內(nèi)ER1的表達(dá),下調(diào)ER2a的表達(dá),氰戊菊酯暴露會上調(diào)ER1的表達(dá),氯菊酯暴露會上調(diào)ER2a、ER2b的表達(dá)[27].類似的,本研究從基因水平上對比分析溴氰菊酯對稀有鮈鯽幼魚發(fā)育中性激素受體基因的影響,也發(fā)現(xiàn)溴氰菊酯對雄激素受體基因和雌激素受體基因均存在抑制作用,且對AR基因表達(dá)的抑制作用要高于ERs基因(表現(xiàn)在抑制ER1、ER2b基因的表達(dá)).

    甲狀腺激素受體基因(TR)屬于核受體超家族,主要包含TRα和TRβ兩種基因,對于機(jī)體的正常分化發(fā)育和維持調(diào)控體內(nèi)代謝平衡等多個方面具有重要作用.其中,TRα在機(jī)體中的主要功能是調(diào)節(jié)機(jī)體生長發(fā)育、維持甲狀腺功能;TRβ在機(jī)體中的主要功能是增加T3的敏感性,維持甲狀腺激素TH對促甲狀腺素TSH的負(fù)反饋[28–30].甲狀腺激素能影響魚類胚胎向幼魚的轉(zhuǎn)變,所以,魚類的生長發(fā)育離不開甲狀腺激素的作用.多個研究證明內(nèi)分泌干擾物可以干擾魚類體內(nèi)甲狀腺系統(tǒng)的循環(huán)調(diào)節(jié),影響甲狀腺的功能,如添加型阻燃劑六溴環(huán)十二烷對斑馬魚體內(nèi)T3和T4具有明顯抑制作用,隨著其暴露濃度的增加,T3和T4的含量水平呈現(xiàn)下降趨勢[31];納米氧化銅會損傷甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu),改變上皮細(xì)胞形態(tài),誘導(dǎo)甲狀腺激素T3和T4上升,造成代謝酶編碼基因ugt1ab表達(dá)的下調(diào)[32];多氯聯(lián)苯暴露會引起褐牙鲆幼魚甲狀腺濾泡細(xì)胞出現(xiàn)明顯的增生以及膠質(zhì)缺損現(xiàn)象,并造成血漿甲狀腺激素水平顯著下降[33].本研究結(jié)果表明,0.04μg/L的溴氰菊酯暴露便會通過干擾稀有鮈鯽幼魚TRβ基因的表達(dá),對稀有鮈鯽幼魚的甲狀腺系統(tǒng)產(chǎn)生干擾效應(yīng).本研究從基因?qū)用嫔县S富了溴氰菊酯對稀有鮈鯽體內(nèi)甲狀腺干擾作用機(jī)制的研究,然而,擬除蟲菊酯對甲狀腺系統(tǒng)的具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步補(bǔ)充研究.

    芳香烴受體基因(AhRs)作為一種配體誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子,可以協(xié)助維持免疫系統(tǒng)的正常運(yùn)行. AhRs能誘導(dǎo)CYP1A1和CYP1A2表達(dá),參與輻射、感染、炎癥和氧化應(yīng)激等應(yīng)激刺激,介導(dǎo)多種細(xì)胞毒性反應(yīng)和重要的生物學(xué)過程,如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、腫瘤演進(jìn)、生長發(fā)育和再生等[34-35].外源污染物會影響哺乳動物芳香烴受體基因的表達(dá),根據(jù)已有的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的研究,聯(lián)苯菊酯和功夫菊酯暴露均會影響大鼠CYP1A的表達(dá),從而影響其氧化代謝功能[36].已有研究表明,某些外源性污染物也會影響魚類芳香烴受體的表達(dá),對魚類的氧化代謝造成干擾,如低劑量三唑錫對雌性斑馬魚暴露處理后可抑制卵巢芳香化酶基因的表達(dá),而高劑量組則促進(jìn)了芳香化酶基因的表達(dá),此外,各濃度組三唑錫均顯著抑制雄性斑馬魚精巢芳香化酶基因的表達(dá)[37];類二噁英多氯聯(lián)苯(PCB126)能明顯誘導(dǎo)斑馬魚胚胎EROD活性及CYP1A基因mRNA相對表達(dá)量,呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系[38].CYP對氯菊酯的代謝具有保護(hù)作用[39],而氯氰菊酯可以介導(dǎo)斑馬魚幼魚和成魚體內(nèi)CYP酶的轉(zhuǎn)錄水平和催化活性[40].本研究結(jié)果表明,0.11μg/L的溴氰菊酯暴露便開始干擾稀有鮈鯽幼魚AhRs基因的表達(dá),從而影響體內(nèi)CYP的表達(dá),對稀有鮈鯽幼魚的代謝水平產(chǎn)生影響.

    4 結(jié)論

    4.1 考察濃度范圍內(nèi)的溴氰菊酯暴露對稀有鮈鯽胚胎的孵化無顯著影響(LOEC>3.0μg/L),但1.0和3.0μg/L的溴氰菊酯暴露7~9d可以誘導(dǎo)稀有鮈鯽仔魚發(fā)育出現(xiàn)顯著的畸形,包括軀體彎曲、體軸彎曲和卵黃囊水腫等癥狀.綜合早期生命階段稀有鮈鯽的發(fā)育和死亡毒性終點(diǎn),溴氰菊酯對其LOEC=1.0μg/L, NOEC=0.33μg/L.

    4.2 低至0.04μg/L的溴氰菊酯暴露31d可以影響稀有鮈鯽幼魚性激素受體基因表達(dá)和甲狀腺激素受體基因表達(dá),從而干擾魚類生殖系統(tǒng)和甲狀腺系統(tǒng).其中,溴氰菊酯對其雄激素受體基因和雌激素受體基因均存在抑制作用,且對AR基因表達(dá)的抑制作用要高于ERs基因;溴氰菊酯通過干擾稀有鮈鯽幼魚TRβ基因的表達(dá)對其甲狀腺系統(tǒng)產(chǎn)生干擾效應(yīng).

    4.3 0.11~0.33μg/L的溴氰菊酯暴露通過下調(diào)稀有鮈鯽幼魚芳香烴受體基因(AhR1a、AhR1b、AhR2)表達(dá)量,從而影響體內(nèi)CYP的表達(dá),對稀有鮈鯽幼魚的代謝水平產(chǎn)生影響.

    [1] Sharma D, Ansari B. Effect of the synthetic pyrethroid Deltamethrin and the neem-based pesticide Achook on the reproductive ability of zebrafish, Danio rerio (Cyprinidae) [J]. Archives of Polish Fisheries, 2010,18(3):157-161.

    [2] Zheng J, Yu Y, Feng W, et al. Influence of nanomolar deltamethrin on the hallmarks of primary cultured cortical neuronal network and the role of ryanodine receptors [J]. Environmental Health Perspectives, 2019,127(6):067003.

    [3] 韓耀宗,朱國念,廖曉蘭,等.擬除蟲菊酯農(nóng)藥的毒性研究綜述[J]. 世界農(nóng)藥, 2008,30(3):34-35.

    Han Y Z, Zhu G N, Liao X L, et al. Review on toxicity of pyrethroid pesticides [J]. World Pesticides, 2008,30(3):34-35.

    [4] Weston D P, Lydy R J. Urban and agricultural sources of pyrethroid insecticides to the Sacramento-San Joaquin Delta of California [J]. Environmental Science & Technology, 2010,44(5):1833-1840.

    [5] Vryzas Z, Alexoudis C, Vassiliou G, et al. Determination and aquatic risk assessment of pesticide residues in riparian drainage canals in northeastern Greece [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2011,74(2):174-181.

    [6] Feo M L, Ginebreda A, Eljarrat E, et al. Presence of pyrethroid pesticides in water and sediments of Ebro River Delta [J]. Journal of Hydrology, 2010,393(3/4):156-162

    [7] 黃群騰.水環(huán)境中36種農(nóng)藥殘留的同時分析方法及其應(yīng)用[D]. 廈門:廈門大學(xué), 2008.

    Huang Q T. Simultaneously determination method for 36 pesticides in aquatic environment and its application [D]. Xiamen: Xiamen University, 2008.

    [8] Xue N, Xu X, Jin Z. Screening 31endocrine-disrupting pesticides in water and surface sediment samples from Beijing Guanting reservoir [J]. Chemosphere, 2005,61(11):1594-1606.

    [9] 龔得春.梁灘河流域擬除蟲菊酯農(nóng)藥多介質(zhì)殘留和環(huán)境行為研究[D]. 重慶:重慶大學(xué), 2013.

    Gong D C. Pyrethroids pesticides residues and thier behavior in a multimedium environment of Liangtan River basin [D]. Chongqing: Chongqing Universtiy, 2013.

    [10] 趙李娜.珠三角河網(wǎng)水環(huán)境中7種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留及風(fēng)險評價研究[D]. 上海:上海海洋大學(xué), 2014.

    Zhao L N. Residue and risk assessment of 7kinds of pyrethroids in water environment in the Pearl River Delta [D]. Shanghai: Shanghai Ocean University, 2014.

    [11] 修瑞琴,高世榮,許永香.大型溞生物測試法對農(nóng)藥溴氰菊酯的毒性評價[J]. 衛(wèi)生毒理學(xué)雜志, 1990,(3):15-17,68.

    Xiu R Q, Gao S R, Xu Y X. Studies on toxicity of new pesticide deltamethrin water flea Daphnia Magna Straus [J]. Journal of Health Toxicology, 1990,(3):15-17,68.

    [12] 周冬仁,盛鵬程,孫博弈,等.氰戊菊酯與溴氰菊酯對凡納對蝦的急性毒性 [J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2018,46(7):103-105.

    Zhou D R, Sheng P C, Sun B Y, et al. Acute toxicity of fenvalerate and deltamethrin to Penaeus vannamei [J]. Guizhou Agricultural Sciences, 2018,46(7):103-105.

    [13] 林 崗,張 倩,饒小珍.吡喹酮、甲苯咪唑、溴氰菊酯對花鰻鱺的急性毒性 [J]. 海洋漁業(yè), 2011,33(4):467-471.

    Lin G, Zhang Q, Rao X Z. Acute toxicity of praziquantel, mebendazole and deitamethrin on marbled eel[J]. Marine Fisheries, 2011,33(4):467-471.

    [14] 孟立霞,張文華,潘 娟,等.甲氰菊酯和溴氰菊酯對黔東南田魚(鯉)的急性毒性與安全評價[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011,39(17):10301- 10302.

    Meng L X, Zhang W H, Pan J, et al. Acute toxicity and safety evaluation of fenpropathrin and deltamethrin on field fish of Southeast Guizhou [J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2011,39(17): 10301-10302.

    [15] 鄭盛華,楊妙峰,鄭惠東,等.聯(lián)苯菊酯和醚菊酯對真鯛的急性毒性和安全性評價 [J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017,45(29):86-88.

    Zheng S H, Yang M F, Zheng H D, et al. Acute toxicity and safety evaluation of bifenthrin and ethofenprox on Pagrosomus major [J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2017,45(29):86-88.

    [16] 魏 華,吳 楠,沈 竑,等.溴氰菊酯對克氏原螯蝦的氧化脅迫效應(yīng)[J]. 水產(chǎn)學(xué)報, 2010,34(5):733-739.

    Wei H, Wu N, Shen H, et al. Oxidative stress of deltamethrin to the liver of crayfish () [J]. Journal of Fishries of China, 2010,34(5):733-739.

    [17] 洪宇航.溴氰菊酯對中華絨螯蟹主要免疫指標(biāo)的影響[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017,44(3):151-157.

    Hong Y H. Effects of deltamethrin on main immune parameters of Chinese mitten crab,[J]. Guangdong Agricultural Sciences, 2017,44(3):151-157.

    [18] 洪宇航,黃 毅.溴氰菊酯對中華絨螯蟹血細(xì)胞DNA的損傷[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2018,37(4):544-549.

    Hong Y H, Huang Y. Effects of deltamethrin on DNA damage in hemocytes of Chinese mitten handed crab,[J]. Fisheries Science, 2018,37(4):544-549.

    [19] Wu Y Q, Li W H, Yuan M R, et al. The synthetic pyrethroid deltamethrin impairs zebrafish () swim bladder development [J]. Science of the Total Environment, 2020,701:134870.

    [20] 熊 力,馬永鵬,毛思予,等.五氯酚對稀有鮈鯽胚胎毒性效應(yīng)研究[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2012,32(2):337-344.

    Xiong L, Ma Y P, Mao S Y, et al. Toxic effects of pentachlorophenol on the Chinese rare minnow embryos [J]. China Environmental Science, 2012,32(2):337-344.

    [21] Zhu B, Liu T Q, Hu X G, et al. Developmental toxicity of 3,4- dichloroaniline on rare minnow () embryos and larvae [J]. Chemosphere, 2013,90:1132-1139.

    [22] 趙之德,李海濤,梁 濤.聯(lián)苯菊酯等3種殺蟲劑在茶園茶葉、土壤及降雨徑流中的殘留[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(中英文), 2019,27(8): 1265-1274.

    Zhao Z D, Li H T, Liang T. Residues of three insecticides in tea leaves, soil and rainwater runoff [J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2019,27(8):1265-1274.

    [23] Li M, Liu X Y, Feng X Z. Cardiovascular toxicity and anxiety-like behavior induced bydeltamethrin in zebrafish () larvae [J]. Chemosphere, 2019,219:155-164.

    [24] Ullah S, Li Z Q,UI Arifeen M Z, et al. Multiple biomarkers based appraisal of deltamethrin induced toxicity in silver carp () [J]. Chemosphere, 2019,214:519-533.

    [25] Du M, Lin L, Yan C, et al. Enantiomer-specific bioaccumulation and depuration of hexabromocyclododecanes in zebrafish () [J]. Journal of Hazardous Materials, 2013,248-249C(1):167-171.

    [26] Filby A L, Ortiz-Zarragoitia M, Tyler C R. The vas:: egfp transgenic zebrafish: a practical model for studies on the molecular mechanisms by which environmental estrogens affect gonadal sex differentiation [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2014,33(3):602-605.

    [27] 杜 潔.擬除蟲菊酯對斑馬魚內(nèi)分泌平衡及氧化代謝的擾動效應(yīng)[D]. 杭州:浙江工業(yè)大學(xué), 2016.

    Du J. Disturbance Effect of pyrethroids on endocrine and xxidative metabolism in zebrafish () [D]. Hangzhou: Zhejiang University of Technology, 2016.

    [28] 張 沛,溫海深,遲美麗,等.花鱸三種甲狀腺激素受體(TRs)基因克隆及表達(dá)分析[J]. 海洋湖沼通報, 2018,(5):91-99.

    Zhang P, Wen H S, Chi M L, et al. Cloning and tissue expression analysis of three thyroid hormones receptor genes of spotted seabass () [J]. Transactions of Oceanology and Limnology, 2018,(5):91-99.

    [29] Tang X, Liu X, Zhang Y, et al. Molecular cloning, tissue distribution and expression profiles of thyroid hormone receptors during embryogenesis in orange-spotted grouper () [J]. General & Comparative Endocrinology, 2008,159(2):117-124.

    [30] Jugan M L, Levi Y, Blondeau J-P. Endocrine disruptors and thyroid hormone physiology [J]. Biochemical Pharmacology, 2010,79(7): 939-947.

    [31] 劉小燕,劉 珊,張麗娟,等.六溴環(huán)十二烷對斑馬魚的甲狀腺激素干擾效應(yīng)研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2017,36(11):2192-2198.

    Liu X Y, Liu S, Zhang L J, et al. Thyroid hormone-disrupting effects of hexabromocyclododecane in zebrafish () [J]. Journal of Agro-Environment Science, 2017,36(11):2192-2198.

    [32] 王黎曌,薛永來,高 璐,等.納米氧化銅對斑馬魚甲狀腺系統(tǒng)的干擾效應(yīng)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2019,47(14):202-205.

    Wang L Z, Xue Y L, Gao L, et al. Interference effect of copper oxide nanoparticles on thyroid system of zebrafish [J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2019,47(14):202-205.

    [33] 董怡飛,田 華,王 蔚,等.多氯聯(lián)苯對褐牙鲆仔魚變態(tài)及幼魚甲狀腺系統(tǒng)的干擾作用[C]//2016年中國水產(chǎn)學(xué)會學(xué)術(shù)年會論文集, 2016,214-214.

    Dong Y F, Tian H, Wang W, et al. Inhibition of larvae metamorphosis and disruption of juvenile fish thyroid system by polychlorinated biphenyls in Japanese flounder () [C]. Proceedings of the 2016 Chinese Fisheries Society Annual Conference, 2016:214-214.

    [34] 杜 潔,張 怡,洪盼盼,等.擬除蟲菊酯對斑馬魚氧化代謝相關(guān)基因表達(dá)影響[J]. 浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2016,(3):334-339.

    Du J, Zhang Y, Hong P P, et al. Effects of pyrethroids on the expression of oxidative metabolism related nuclear receptor genes in zebrafish [J]. Journal of Zhejiang University of Technology, 2016, (3):334-339.

    [35] 薄 軍,吳世軍,李裕紅,等.苯并[a]芘(BaP)對真鯛細(xì)胞色素P450和芳香烴受體基因表達(dá)的影響[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2010,(3):98-102.

    Bao J, Wu S J, Li Y H, et al. The effects of benzo[a]pyrene(BaP) exposure on the CYP1A1mRNA and AhR2mRNA expression of red seabream () [J]. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Sunyatseni, 2010,(3):98-102.

    [36] Abdou R, Sasaki K, Khalil W, et al. Effects of several pyrethroids on hepatic cytochrome P450 activities in rats [J]. Journal of Veterinary Medical Science, 2010,72(4):425-433.

    [37] 馬有寧.三唑錫對斑馬魚生殖內(nèi)分泌干擾作用及分子機(jī)制研究[D]. 杭州:浙江大學(xué), 2016.

    Ma Y N. Endocrine disruption by azocyclotin and its potential mechanism in zebrafish () [D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2016.

    Liu H. Studies on developmental toxicology of dioxin--like PCB126 in zebrafish embryos [D]. Zhanjiang: Guangdong Ocean University, 2012.

    [39] Clark B W, Giulio R T D. Fundulus heteroclitus adapted to PAHs are cross-resistant to multiple insecticides [J]. Ecotoxicology, 2012,21(2): 465-474.

    [40] Yang Y, Ye X, He B, et al. Cadmium potentiates toxicity of cypermethrin in zebrafish [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2016,35(2):435-445.

    Developmental toxicity and endocrine disrupting effects of deltamethrin on rare minnow () during early life stage.

    JIANG Jin-lin*, LYU Jian-wei, CAO Shao-hua, LIU Ren-bin, SHI Jia-qi, LONG Tao, SHAN Zheng-jun

    (Key Laboratory of Soil Environmental Management and Pollution Control, Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Ecology and Environment, Nanjing 210042, China)., 2022,42(5):2395~2403

    The developmental toxicity and endocrine disrupting effects of decamethrin on rare minnow () during early life stage were studied using semi-static water exposure method. The LOEC (lowest observed effect concentration) of decamethrin to the incubation of rare minnow embryo was above 3.0μg/L. The LOEC and NOEC (no observed effect concentration) of decamethrin to the developmental malformations and death indicators were 1.0 and 0.33μg/L, respectively. Exposure to the lowest concentration of decamethrin (0.04μg/L) could significantly down-regulate the expression of androgen receptor gene (AR) and up-regulate the expression of thyroid homone receptor gene (TRβ) in rare minnow larvae. Exposure to 0.11μg/L decamethrin down-regulated the expressions of AR, estrogen receptor genes (ER1, ER2b) and aromatic hydrocarbon receptor gene (AhR1a) in rare minnow larvae, and up-regulated the expressions of TRβ. Exposure to 0.33μg/Ldecamethrin inhibited the expressions of AR, estrogen receptor genes (ER1, ER2b) and aromatic hydrocarbon receptor genes (AhR1a, AhR1b, AhR2), as well as induced the expression of TRβ in rare minnow larvae. Given that these concentration levels have been in the range of detectable decamethrin concentrations in multiple natural water bodies, more attention should be paid to the endocrine disrupting effects of decamethrin on fish.

    decamethrin;rare minnow;early life stage;developmental toxicity;endocrine disruption

    X171,Q89

    A

    1000-6923(2022)05-2395-09

    姜錦林(1984-),男,浙江溫州人,研究員,博士,主要從事污染生態(tài)毒理學(xué)和風(fēng)險評估研究.發(fā)表論文40余篇.

    2021-10-18

    中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項目(GYZX220202);國家水體污染控制與治理科技重大專項(2017ZX07602)

    * 責(zé)任作者, 研究員, jjl@nies.org

    猜你喜歡
    溴氰菊酯除蟲菊仔魚
    不同基因型生態(tài)型除蟲菊中的除蟲菊酯含量分析
    饑餓對似魚句早期仔魚發(fā)育、攝食及生長的影響
    天然植物源農(nóng)藥除蟲菊酯的殺蟲特性、作用機(jī)制及應(yīng)用
    溴氰菊酯的急性毒性效應(yīng)與毒性機(jī)理研究進(jìn)展
    一株溴氰菊酯降解菌的分離鑒定及降解特性研究
    最著名的滅蟲植物
    斑鱖仔魚饑餓試驗(yàn)及不可逆點(diǎn)的確定
    饑餓對半刺厚唇魚(Acrossocheilius hemispinus)仔魚早期發(fā)育的主要影響
    溴氰菊酯降解菌的分離與鑒定及其降解特性
    Alice臺風(fēng)對東海鮐魚魚卵仔魚的輸運(yùn)和存活率的影響
    欧美日韩精品网址| 一a级毛片在线观看| 欧美又色又爽又黄视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲美女视频黄频| 天天添夜夜摸| 午夜激情福利司机影院| 欧美乱码精品一区二区三区| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 老司机福利观看| a级一级毛片免费在线观看| 99久久精品一区二区三区| 香蕉久久夜色| 国产毛片a区久久久久| av天堂中文字幕网| 波多野结衣高清无吗| 五月伊人婷婷丁香| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| www.色视频.com| 免费av毛片视频| 国产精品一及| 九九热线精品视视频播放| 99久久精品热视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 99久久无色码亚洲精品果冻| 午夜老司机福利剧场| av女优亚洲男人天堂| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产97色在线日韩免费| 99热这里只有精品一区| 亚洲中文日韩欧美视频| 日韩精品中文字幕看吧| 在线观看66精品国产| 久久久久久九九精品二区国产| 午夜免费成人在线视频| 少妇丰满av| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 免费观看人在逋| 男人的好看免费观看在线视频| 热99re8久久精品国产| www国产在线视频色| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 欧美中文综合在线视频| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲真实伦在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 欧美成狂野欧美在线观看| 午夜久久久久精精品| 国产探花极品一区二区| 国产一级毛片七仙女欲春2| 一进一出抽搐gif免费好疼| av在线蜜桃| 国产免费一级a男人的天堂| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲真实伦在线观看| 欧美bdsm另类| 日本免费a在线| 午夜激情欧美在线| 真实男女啪啪啪动态图| 国产伦精品一区二区三区四那| 搞女人的毛片| 我的老师免费观看完整版| 亚洲欧美日韩无卡精品| 他把我摸到了高潮在线观看| 成人特级av手机在线观看| 国产精品久久视频播放| 禁无遮挡网站| 中出人妻视频一区二区| 两个人看的免费小视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产视频一区二区在线看| www.色视频.com| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲天堂国产精品一区在线| 在线天堂最新版资源| 国产91精品成人一区二区三区| 性色avwww在线观看| 午夜久久久久精精品| 一区二区三区激情视频| 亚洲国产欧美人成| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 真人做人爱边吃奶动态| 97碰自拍视频| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产在视频线在精品| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 日本熟妇午夜| 18禁国产床啪视频网站| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 午夜日韩欧美国产| 国产真人三级小视频在线观看| 免费搜索国产男女视频| 亚洲在线自拍视频| 国产av在哪里看| 天美传媒精品一区二区| 九色国产91popny在线| 亚洲一区二区三区色噜噜| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 操出白浆在线播放| 亚洲国产精品合色在线| 97超视频在线观看视频| 免费在线观看成人毛片| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久精品影院6| 在线观看免费午夜福利视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 麻豆成人午夜福利视频| 日本熟妇午夜| 色吧在线观看| 久久久久性生活片| 欧美日韩精品网址| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 在线看三级毛片| 99国产精品一区二区三区| 国产一区二区在线观看日韩 | 国产精品电影一区二区三区| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲av免费高清在线观看| 午夜视频国产福利| 在线观看一区二区三区| 麻豆国产av国片精品| 久久久久久久久中文| 男女午夜视频在线观看| 日本一二三区视频观看| 18+在线观看网站| 欧美又色又爽又黄视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 高清日韩中文字幕在线| 桃色一区二区三区在线观看| 国产三级黄色录像| 97超视频在线观看视频| 久久精品影院6| 啪啪无遮挡十八禁网站| 午夜激情欧美在线| 麻豆一二三区av精品| av福利片在线观看| 午夜a级毛片| 观看美女的网站| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产av一区在线观看免费| 亚洲欧美日韩东京热| 午夜福利18| 久久久久久久午夜电影| 99riav亚洲国产免费| 99热这里只有精品一区| 韩国av一区二区三区四区| av在线蜜桃| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 亚洲人成伊人成综合网2020| 怎么达到女性高潮| 日韩中文字幕欧美一区二区| 又粗又爽又猛毛片免费看| 一夜夜www| 国产精品永久免费网站| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 深爱激情五月婷婷| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 我的老师免费观看完整版| 日韩欧美免费精品| 久久久精品大字幕| av欧美777| 美女cb高潮喷水在线观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 午夜免费观看网址| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲成人免费电影在线观看| а√天堂www在线а√下载| 久久精品91无色码中文字幕| 成人欧美大片| 久久久成人免费电影| 国产美女午夜福利| 国语自产精品视频在线第100页| 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 精品一区二区三区视频在线观看免费| 他把我摸到了高潮在线观看| 桃红色精品国产亚洲av| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产欧美日韩一区二区三| 丝袜美腿在线中文| 欧美黑人巨大hd| 午夜久久久久精精品| 亚洲专区国产一区二区| 精品久久久久久,| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 亚洲成人久久爱视频| 成人欧美大片| 动漫黄色视频在线观看| 99久久精品热视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲精品456在线播放app | 天美传媒精品一区二区| 国产97色在线日韩免费| 欧美乱色亚洲激情| 免费看a级黄色片| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲人与动物交配视频| 看免费av毛片| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲熟妇熟女久久| 好男人在线观看高清免费视频| 看黄色毛片网站| 久久久久亚洲av毛片大全| 丝袜美腿在线中文| 国产午夜精品论理片| 国产精品久久久人人做人人爽| bbb黄色大片| h日本视频在线播放| 国产一区二区亚洲精品在线观看| www.熟女人妻精品国产| 搡老岳熟女国产| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲五月天丁香| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久久成人免费电影| 在线看三级毛片| 亚洲国产高清在线一区二区三| 香蕉丝袜av| 午夜福利成人在线免费观看| av天堂在线播放| 亚洲五月婷婷丁香| 国产黄片美女视频| 亚洲七黄色美女视频| 一级毛片女人18水好多| 亚洲,欧美精品.| 免费看日本二区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 欧美在线一区亚洲| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 一进一出抽搐动态| 国产午夜福利久久久久久| 岛国在线免费视频观看| 国产午夜精品论理片| 国产精品一区二区三区四区久久| 日韩欧美国产在线观看| 在线视频色国产色| 好男人在线观看高清免费视频| 99久久九九国产精品国产免费| 久久久国产精品麻豆| 国产综合懂色| 日韩欧美精品v在线| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 日本三级黄在线观看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 久久午夜亚洲精品久久| 又紧又爽又黄一区二区| 老鸭窝网址在线观看| 日韩欧美在线乱码| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 人人妻人人澡欧美一区二区| 99热6这里只有精品| 国产精品久久久久久久电影 | 久久精品91蜜桃| 两个人视频免费观看高清| 麻豆一二三区av精品| 国产精品,欧美在线| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产av在哪里看| 久9热在线精品视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产精品精品国产色婷婷| 国产成人a区在线观看| 一区福利在线观看| 精品日产1卡2卡| 97碰自拍视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 在线天堂最新版资源| а√天堂www在线а√下载| 一区二区三区国产精品乱码| 99在线人妻在线中文字幕| 日本在线视频免费播放| 国产高清激情床上av| 性欧美人与动物交配| 欧美日韩黄片免| 51午夜福利影视在线观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产黄片美女视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 在线观看av片永久免费下载| 久久精品国产清高在天天线| 一级作爱视频免费观看| 天天一区二区日本电影三级| 日韩欧美三级三区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产精品国产高清国产av| 亚洲,欧美精品.| 十八禁人妻一区二区| 免费av观看视频| 草草在线视频免费看| 制服丝袜大香蕉在线| 免费观看精品视频网站| av天堂在线播放| 叶爱在线成人免费视频播放| 成人18禁在线播放| 岛国在线观看网站| 少妇人妻一区二区三区视频| 欧美色视频一区免费| 亚洲无线观看免费| 国产精品久久久人人做人人爽| 一级作爱视频免费观看| 99国产精品一区二区三区| 精品乱码久久久久久99久播| 美女 人体艺术 gogo| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 夜夜夜夜夜久久久久| av天堂中文字幕网| 久久久国产精品麻豆| 亚洲男人的天堂狠狠| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲av第一区精品v没综合| 午夜老司机福利剧场| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲国产精品999在线| www.www免费av| 久久久久久久久中文| 精品国产三级普通话版| 久99久视频精品免费| 亚洲欧美日韩东京热| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产视频内射| 亚洲成人免费电影在线观看| 乱人视频在线观看| www.熟女人妻精品国产| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 欧美成人a在线观看| 真人做人爱边吃奶动态| 国产主播在线观看一区二区| 99精品久久久久人妻精品| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 高清日韩中文字幕在线| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 90打野战视频偷拍视频| 成人18禁在线播放| 亚洲精品在线观看二区| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲片人在线观看| 很黄的视频免费| 亚洲欧美日韩高清在线视频| av国产免费在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 嫩草影院精品99| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲乱码一区二区免费版| 欧美成狂野欧美在线观看| 日本熟妇午夜| 九九热线精品视视频播放| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 亚洲五月婷婷丁香| 日韩国内少妇激情av| 色吧在线观看| 国产精品久久视频播放| 国产av麻豆久久久久久久| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| bbb黄色大片| 全区人妻精品视频| 欧美一区二区国产精品久久精品| 亚洲国产精品久久男人天堂| 91字幕亚洲| 日韩亚洲欧美综合| 成年免费大片在线观看| 在线观看午夜福利视频| 久久久久久久久中文| 99久久精品热视频| 久9热在线精品视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 色综合站精品国产| av黄色大香蕉| 午夜影院日韩av| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 他把我摸到了高潮在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 日本黄色视频三级网站网址| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产高清激情床上av| 热99re8久久精品国产| 精品国产亚洲在线| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产激情欧美一区二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| aaaaa片日本免费| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产黄色小视频在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 麻豆一二三区av精品| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 少妇熟女aⅴ在线视频| 一个人观看的视频www高清免费观看| 亚洲av五月六月丁香网| 男人的好看免费观看在线视频| 不卡一级毛片| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲欧美日韩无卡精品| 欧美国产日韩亚洲一区| 波多野结衣高清作品| 国产精品野战在线观看| 香蕉丝袜av| 婷婷亚洲欧美| 毛片女人毛片| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产精品久久久久久精品电影| 一本精品99久久精品77| 天堂√8在线中文| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 午夜精品在线福利| 久久久久亚洲av毛片大全| 狂野欧美激情性xxxx| 最新中文字幕久久久久| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲国产欧美人成| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲av熟女| 又紧又爽又黄一区二区| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产精品久久电影中文字幕| 波多野结衣高清作品| 色综合婷婷激情| 超碰av人人做人人爽久久 | 欧美日韩乱码在线| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲人成电影免费在线| 成人三级黄色视频| 亚洲第一电影网av| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 99热这里只有是精品50| 亚洲av电影在线进入| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产老妇女一区| 日本 欧美在线| 一个人看视频在线观看www免费 | 成人高潮视频无遮挡免费网站| 俄罗斯特黄特色一大片| 日韩欧美国产在线观看| 国产私拍福利视频在线观看| 国产av一区在线观看免费| 成人国产一区最新在线观看| 毛片女人毛片| 国产极品精品免费视频能看的| 99riav亚洲国产免费| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 在线观看午夜福利视频| 一级黄色大片毛片| www.www免费av| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久性视频一级片| 亚洲成人免费电影在线观看| 村上凉子中文字幕在线| 午夜精品久久久久久毛片777| 在线天堂最新版资源| 嫩草影院入口| av福利片在线观看| 一区二区三区免费毛片| 网址你懂的国产日韩在线| 丝袜美腿在线中文| 一个人看的www免费观看视频| 日韩av在线大香蕉| 国产成+人综合+亚洲专区| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 757午夜福利合集在线观看| 久久6这里有精品| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产伦人伦偷精品视频| 无限看片的www在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| www日本在线高清视频| 亚洲国产精品成人综合色| 成年版毛片免费区| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 午夜两性在线视频| 日韩欧美精品免费久久 | 亚洲成人免费电影在线观看| 成年人黄色毛片网站| 国产免费一级a男人的天堂| 久99久视频精品免费| 欧美又色又爽又黄视频| 色视频www国产| 在线视频色国产色| 首页视频小说图片口味搜索| 久久精品国产自在天天线| 日本在线视频免费播放| 日韩欧美三级三区| 一级毛片女人18水好多| 色综合站精品国产| 搡老熟女国产l中国老女人| 午夜亚洲福利在线播放| 天天一区二区日本电影三级| 天天躁日日操中文字幕| 久久香蕉精品热| 美女cb高潮喷水在线观看| 色哟哟哟哟哟哟| 国产美女午夜福利| 久久久久亚洲av毛片大全| 成年免费大片在线观看| 美女免费视频网站| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 少妇丰满av| 精品久久久久久久久久久久久| 丰满人妻一区二区三区视频av | 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 在线视频色国产色| 校园春色视频在线观看| 草草在线视频免费看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 国产高清三级在线| 久久亚洲精品不卡| 国内精品久久久久久久电影| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 午夜福利成人在线免费观看| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 精品一区二区三区人妻视频| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲精品一区av在线观看| 久久草成人影院| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产在线精品亚洲第一网站| 久久精品国产自在天天线| 午夜久久久久精精品| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产精品爽爽va在线观看网站| 久久久久免费精品人妻一区二区| 精品免费久久久久久久清纯| 日本熟妇午夜| 最后的刺客免费高清国语| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 午夜精品久久久久久毛片777| 成人国产一区最新在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 国产精品免费一区二区三区在线| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲av美国av| 丁香六月欧美| 嫩草影院精品99| 日韩精品中文字幕看吧| 一个人观看的视频www高清免费观看| 黄色日韩在线| 一本一本综合久久| 亚洲精品在线观看二区| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲成人中文字幕在线播放| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 欧美bdsm另类| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲内射少妇av| 一区二区三区国产精品乱码| av在线天堂中文字幕| 日韩国内少妇激情av| 男女视频在线观看网站免费| 国产精品亚洲一级av第二区| 成人av在线播放网站| 午夜福利18| 日韩欧美在线二视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产高清三级在线| 欧美性猛交黑人性爽| 欧美+日韩+精品| 精品久久久久久久末码| 国产99白浆流出| 免费在线观看成人毛片| 一a级毛片在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 久久久国产精品麻豆| 少妇熟女aⅴ在线视频| 99riav亚洲国产免费| 午夜福利高清视频| 少妇的丰满在线观看| 免费av毛片视频| 国产探花在线观看一区二区| 深爱激情五月婷婷| 国产黄片美女视频| 精品一区二区三区视频在线 | 国内精品久久久久久久电影| 成人三级黄色视频| av黄色大香蕉| 丰满乱子伦码专区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 久久久久国内视频| ponron亚洲| 欧美一级毛片孕妇| 国产精品一及| 亚洲成av人片在线播放无| 99久久无色码亚洲精品果冻| 人妻夜夜爽99麻豆av| 美女高潮的动态| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲人成网站高清观看| 90打野战视频偷拍视频| 欧美精品啪啪一区二区三区|