基于電子鼻和HPLC多成分含量分析的焦山楂烘制工藝研究

蔣昊

（天津市第一中心醫(yī)院藥學(xué)部，天津 300192）

山楂是薔薇科山楂屬植物山里紅Cralaegus pinnatifida.Bge.var.major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果實。山楂具有消食健胃、行氣散瘀、化濕降濁的功效，臨床上常以炮制品入藥。山楂的炮制存在多種方法：蒸法、清炒、醋炒、酒炒、姜汁制等，目前多采用清炒法，根據(jù)炒制程度的不同細(xì)分為炒山楂、焦山楂、山楂炭[1]。傳統(tǒng)清炒法常常會受操作人員技術(shù)、投藥量、加熱程度、翻炒頻率等因素影響炮制品的品質(zhì)，導(dǎo)致出現(xiàn)“炮制不及”或“炮制過火”等現(xiàn)象，因此有學(xué)者嘗試以更簡便、且能嚴(yán)格控制加熱溫度和時間的烘制法[2]和微波法[3]來進行山楂炮制新工藝的研究，但相關(guān)報道較少且烘制工藝不規(guī)范。本文借助電子鼻和高效液相色譜法（HPLC）兩種分析技術(shù)，從外觀性狀、氣味和有機酸含量多方面比較烘制焦山楂與清炒焦山楂的異同，通過正交實驗優(yōu)選焦山楂烘制工藝，旨在找到與傳統(tǒng)清炒工藝制備的焦山楂最為接近的烘制工藝，為山楂烘制工藝的進一步規(guī)范提供參考。

1 材料

1.1 試劑與材料 山楂飲片（去核），經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)李天祥教授鑒定為薔薇科山楂屬植物山楂Crataegus pinnatifidaBge.的干燥成熟果實。草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、沒食子酸、原兒茶酸、香草酸、咖啡酸對照品（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%），水為超純水，甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 1260型高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器（美國安捷倫科技有限公司），Hypersil ODS2色譜柱，Heracles II氣相電子鼻和HS-100型自動進樣器（Alpha Soft工作站，Alpha MOS公司），JP-060S型超聲波清洗儀（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司），MSE6.6S-OCE-DM型百萬分之一微量天平（賽多利斯實驗室儀器有限公司），F(xiàn)W100型高速粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 樣品制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取適量草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、沒食子酸、原兒茶酸、香草酸和咖啡酸對照品，用50%甲醇水溶解，配制濃度分別為 240、400、800、640、800、720、40、80、60、60 μg/mL 的混合對照品儲備液，并逐級稀釋成一系列濃度的混合對照品溶液，備用。

2.1.2 炒制焦山楂的制備 取適量凈山楂，置入預(yù)熱適度的炒制容器中，用中火（1 000 w）加熱，翻炒約13 min，得到表面棕褐色、內(nèi)部為黃褐色的焦山楂。根據(jù)2020版《中國藥典》[4]，焦山楂的外觀性狀符合該部藥典規(guī)定。

2.1.3 烘制焦山楂的制備及其正交實驗 每組取凈山楂樣品6份，放入提前預(yù)熱的烘箱中，分別按照正交實驗設(shè)計的烘制溫度、烘制時間、烘制堆疊的層數(shù)進行烘制。正交實驗考察烘制溫度、烘制時間、烘制厚度層數(shù)3個因素，3個水平分別為烘制溫度：160、170、180 ℃；烘制時間：6、8、10 min；烘制厚度層數(shù)：1、2、3 層。

2.1.4 電子鼻樣品制備 取生山楂及各焦山楂炮制品，粉碎，過3號篩，備用。

2.1.5 含量測定樣品制備 取山楂飲片，粉碎后過80目篩，稱取過篩后細(xì)粉1.0 g，加25 mL純水，30℃超聲30 min，4 000 r離心10 min，離心半徑15 cm，取上清液過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2 氣相電子鼻測定

2.2.1 分析參數(shù) 通過前期對進樣體積、振搖溫度、載樣量和振搖時間的單因素考察，建立了生山楂及各焦山楂炮制品的氣相電子鼻的分析參數(shù)。頂空發(fā)生部分：進樣瓶規(guī)格20 mL，載樣量1 g，振搖時間3 min，振搖溫度60℃；進樣部分：進樣體積2 000 μL，進樣速度 125 μL/s，進樣口溫度 70 ℃，進樣持續(xù)時間29 s；捕集阱：初始溫度40℃，分流速度10 mL/min，捕集持續(xù)時間34 s，最終溫度200℃；色譜分離部分：柱溫40℃，程序升溫3.0℃/s，采集時間165 s，檢測器溫度250℃，F(xiàn)ID增益為12。

2.2.2 樣品測定 精密稱取“2.1.4電子鼻樣品制備”項下制備粉末1.0 g置于20 mL頂空進樣瓶中，頂空進樣測定，每組樣品制備3份，平行測定2次，炒制焦山楂和9個烘制工藝的氣味信息圖見圖1。

圖1 電子鼻氣味信息圖Fig.1 Odor information of electronic nose data

2.3 總有機酸測定 按照“2.1.5含量測定樣品制備”項下方法制備提取液，精密吸取濾液6 mL，加水66 mL，加酚酞指示劑3滴，用0.1 mol/L NaOH溶液測定提取液中的有機酸含量。每1 mL的NaOH溶液（0.1 mol/L）相當(dāng)于 6.404 mg的枸櫞酸（C6H8O7）。

2.4 HPLC法測定水溶性有機酸成分

2.4.1 色譜條件 Hypersil ODS2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：0.1%磷酸水溶液（A）：甲醇（B）梯度洗脫（0～10 min，1%～25%B；10～28 min，25%B；28～30 min，25%～1%B；30～35 min，1%B），檢測波長：210 nm，流速：0.8 mL/min，柱溫為 27.5 ℃，進樣量 10 μL。

2.4.2 樣品測定 按照“2.1.5含量測定樣品制備”項下方法制備提取液，每組樣品制備3份，生山楂、炒制焦山楂和烘制焦山楂（工藝8）的液相色譜圖見圖2。

圖2 山楂的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of Crataegus pinnatifida

3 實驗結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

3.1 氣相電子鼻測定

3.1.1 主成份（PCA）分析 作為數(shù)據(jù)降維的常用方法，PCA能夠很好地呈現(xiàn)樣品之間的差異性，并表示出樣品集群和離群的特點。在快速氣相電子鼻中獲得的各焦山楂炮制品的氣相色譜信息，以峰面積作為PCA分析的輸入值，對炒制焦山楂和烘制焦山楂進行分析比較，結(jié)果見圖3。從PCA二維圖中可知主成分1（PC1）和主成分2（PC2）總貢獻率為96.893%，能較好地反映原始數(shù)據(jù)信息。烘制工藝5、6、8、9制備的焦山楂與炒制焦山楂的分布區(qū)域較為接近，而烘制工藝 1、2、3、4、7 制備的焦山楂與炒制焦山楂的分布區(qū)域相距較遠(yuǎn)，說明烘制工藝5、6、8、9制備的焦山楂與炒制焦山楂相似程度更高。

圖3 電子鼻數(shù)據(jù)二維PCA分析圖Fig.3 2D PCA analysis of electronic nose data

3.1.2 軟獨立建模（SIMCA）分析 SIMCA分析是用于對目標(biāo)進行簡單分類與判定的一種分析方法。以炒制焦山楂作為參照，對9個不同烘制工藝制備的焦山楂樣品進行分析判定，結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示烘制工藝5、6、8、9制備的焦山楂被劃入炒制焦山楂的區(qū)域之內(nèi)，而烘制工藝 1、2、3、4、7 制備的焦山楂被劃于區(qū)域之外，與PCA分析結(jié)果一致。說明該方法可將與炒制焦山楂差異較大的烘制工藝焦山楂樣品劃于區(qū)域之外，該模型可在一定程度上實現(xiàn)不同烘制工藝焦山楂與炒制焦山楂相似程度的鑒別與區(qū)分。

圖4 電子鼻數(shù)據(jù)SIMCA分析圖Fig.4 SIMCA analysis of electronic nose data

3.1.3 統(tǒng)計質(zhì)量控制（SQC）分析 以炒制焦山楂組作為參照，對9個不同烘制工藝制備的焦山楂樣品進行分析判定，結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示烘制工藝5、6、8、9制備的焦山楂被劃入炒制焦山楂的區(qū)域之內(nèi)，而烘制工藝 1、2、3、4、7 制備的焦山楂被劃于區(qū)域之外，與PCA和SIMCA的分析結(jié)果一致。說明SQC分析同樣可將與炒制焦山楂差異較大的烘制工藝焦山楂樣品劃于區(qū)域之外，該模型也可用于不同烘制工藝焦山楂與炒制焦山楂相似程度的鑒別與區(qū)分。

圖5 電子鼻數(shù)據(jù)SQC分析Fig.5 SQC analysis of electronic nose data

3.2 總有機酸測定 與生山楂相比，炒制焦山楂和烘制焦山楂工藝1～9總有機酸含量分別下降1.74%、0.14%、0.67%、1.20%、0.67%、2.28%、0.94%、2.01%、1.21%、3.35%，每個工藝平行制備6份，RSD在1.06%～2.56%。

3.3 HPLC法測定水溶性有機酸成分 采用外標(biāo)一點法進行各成分的含量計算（單位為mg/g），并利用SPSS Statistics17.0軟件對烘法炮制正交實驗的結(jié)果進行方差分析。生山楂及各焦山楂炮制品中10種水溶性有機酸成分含量見表1。

表1 10種水溶性有機酸成分含量表（±s，n=3）Tab.1 Contents of 10 water-soluble organic acids（±s，n=3）mg/g

表1 10種水溶性有機酸成分含量表（±s，n=3）Tab.1 Contents of 10 water-soluble organic acids（±s，n=3）mg/g

炮制品品種 草酸 酒石酸 蘋果酸 乳酸 檸檬酸 琥珀酸 沒食子酸 原兒茶酸 香草酸 咖啡酸生山楂 0.411±0.011 5.973±0.149 12.490±0.265 0.410±0.010169.384±4.7825.171±0.125 0.031±0.002 0.320±0.010 0.482±0.014 1.389±0.039炒制焦山楂 0.399±0.010 5.112±0.123 7.091±0.173 0.465±0.011 96.095±2.223 0.652±0.018 0.017±0.001 0.068±0.003 0.131±0.006 0.000±0.000烘制工藝 1 0.344±0.010 5.860±0.126 11.726±0.302 2.463±0.069103.885±2.6177.537±0.204 0.022±0.002 0.101±0.003 0.046±0.003 0.061±0.003烘制工藝 2 0.292±0.008 4.902±0.117 8.840±0.195 3.587±0.887 94.149±2.324 8.605±0.198 0.021±0.003 0.082±0.002 0.048±0.003 0.040±0.002烘制工藝 3 0.340±0.006 4.856±0.126 9.250±0.223 4.499±0.104 86.778±2.263 6.615±0.159 0.021±0.002 0.071±0.002 0.045±0.002 0.050±0.003烘制工藝 4 0.365±0.011 5.200±0.141 10.572±0.268 1.893±0.052 95.078±2.442 6.577±0.176 0.021±0.001 0.119±0.004 0.052±0.003 0.151±0.005烘制工藝 5 0.296±0.007 4.258±0.103 8.805±0.211 5.246±0.133 58.536±1.486 8.249±0.213 0.021±0.002 0.063±0.002 0.051±0.002 0.044±0.002烘制工藝 6 0.345±0.008 4.263±0.107 6.733±0.178 5.247±0.138 65.271±1.688 7.012±0.185 0.021±0.001 0.056±0.002 0.055±0.004 0.038±0.001烘制工藝 7 0.301±0.009 5.164±0.117 9.785±0.254 3.826±0.095 82.041±2.211 7.175±0.203 0.021±0.001 0.091±0.003 0.046±0.002 0.069±0.002烘制工藝 8 0.261±0.008 4.946±0.113 8.147±0.201 5.894±0.147 83.229±2.327 6.976±0.188 0.021±0.002 0.068±0.002 0.047±0.002 0.035±0.001烘制工藝 9 0.317±0.008 4.360±0.109 7.457±0.181 5.773±0.133 61.514±1.435 6.755±0.183 0.022±0.001 0.060±0.002 0.065±0.003 0.039±0.002

4 正交實驗烘制焦山楂工藝與炒制焦山楂的比較

4.1 外觀性狀評價 根據(jù)與炒制焦山楂外觀性狀特征的相似程度，對正交實驗中各組烘制焦山楂進行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)如下。5分：表面顏色棕褐色，內(nèi)部黃褐色；3分：表面顏色黃褐色或黑褐色，內(nèi)部深黃色或棕褐色；1分：表面顏色深黃或炭黑色，內(nèi)部不變色或棕褐色。

4.2 氣味評價 通過氣相電子鼻對炒制焦山楂與9個不同正交實驗烘制工藝制備的焦山楂樣品氣味的檢測結(jié)果，進行PCA、SIMCA、SQC分析。根據(jù)與炒制焦山楂總有機酸含量的接近程度，對正交實驗中各組烘制焦山楂進行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)如下。5分：與炒制焦山楂分布在相同區(qū)域；1分：與炒制焦山楂分布在不同區(qū)域。

4.3 總有機酸含量評價 根據(jù)與炒制焦山楂總有機酸含量的接近程度，對正交實驗中各組烘制焦山楂進行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 總有機酸含量評分表Tab.2 Scoring table for the content of total organic acid

4.4 水溶性有機酸成分含量評價 根據(jù)與炒制焦山楂10種水溶性有機酸總含量的接近程度，對正交實驗中各組烘制焦山楂進行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 10種水溶性有機酸成分總含量評分表Tab.3 Scoring table for the contents of 10 water-soluble organic acids

4.5 綜合評分 將外觀性狀、氣味、總有機酸含量和10種水溶性有機酸總含量作為評價指標(biāo)，4個評價指標(biāo)的權(quán)重均為1，對照炒制焦山楂進行綜合評分，評分結(jié)果見表4。

表4 正交實驗綜合評分表Tab.4 Comprehensive scoring table for orthogonal experiment

在烘制工藝正交實驗中，因素A、B、C對各組實驗結(jié)果均無顯著性差異，即烘制溫度、烘制時間、烘制厚度層數(shù)對于烘法炮制的質(zhì)量結(jié)果皆無顯著性意義。經(jīng)由直觀分析法，比較R值可知，烘制焦山楂各因素作用主次順序為A＞B＞C。將炒制焦山楂的評分視為5分，依照綜合評分值越接近5分與炒制焦山楂越接近的原則，烘法炮制焦山楂的最佳工藝為工藝8（A3B2C1），即烘制溫度180℃、烘制時間8 min、烘制厚度層數(shù)為1層。方差分析結(jié)果見表5。

表5 方差分析表Tab.5 Variance analysis table

5 討論與結(jié)論

正交實驗的因素和水平設(shè)計參考了相關(guān)的文獻報道[5-7]，并在前期實驗中進行了烘制溫度（因素A）、烘制時間（因素B）和疊加層數(shù)（因素C）等單因素的考察。當(dāng)烘制溫度超過190℃時，焦山楂表面會因溫度過高出現(xiàn)焦黑，且顏色深淺不一；而烘制溫度低于150℃時，烘制時間超過20 min。雖然加大正交實驗中各因素的水平差異可能會使實驗結(jié)果產(chǎn)生顯著性差異，但是這樣卻不能找到更貼近傳統(tǒng)炒制焦山楂的烘制工藝，因此本文以及前期單因素考察結(jié)果從炮制品的外觀性狀、受熱的均勻程度、節(jié)能、安全等方面綜合考慮，最終確定了正交實驗的因素和水平。

正交實驗評分指標(biāo)的確定：外觀性狀評價和總有機酸含量是2020版《中國藥典》中山楂生品及炮制品規(guī)定的檢查項目，因此作為評價指標(biāo)。同時藥典中對焦山楂的氣味描述為“有焦香氣”，山楂在炮制過程中會發(fā)生糖降解反應(yīng)和美拉德反應(yīng)，這兩種反應(yīng)均會產(chǎn)生焦香氣味，炮制品氣味的不同變化也能反應(yīng)出炮制的程度，因此將氣味列入評價指標(biāo)之中。而炮制過程中山楂中其他部分熱不穩(wěn)定性化學(xué)成分也會發(fā)生改變，有機酸作為山楂的主要藥效成分，尤其是水溶性有機酸成分受熱后變化更加顯著，因此水溶性有機酸的含量也被列入了評價指標(biāo)之中。本文中選取了山楂中含量較高或?qū)θ梭w有益的10種水溶性有機酸成分進行含量測定，其中包括人體三羧酸循環(huán)（TAC Cycle）的重要代謝中間產(chǎn)物的蘋果酸和檸檬酸[8-10]，對于腎臟有顯著的保護作用以及抑制結(jié)腸癌增殖[11-12]的沒食子酸，具有減輕神經(jīng)炎癥、抑制艾氏腹水癌細(xì)胞等藥理作用[13-15]的原兒茶酸等。

本文將正交實驗與電子鼻、HPLC法等分析技術(shù)相結(jié)合，從炮制品的外觀性狀、氣味、總有機酸含量和10種水溶性有機酸總含量4個方面綜合評價，初步優(yōu)選出與炒制焦山楂最為接近的焦山楂烘制工藝，為山楂烘制工藝的進一步規(guī)范提供參考。