基于拉曼光譜的鉛致肝細胞生物分子變化研究

邢 鈺,龐偉毅,徐 笠

基于拉曼光譜的鉛致肝細胞生物分子變化研究

邢 鈺1,2,龐偉毅2,徐 笠1*

(1.北京市農(nóng)林科學院質(zhì)量標準與檢測技術研究所,北京 100097；2.桂林醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院,廣西 桂林 541199)

利用拉曼光譜技術采集不同鉛離子暴露時間(0.5, 1.5, 3, 6, 12, 24h)、暴露濃度(0.05, 0.1, 0.5, 1, 5mg/L)下HepG2細胞的光譜數(shù)據(jù),欲探究在不同鉛暴露條件下肝細胞的分子變化及其相關機制.研究結果發(fā)現(xiàn),在不同條件下各組細胞的光譜形態(tài)基本相同,但部分特征峰的吸光度強度存在差異.經(jīng)多元統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),除6h外,同一暴露時間下不同暴露濃度細胞的光譜數(shù)據(jù)在LD1上均存在離散趨勢,并在暴露24h時最明顯.細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸、類胡蘿卜素、碳水化合物等生物分子的特征峰表現(xiàn)出明顯差異,但不同類型生物分子發(fā)生顯著變化的時間并不相同.由此可見鉛暴露可損傷肝細胞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸、類胡蘿卜素的結構并影響其正常功能,這種毒性效應呈劑量-效應關系,且隨暴露時間的增加而增加.本研究說明拉曼光譜可以實現(xiàn)鉛對肝細胞生物分子變化的相關檢測,這不僅為之后的細胞毒理研究提供了新的思路,同時也為環(huán)境污染物的安全評價提供了理論依據(jù).

鉛；拉曼光譜；肝細胞損傷；生物分子；多變量分析

鉛是地殼中含量最豐富的重金屬元素之一,在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用.也正因如此,鉛是人類生活環(huán)境中危害最嚴重的重金屬之一,在我國污染程度位居前列,再加上兒童對鉛毒性的高敏感性,其對人體危害的影響更是受到廣泛關注[1-3].肝臟是機體消化系統(tǒng)中起新陳代謝作用的重要器官,它不僅是鉛在機體內(nèi)代謝的重要場所,也是其毒性作用的靶器官之一.鉛在肝臟中蓄積,會引發(fā)肝腫大、膽囊壁增厚、肝功能異常等病理變化,甚至還可能誘導癌癥發(fā)生[4].鉛致肝毒性的主要機制包括氧化損傷、超微結構改變、線粒體損傷、DNA損傷等[5].

受方法限制,傳統(tǒng)的細胞毒性研究在分析之前需要進行復雜的預處理工作,這往往會破壞細胞結構,無法提供細胞內(nèi)化學成分的空間位置分布信息.同時,利用傳統(tǒng)方法也很難在整體的測量中區(qū)分低濃度毒性物質(zhì)暴露引起的物質(zhì)成分的微小變化.因此,目前鉛對肝細胞內(nèi)生物分子改變的直觀證據(jù)還亟待研究.

作為生物醫(yī)學領域中較為熱門的一種技術,拉曼光譜可以通過檢測組織、細胞內(nèi)化學鍵震動情況提供生物分子構成成分、構象、構型的變化信息[6].通過對組織、細胞樣本的光譜數(shù)據(jù)進行分析可以系統(tǒng)的表征外界刺激脅迫下生物分子的變化情況,進而可以在生物分子水平深入理解并評價其毒性效應.因此,本研究擬通過顯微共聚焦拉曼光譜檢測研究鉛對肝細胞生物分子變化的影響,并探討其毒性作用機制,為重金屬的安全評價提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

PbCl2(99.999%, Sigma-Aldrich,Germany)為粉末狀固體,使用電子天平準確稱量0.01g,充分溶解于100μL DMSO(Solarbio,China)中,將溶有PbCl2的DMSO溶液轉移至容量瓶內(nèi),向容量瓶內(nèi)加入MEM-EBSS培養(yǎng)基(國家實驗細胞資源共享平臺,中國)定容至100mL,獲得濃度為100mg/L的母液,轉移至棕色儲液瓶中存放待用.在實驗開始后按照實驗需求用MEM-EBSS培養(yǎng)基進行梯度稀釋,配制暴露液.

1.2 細胞培養(yǎng)與染毒處理

HepG2細胞(國家實驗細胞資源共享平臺,中國)采用含有10%胎牛血清(Gibco,thermo fisher scientific,USA)、1%非必需氨基酸、1%丙酮酸鈉的MEM-EBSS培養(yǎng)基,放置在37℃、5% CO2、相對濕度為95%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).

本研究按照暴露時間將HepG2細胞分為6組,即0.5h組、1.5h組、3h組、6h組、12h組以及24h組.每個暴露組包含6個暴露濃度,分別為0, 0.05, 0.1, 0.5, 1和5mg/L,每個暴露濃度均設置3個平行樣本.實驗前,取對數(shù)生長期的HepG2細胞以1′106個/瓶的密度接種于底面積為25cm2的培養(yǎng)瓶內(nèi),并向每個培養(yǎng)瓶中加入5mL完全培養(yǎng)基,重新置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).24h后,將原培養(yǎng)基倒除,用1′DPBS清洗2次,加入5mL含不同PbCl2濃度的暴露液(空白對照加入無PbCl2的MEM-EBSS新鮮培養(yǎng)基),重新置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).既定暴露時間結束后倒除培養(yǎng)基,用1′DPBS清洗2次,用0.05%的胰蛋白酶消化5min,并用完全培養(yǎng)基重懸細胞懸液,1000r/min離心5min,棄上清液,加入10mL固定液(90% DPBS與10%甲醛),搖勻后在4℃冰箱內(nèi)靜置12h.靜置后將細胞懸液以2000r/min離心5min,棄上清液,加入1mL超純水,混勻后以2000r/min離心5min,棄上清液,再次加入1mL超純水,混勻后以2000r/min離心5min,最后加入100 μL的超純水吹打混勻滴在鋁箔上待其自然風干后進行后續(xù)檢測.

1.3 拉曼光譜測定

采用激光共聚焦顯微拉曼光譜儀(Thermo Fisher Scientific ,USA)采集染毒實驗后HepG2細胞的光譜數(shù)據(jù).測樣前對激光共聚焦拉曼光譜儀進行光路準直、分光計校準與激光器激發(fā)波長的校準,以保證每次測量環(huán)境相同.實驗時采用100倍物鏡,激光器波長設置為780nm,激光功率設為16mW,光柵為400lines/mm,采集的拉曼位移區(qū)間為500～ 2000cm-1,樣品掃描中每個樣品均隨機選取16個采樣點采集光譜數(shù)據(jù),每個采樣點曝光4次,單次曝光時間為10s,取4次曝光所獲數(shù)據(jù)的平均值作為該點最終光譜數(shù)據(jù).采集過程中由OMNIC軟件自動對熒光背景與宇宙射線進行修正.

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

1.4.1 光譜數(shù)據(jù)預處理 在本實驗中,所有原始數(shù)據(jù)使用Matlab R2020B的內(nèi)置程序進行預處理,主要包括haar小波去噪、剪切拉曼位移區(qū)間至900～1800cm-1、基線校正與矢量歸一化[7-8].

1.4.2 統(tǒng)計分析方法 本實驗通過Matlab R 2020B軟件對經(jīng)過預處理的數(shù)據(jù)進行多變量分析[8].由于主成分分析(PCA)是一種無監(jiān)督的降維方法,僅從PCA的結果很難進一步分析各組的差異[9].因此,在PCA的基礎上,運用線性判別分析(LDA)將所獲結果進行有監(jiān)督的降維,體現(xiàn)最好的分類性能.PCA與LDA聯(lián)用不僅可以降低原始數(shù)據(jù)維度,提升識別各組間差異的精確性,同時還可改善LDA過度擬合的不足.多變量分析的處理結果最后導入Origin 2021中進行可視化處理,最終以得分圖、載荷圖顯示.運用Graphpad prism 8.0進行Kruskal-Wallis檢驗與Dunnett’s post hoc tests檢驗分析各處理組在差異貢獻軸(LD)上的差異.

2 結果與討論

2.1 平均拉曼光譜譜圖比較

細胞樣品不同采樣點的分布可能會影響所測得的光譜數(shù)據(jù),為盡可能減少樣品不均對光譜數(shù)據(jù)產(chǎn)生的干擾,本研究采用多點采集分析的方法,即在各組別下,每個暴露濃度均包含3個平行樣品,每個平行樣品選取16個采樣點,共計48個采樣點,取48個采樣點的平均光譜數(shù)據(jù)作為最終光譜數(shù)據(jù)進行預處理及后續(xù)統(tǒng)計分析.如圖1所示,各個暴露時間下不同鉛離子暴露濃度處理的HepG2細胞具有相似走勢的平均拉曼光譜,并有多個形態(tài)相近的譜峰.

圖1 不同條件下HepG2細胞的平均拉曼光譜

2.2 拉曼光譜的多元統(tǒng)計分析

本研究首先對光譜數(shù)據(jù)進行PCA分析,從每個光譜數(shù)據(jù)中提取20個主成分(包含原始數(shù)據(jù)集內(nèi)95%以上的變量信息,可替代原始變量進行LDA分析),將提取出的主成分數(shù)據(jù)進行LDA分析.LDA分析所形成的新特征空間內(nèi),可以實現(xiàn)不同類(不同濃度處理組)之間的方差最大化,而類內(nèi)之間的方差最小化,即同一類的數(shù)據(jù)關系更加緊密,形成一個個集群.而群集與群集之間的距離可代表不同處理組之間相似度的高低.而LDs是降維后新形成的特征變量,對組間差異的貢獻從LD1向下逐漸降低.因此往往用LD1與LD2作為主要差異貢獻因子進行可視化,以觀察不同類別之間的差異.圖2A-F分別展示了不同鉛離子暴露濃度的HepG2細胞在暴露0.5～24h后光譜數(shù)據(jù)在LD1與LD2上的得分,即細胞內(nèi)生物大分子的變化情況.圖中每個點代表一個圖譜,點的顏色代表其所屬的類別[10],按照類別不同繪制不同暴露濃度組的95%置信橢圓.

圖2 不同暴露條件下HepG2 細胞拉曼光譜PCA-LDA二維得分

可以觀察到除0.5、6h外(圖2A、D),隨著暴露濃度的增加,各集群與對照組集群之間的離散情況更加明顯(圖2B、C、E、F),暴露時長為24h時,各集群在LD1上的離散情況最為明顯.由此可以推測鉛的肝細胞毒性與鉛離子處理濃度之間可能存在著劑量-效應關系,以往的研究結果對這一推測提供了有力的證據(jù)[11].而6h(圖2D)組內(nèi)不同暴露濃度處理下的HepG2細胞之所以無顯著差異可能是由于細胞在應激狀態(tài)下產(chǎn)生興奮效應,并進行自我修復的結果[12].此外,還觀察到在0.5h組(圖2A),暴露濃度為0.05mg/L的細胞與空白對照之間具有較大的重疊部分,其他暴露濃度雖與空白對照完全分離但各組之間存在集群重疊.隨暴露時間的增加,暴露濃度為0.05mg/L的細胞與空白對照之間的差異逐漸明顯,同時不同暴露濃度下HepG2 細胞之間的差異逐漸增大,并在暴露24h時基本分離(圖2F).由此可以推斷細胞內(nèi)生物大分子的變化情況除與鉛離子暴露濃度相關外與鉛離子暴露時間也存在明顯關聯(lián),這也與現(xiàn)有的研究結果一致[13].由于LD1是最主要的特征變量,對組間差異的貢獻最大,因此,后續(xù)將LD1上各組的得分值進行統(tǒng)計學分析,來驗證圖2中各組的分離,由LD1得分繪制的箱線圖如圖3A-F所示(不同鉛離子濃度處理組均與對照組進行比較,ns表示>0.05,*表示<0.05,**表示<0.01,***表示<0.001).在0.5h(圖3A)、1.5h(圖3B)、3h(圖3C)時最低濃度組(0.05mg/L)雖然已經(jīng)表現(xiàn)出與對照組的分離趨勢,但與對照組之間的差異并無顯著性.當暴露時間超過6h時(圖3D-F),最低濃度組(0.05mg/L)與對照組之間出現(xiàn)了顯著性差異,這說明隨著暴露時間的增長,鉛離子對肝細胞的損傷作用逐漸增大.而0.5～24h(圖3A-F)其他各暴露濃度組與對照組之間均存在極顯著的差異,且在1.5, 3, 12, 24h時(圖3B、C、E、F)暴露濃度與生物分子變化程度之間具有線性相關的關系.針對各組在LD1得分的分析結果進一步驗證了圖2中所展示的集群分離結果,通過對LD1載荷的分析可以進一步聚焦不同暴露條件下鉛離子對HepG2細胞生物分子的具體影響.LD1載荷的數(shù)值大小代表LD1作為新的特征變量時,各個原始變量(光譜的波數(shù))與LD1之間的相關系數(shù).載荷的絕對值越大,代表該原始變量與LD1的相關性越高.圖4A-F為不同暴露時間下的LD1載荷圖,展示了不同暴露時間下光譜波數(shù)對LD1上不同暴露組與對照組之間差異的貢獻情況,并標注了對差異貢獻最大的前6個特征峰.

圖3 不同暴露條件下HepG2 細胞拉曼光譜PCA-LDA一維得分圖

如圖4A所示,暴露時間為0.5h時,代表不同暴露濃度處理下HepG2細胞差異的特征峰主要歸屬于蛋白質(zhì)與DNA,次要歸屬于脂質(zhì),主要包括996cm-1(脫氧核糖)、1006cm-1(對稱環(huán)呼吸;苯丙氨酸)、1224cm-1(β折疊;酰胺Ⅲ)、1430cm-1(CH2剪切振動;脂質(zhì))、1465cm-1(CH3反對稱彎曲;脂質(zhì))、1646cm-1(無規(guī)卷曲;蛋白質(zhì));如圖4B所示,暴露時間為1.5h時,貢獻主要差異的特征峰以脂質(zhì)相關為主,次要歸屬于蛋白質(zhì)與DNA,包括996cm-1(脫氧核糖)、1006cm-1(對稱環(huán)呼吸;苯丙氨酸)、1129cm-1(C-C拉伸振動;脂質(zhì))、1350cm-1(CH3變形振動;脂質(zhì))、1430cm-1(CH2剪切振動;脂質(zhì))、1463cm-1(CH3反對稱彎曲;脂質(zhì));如圖4C所示,暴露時間為3h時,貢獻主要差異的特征峰與1.5h相似,仍以脂質(zhì)相關為主,次要歸屬于蛋白質(zhì)和DNA,包括998cm-1(脫氧核糖)、1008cm-1(對稱環(huán)呼吸;苯丙氨酸)、1132cm-1(C-C拉伸振動;脂質(zhì))、1432cm-1(CH2剪切振動;脂質(zhì))、1465cm-1(CH3反對稱彎曲;脂質(zhì))、1661cm-1(C=O振動β轉角;酰胺Ⅰ);如圖4D所示,暴露時間為6h時,蛋白質(zhì)貢獻了主要差異,特征峰包括1267cm-1(β轉角;酰胺Ⅲ)、1528cm-1(C=C伸縮振動;類胡蘿卜素)、1559cm-1(色氨酸)、1605cm-1(酪氨酸)、1633cm-1(β折疊;酰胺Ⅰ)、1659cm-1(C=O振動β轉角;酰胺Ⅰ);如圖4E所示,暴露時間為12h時,貢獻主要差異的特征峰主要歸屬于蛋白質(zhì)和脂質(zhì),次要歸屬于DNA,包括999cm-1(脫氧核糖)、1008cm-1(對稱環(huán)呼吸;苯丙氨酸)、1433cm-1(CH2剪切振動;脂質(zhì))、1468cm-1(CH3反對稱彎曲;脂質(zhì))、1644cm-1(無規(guī)卷曲;蛋白質(zhì))、1662cm-1(C=O振動β轉角;酰胺Ⅰ);如圖4F所示,暴露時間為24h時,與12h相似,蛋白質(zhì)與脂質(zhì)貢獻了主要差異,而DNA貢獻的差異較低,特征峰包括998cm-1(脫氧核糖)、1007cm-1(對稱環(huán)呼吸;苯丙氨酸)、1131cm-1(C-C拉伸振動;脂質(zhì))、1432cm-1(CH2剪切振動;脂質(zhì))、1466cm-1(CH3反對稱彎曲;脂質(zhì))、1647cm-1(無規(guī)卷曲;蛋白質(zhì)).綜合上述結果,當鉛離子對HepG2細胞產(chǎn)生毒性作用時,主要會對HepG2細胞的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)造成較為嚴重的影響,其次也會對DNA產(chǎn)生一定損傷作用.但鉛離子的毒性作用會因暴露濃度與暴露時間的改變,略有不同.

圖4 不同暴露條件下HepG2 細胞LD1載荷

從蛋白質(zhì)分子來說,任何暴露時間下蛋白質(zhì)分子受濃度影響變化均較大.在0.5h時,可以看到涉及酰胺Ⅲ的β折疊、蛋白質(zhì)的無規(guī)卷曲以及苯丙氨酸等的特征峰,這些特征峰在之后的暴露時間內(nèi)也可以觀察到.酰胺Ⅲ的折疊結構、蛋白質(zhì)的無規(guī)卷曲結構均與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性息息相關.蛋白質(zhì)分子相關特征峰的出現(xiàn)說明鉛離子已經(jīng)對肝細胞的蛋白質(zhì)結構產(chǎn)生影響.Belatik等[14]證實鉛可通過-OH, -NH2和-SH 等與蛋白質(zhì)結合,如含有琉基的抗氧化酶、還原型谷胱甘肽等,這不僅會使蛋白質(zhì)結構產(chǎn)生影響,還會使蛋白質(zhì)功能異常.其他研究也證實鉛離子可改變蛋白酶活性并引起細胞氧化應激反應[15].在暴露6h時(圖4D),可以觀察到不同鉛離子濃度處理組在色氨酸(～1559cm-1)與酪氨酸(～1605cm-1)等氨基酸相關特征峰上與空白對照之間的差異逐漸增大.Dowd等[16]表明較高濃度的鉛離子會對色氨酸與酪氨酸的分泌產(chǎn)生抑制作用,這一觀點同樣在本研究的實驗結果中得到證實. 類胡蘿卜素在細胞生理活動中具有十分重要的作用,這主要體現(xiàn)在其具有較強的抗氧化作用,能夠參與到炎癥反應與氧化應激之中.有文獻表明,在鉛離子的刺激下,細胞為減少氧化活性物質(zhì)的氧化損傷會增加類胡蘿卜素的分泌[17].從圖4D中還可以發(fā)現(xiàn)6h時出現(xiàn)了類胡蘿卜素(～1528cm-1)相關特征峰的顯著變化,但在12和24h的暴露中該特征峰變化不再顯著.這可說明6h時,細胞抗氧化防御功能發(fā)揮到最大值,類胡蘿卜素等抗氧化劑分泌增加.隨著暴露時間增長,活性氧含量不斷上升增加,細胞內(nèi)核酸、蛋白等生物大分子均出現(xiàn)功能與構象異常,細胞抗氧化能力下降,類胡蘿卜素等抗氧化劑的分泌受到抑制.

從脂質(zhì)分子來說,自暴露0.5h(圖4A)開始脂質(zhì)相關特征峰的吸收強度發(fā)生變化,1.5h(圖4B)之后脂質(zhì)貢獻的差異增大,主要峰位包括C-C拉伸振動(～1129cm-1)、CH2剪切振動(～1430cm-1)、CH3彎曲振動(～1350cm-1)等.脂質(zhì)相關振動峰的變化主要與細胞膜的脂質(zhì)雙分子層有關,該特征峰的出現(xiàn)說明在鉛暴露下細胞膜脂質(zhì)雙分子層亞甲基鏈結構有序性隨鉛離子濃度的增加而受到破壞,細胞膜的流動性降低.既往研究鉛離子可激活NADPH氧化酶,增加細胞內(nèi)活性氧的生成,通過過氧化作用破壞細胞內(nèi)的脂質(zhì)分子,從而導致細胞膜與細胞器膜的完整性受損,膜功能出現(xiàn)異常[18].還有研究發(fā)現(xiàn)鉛離子還可直接與細胞內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶等抗氧化物質(zhì)結合,消耗細胞內(nèi)的抗氧化物,從而破壞細胞的抗氧化防御系統(tǒng),使細胞出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化等異常[19].

從DNA分子來說,暴露0.5h(圖4A)及以上時,代表脫氧核糖物質(zhì)(～996cm-1)的特征峰出現(xiàn)差異,這說明隨著暴露濃度的增加,鉛離子對細胞遺傳物質(zhì)逐漸產(chǎn)生損傷作用.有研究發(fā)現(xiàn)氧化應激可通過修改堿基對與氨基酸序列等途徑破壞細胞DNA的分子結構,導致DNA鏈的斷裂[20].此外Shilpa[21]在研究中觀察到鉛離子可以直接與DNA結合并引起DNA損傷.

3 結論

3.1 利用拉曼光譜對鉛暴露導致的肝細胞生物分子改變進行分析發(fā)現(xiàn)鉛離子對肝細胞生物分子的損傷呈劑量-效應關系,同時與暴露時間呈正相關.

3.2 運用多元統(tǒng)計分析的手段對拉曼光譜數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)0.5h時,不同暴露濃度組之間的差異主要在蛋白質(zhì)與DNA,次要在脂質(zhì);1.5 與3h時,不同暴露濃度組之間的差異主要在脂質(zhì),次要在蛋白質(zhì)與DNA;6h時不同暴露濃度組之間的差異主要在蛋白質(zhì);12與24h時不同暴露濃度組之間的差異主要在蛋白質(zhì)與脂質(zhì),次要在DNA.

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XING Yu1,2, PANG Wei-yi2, XU Li1*

(1.Institute of Quality Standard and Testing Technology, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097, China；2.School of Public Health, Guilin Medical University, Guilin 541199, China)., 2022,42(5)：2387～2394

In this study, we employed Raman spectroscopy to explore the bio-molecular alterations in HepG2cells following exposure to lead with concentrations of 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5mg/L, which took different time periods (0.5, 1.5, 3, 6, 12, 24h) respectively. Raman spectra correlated to cellular biological information was collected via Raman microscopy to further investigate the bio-molecular alterations of liver cells community following lead exposure. It showed that although the spectra in each treatment group were similar, certain diversities of the peaks positions and the absorption intensities were observed. Additionally, multivariate analysis was applied to the spectral dataset to determine the biological changes underlying the exposure, and it showed that the spectral data of cellular groups following exposures at different concentrations with the same exposure time showed a discrete trend on LD1, and it was significantly observed in 24-h exposure. The results, as well, indicated that lead exposure can damage the structure of liver cell proteins, lipids, nucleic acids, carotenoids, carbohydrates and affect their normal functions. These cellular responses are dose-related and increases with exposure time. In conclusion, our study suggests that Raman spectroscopy is proper tool with ability to detect the biological molecular changes in liver cells following lead exposure. It can not only provide a new assay in toxicology research, but also provides a theoretical basis for rapid safety evaluation of environmental pollutants.

lead；Raman spectroscopy；hepatocyte damage；biomolecules；multivariate analysis

X503.1

A

1000-6923(2022)05-2387-08

邢 鈺(1997-),女,黑龍江七臺河人,碩士研究生,主要從事環(huán)境污染物的健康效應研究.發(fā)表論文2篇.

2021-10-14

北京市優(yōu)秀人才青年骨干項目(201801001)

* 責任作者, 副研究員, xuliforever@163.com