薯蕷皂苷元對心肌缺血再灌注損傷大鼠細胞凋亡的影響及相關(guān)機制的分析

蔣先訓，張凱，張鷹

心肌缺血再灌注損傷（MIRI）指在一段時間的缺血后，血液供應(yīng)盡管恢復到心臟組織，但同時對心肌造成額外損害的組織損傷[1-2]。炎癥是心肌再灌注引起的微血管損傷和功能障礙的關(guān)鍵特征[3]。NOD樣受體蛋白3（NLRP3）炎性小體為由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ASC）和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶1（Caspase-1）組裝的一種分子復合物[4-5]，在心肌缺血損傷過程中，NLRP3 炎性小體被激活，加劇炎癥反應(yīng)。已有報道藥物可通過抑制NLRP3 炎性小體介導的細胞凋亡和炎癥反應(yīng)減輕MIRI[6]。薯蕷皂苷元是一種植物源性皂苷元，可從野生山藥、葫蘆巴、大豆等多種植物中分離得到，具有降血糖、降血脂、抗炎和抗氧化等作用[7]。Ebrahimi 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷元可通過線粒體腺嘌呤核苷三磷酸敏感性鉀離子通道，減輕心肌再灌注損傷引起的炎癥反應(yīng)，表明薯蕷皂苷元對MIRI 有治療作用。但薯蕷皂苷元是否還能通過其他機制發(fā)揮對MIRI 的治療作用目前尚不清楚。因此，本研究通過構(gòu)建MIRI 大鼠模型，探究薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠的藥效作用，并初步分析其對NLRP3/caspase-1 通路的影響，進一步完善薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠，6 周齡，200～220 g，購自南華大學，許可證號：SCXK(湘) 2020-0003，常規(guī)飼養(yǎng)1 周后進行實驗。本研究動物實驗方案經(jīng)南華大學衡陽醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院倫理委員會批準，并按照動物護理和使用的指導方針進行的。

1.2 主要試劑

薯蕷皂苷元標準品（純度≥98%，SD8360）和2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色液（G3005）購自北京索萊寶生物科技有限公司。蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（C0105）和TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（C1082）購自上海碧云天生物有限公司。白細胞介素-6（IL-6），白細胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒購自南京建成生物工程研究所。NLRP3 一抗、Caspase-1 一抗、ASC 一抗、IL-1β 一抗及二抗購自賽信通（上海）生物試劑有限公司。

1.3 實驗儀器

包括生物信息收集系統(tǒng)（BL-410，日本Nihon Kohden 公司）；小動物呼吸機（DH-140，浙江大學醫(yī)療器械廠）；顯微鏡（E400，日本Nikon 公司）；石蠟切片機（HHL210，德國Leica 公司）；電泳儀（DYY-6C，北京六一儀器廠）；蛋白凝膠成像儀（AlphaImager HP，美國 Alpha Inotech 公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1動物模型制備

根據(jù)參考文獻[9]的方法，采用左前降支結(jié)扎模型建立MIRI 大鼠模型。將大鼠麻醉，以仰臥固定在手術(shù)臺上，并連接標準的導聯(lián)心電圖。切開頸部中間并連接動物呼吸機以進行通氣（呼吸頻率60 次/min，潮氣量8.0 ml，頻率5：4）。氣管內(nèi)插管后，將左頸總動脈分離并置入導管中，并通過壓力傳感器連接到生物信息收集系統(tǒng)。進行左胸廓切開術(shù)和心包切開術(shù)以暴露心臟。將左前降支臨時結(jié)扎30 min，以達到局部缺血。通過心電圖ST 段抬高或移位和心臟缺血區(qū)（前心室壁和心尖部）顏色的改變，證實左前降支結(jié)扎成功。然后再灌注120 min，誘發(fā)心肌缺血再灌注損傷。假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎。

1.4.2動物分組及給藥

將造模成功的72 只SD 大鼠，按照隨機數(shù)字表法分成MIRI 組、薯蕷皂苷元低、中、高劑量組（分別給予50 mg/kg、75 mg/kg、100 mg/kg 的薯蕷皂苷元），每組18 只。再另取18 只大鼠做假手術(shù)組處理。分別于造模后給予薯蕷皂苷元低、中、高劑量組灌胃[10]，生理鹽水制備不同濃度的薯蕷皂苷元，灌胃體積為10 ml/kg，每日1 次，連續(xù)4 周。假手術(shù)組和MIRI 組給予等體積生理鹽水灌胃。

1.4.3心臟功能測定

記錄每組大鼠在不同時間段的心臟血液動力學參數(shù)。大鼠右側(cè)頸總動脈插管至左心室，并連接壓力傳感器通過BL-410 生物信息收集系統(tǒng)，記錄并分析左心室收縮壓（LVSP），左心室舒張末期壓力（LVEDP），左心室射血分數(shù)（LVEF），短軸縮短率（FS）及最大收縮/舒張期壓力變化速率（±dp/dtmax）。

1.4.4心肌梗死面積的測量

從每組大鼠隨機選擇6 只，再次結(jié)扎左前降支，左側(cè)頸總動脈注入1%伊文思藍1 ml。取出心臟，用預冷生理鹽水反復沖洗，在-70℃快速冷凍，切成約1～2 mm 厚的薄片，置于1% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液中，37℃水浴孵育15～30 min，10%甲醛固定10 min。拍攝照片，使用Image Pro Plus 軟件計算左心室梗死面積百分比。

1.4.5心肌組織病理學檢測

每組隨機選取6 只大鼠，將心臟組織置于10%福爾馬林中固定24 h，分級脫水，切成5 μm 厚度的切片，使用HE 染色試劑盒對切片進行染色，并于光學顯微鏡下分析心肌組織的形態(tài)學變化。

1.4.6檢測心肌細胞凋亡指數(shù)

利用TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒對心肌細胞的凋亡情況進行檢測。操作步驟為：取1.4.5 制備的石蠟切片，脫蠟，蛋白酶消化20 min 后清洗，加入TUNEL 反應(yīng)混合液，于37℃下封閉30 min，加底物顯色，HE 復染，脫水，封片。觀察并計算：凋亡細胞率=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.4.7檢測血清炎性因子含量

將收集的血清根據(jù)ELISA 試劑盒說明書操作，檢測各組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 的含量。

1.4.8大鼠心肌組織中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β 蛋白表達水平測定

將每組剩余的6 只大鼠的心臟取出，液氮速凍研磨，加入裂解液制成勻漿，提取總蛋白，使用二辛可寧酸（BCA）試劑盒定量后，經(jīng)SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉加一抗（NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、β-肌動蛋白，稀釋倍數(shù)1：500），4℃過夜孵育后清洗，加二抗，在室溫下孵育2 h，清洗曝光顯色，分析條帶的灰度值。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25 軟件進行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差表示。數(shù)據(jù)首先用單因素方差分析進行分析，然后進行后處理的Bonferroni 檢驗。P＜0.05 被認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠心功能的影響（表1）

表1 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠心功能的影響（,n=18）

表1 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠心功能的影響（,n=18）

注：MIRI：心肌缺血再灌注損傷；LVSP：左心室收縮壓；LVEDP：左心室舒張末期壓力；LVEF：左心室射血分數(shù)；FS：短軸縮短率；+dp/dtmax：最大收縮期壓力變化速率；-dp/dtmax：最大舒張期壓力變化速率。與假手術(shù)組比*P＜0.05；與MIRI 組比△P＜0.05；與薯蕷皂苷元低劑量組比▲P＜0.05；與薯蕷皂苷元中劑量組比#P＜0.05。1 mmHg=0.133 Kpa

與假手術(shù)組相比，MIRI 組大鼠LVEDP 顯著升高（P＜0.05），LVSP、LVEF、FS 及±dp/dtmax顯著降低（P均＜0.05）；與MIRI 組相比，薯蕷皂苷元低、中、高各劑量組大鼠LVEDP 均顯著降低（P均＜0.05），LVSP、LVEF、FS 及±dp/dtmax均顯著升高（P均＜0.05）。

2.2 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠心肌梗死面積的影響（表2）

表2 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠心肌梗死面積的影響（,n=6）

表2 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠心肌梗死面積的影響（,n=6）

注：MIRI：心肌缺血再灌注損傷。與假手術(shù)組比*P＜0.05；與MIRI 組比△P＜0.05；與薯蕷皂苷元低劑量組比▲P＜0.05；與薯蕷皂苷元中劑量組比#P＜0.05

MIRI 組大鼠心肌梗死面積明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05）,而經(jīng)過不同劑量薯蕷皂苷元干預的大鼠心肌梗死面積均顯著降低（P＜0.05）。

2.3 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠心肌組織病理變化的影響

MIRI 組大鼠心肌組織局部變性壞死，肌纖維紊亂、斷裂溶解，間質(zhì)充血水腫，并伴有炎細胞浸潤；薯蕷皂苷元各劑量組隨劑量增加而心肌損傷依次減輕，其中薯蕷皂苷元高劑量組大鼠心肌組織中肌纖維排列整齊，部分肌束間隙增寬，間質(zhì)輕度腫脹，僅少量炎性細胞浸潤，見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織形態(tài)學變化（×400）

2.4 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)的影響（表3）

表3 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)的影響（,n=6）

表3 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)的影響（,n=6）

注：MIRI：心肌缺血再灌注損傷。與假手術(shù)組比*P＜0.05；與MIRI 組比△P＜0.05；與薯蕷皂苷元低劑量組比▲P＜0.05；與薯蕷皂苷元中劑量組比#P＜0.05

與假手術(shù)組相比，MIRI 組大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)顯著升高。與MIRI 組相比，薯蕷皂苷元低、中、高劑量干預組大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)均顯著降低[（49.49±6.27）% vs.（37.56±4.98）%，（49.49±6.27）% vs.（28.35±3.64）%，（49.49±6.27）%vs.（16.93±2.25）%，P均＜0.05]。

2.5 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠血清中炎性因子水平的影響（表4）

表4 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠血清中炎性因子水平的影響（pg/ml，±s，n=12）

MIRI 組大鼠血清中炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α 水平明顯高于假手術(shù)組（P均＜0.05），而經(jīng)薯蕷皂苷元低、中、高劑量干預后，IL-6、IL-1β、TNF-α 水平顯著降低（P均＜0.05）。

2.6 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠心肌組織中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β 蛋白表達水平的影響（圖2、表5）

表5 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠心肌組織中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β 蛋白表達水平的影響（,n=6）

表5 薯蕷皂苷元對MIRI 大鼠心肌組織中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β 蛋白表達水平的影響（,n=6）

注：MIRI：心肌缺血再灌注損傷；NLRP3：NOD 樣受體蛋白3；Caspase-1：半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶1；ASC：凋亡相關(guān)斑點樣蛋白；IL-1β：白細胞介素-1β；β-actin：β-肌動蛋白。與假手術(shù)組比*P＜0.05；與MIRI 組比△P＜0.05；與薯蕷皂苷元低劑量組比▲P＜0.05；與薯蕷皂苷元中劑量組比#P＜0.05

圖2 各組大鼠心肌組織蛋白免疫印跡條帶圖

與假手術(shù)組相比，MIRI 組大鼠心肌組織中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β蛋白表達水平顯著升高（P均＜0.05）；與MIRI 組相比，薯蕷皂苷元各劑量組大鼠心肌組織中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β 蛋白表達水平顯著降低（P均＜0.05）。

3 討論

MIRI 在世界范圍內(nèi)有嚴重的發(fā)病率和死亡率，發(fā)病機制涉及多種機制的相互作用，包括鈣超載、氧化應(yīng)激損傷、心肌細胞自噬和細胞凋亡等[11-12]。眾所周知，對缺血后炎癥的先天免疫反應(yīng)在MIRI 的病理生理中起著重要作用[13]，但與心臟損傷相關(guān)的機制仍有待于進一步研究。LVEDP 和LVSP 是左心室舒張收縮功能的重要指標，±dp/dtmax反映左心室收縮和舒張期運動速度，受左心室心肌細胞效率的影響[14]。本研究通過建立MIRI 大鼠模型，經(jīng)HE 染色后觀察可發(fā)現(xiàn)，MIRI 大鼠心肌組織局部變性壞死，間質(zhì)充血水腫，并伴有炎細胞浸潤。TTC 法檢測到心肌梗死面積增加，TUNEL 法檢測到心肌細胞凋亡指數(shù)增加，ELISA 結(jié)果顯示血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平升高。BL-410 生物信息收集系統(tǒng)觀察到LVEDP 升高，而LVSP、LVEF、FS 及再灌流期間的±dp/dtmax降低，表明模型建立成功。

薯蕷皂苷元是由藤井和松川于1935 年在山萆薢中首次發(fā)現(xiàn)的，是一種天然的甾體皂甙元[15]。薯蕷皂苷元在傳統(tǒng)醫(yī)學中已被用作膳食補充劑，用于治療高血糖、高脂血癥、炎癥和胃腸道疾病等問題[16]。薯蕷皂苷元可通過上調(diào)CX-43 的表達和激活來減輕心肌缺血/再灌注誘發(fā)的室性心律失常[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與MIRI 組相比，薯蕷皂苷元各劑量組大鼠經(jīng)HE 染色后觀察到心肌損傷明顯減輕，僅少量炎性細胞浸潤，ELISA 結(jié)果也顯示IL-6、IL-1β、TNF-α 等炎性因子水平降低，BL-410 生物信息收集系統(tǒng)檢測的各項心功能指標也明顯逆轉(zhuǎn)，表明薯蕷皂苷元可顯著改善MIRI 大鼠的損傷情況，減少炎癥反應(yīng)及細胞凋亡，改善左心室的泵血效率。

NLRP3 炎性小體激活在MIRI 中起重要作用，當其被激活時，NLRP3 與ASC 形成炎性復合物，從而控制Caspase-1 的激活，并隨后促進促炎性細胞因子（如IL-1β 和IL-18）的分泌，最終導致細胞損傷和死亡[18]。NLRP3 炎性小體可促進心臟微血管內(nèi)皮細胞的心肌缺血再灌注損傷，miR-377-5p 可靶向抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β 信號通路，從而減輕心肌缺血再灌注損傷和缺氧/復氧心肌細胞凋亡[19]。在腦缺血/再灌注損傷大鼠中，D-香芹酮可抑制TLR4/NLRP3 信號通路，減輕腦損傷[20]。在微血管再灌注損傷大鼠中，天麻素亦可通過調(diào)節(jié)NLRP3/Caspase-1 途徑，改善再灌注引起的細胞凋亡[21]。在本研究中，Western blot 結(jié)果發(fā)現(xiàn)心肌組織中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β 蛋白表達水平在MIRI 大鼠中明顯升高，而在薯蕷皂苷元作用下，心肌組織中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β 蛋白表達水平明顯降低，表明薯蕷皂苷元可能通過抑制NLRP3/Caspase-1 通路，減輕MIRI 大鼠的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，薯蕷皂苷元的應(yīng)用可改善MIRI 大鼠的左心功能，減少心肌梗死和細胞凋亡，保護心肌免受缺血再灌注損傷，該作用可能與抑制NLRP3/Caspase-1 信號通路有關(guān)。然而，本研究結(jié)果僅說明減輕MIRI 大鼠的心肌損傷與抑制NLRP3/Caspase-1通路有關(guān)，不能說通過抑制NLRP3/Caspase-1 通路而減輕MIRI 大鼠損傷，后續(xù)將對此方面補充細胞實驗，采用NLRP3 活化的選擇性抑制劑等對缺氧復氧心肌細胞進行相關(guān)研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突