槲皮素對1型糖尿病腎病腎小管上皮細胞間質(zhì)轉分化的作用*

趙海霞，曹盼盼，劉林昊，劉風勛

（1.河南省省立醫(yī)院腎病風濕科，鄭州 450000；2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，鄭州 450000）

糖尿病腎?。―N）是1型糖尿?。═1D）的常見微血管并發(fā)癥之一，有15%～25%的1型糖尿病最終發(fā)展為1型糖尿病腎?。═1DN）[1]。T1DN是青少年末期腎病的主要類型，主要臨床特征為尿蛋白異常、腎臟損傷、腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化等[2]。腎間質(zhì)纖維化形成與成纖維細胞有關，而腎小球上皮細胞的間充質(zhì)轉化是受損的腎產(chǎn)生成纖維細胞，并且最終導致腎纖維化的關鍵因素[3]。因此，基于T1DN的發(fā)病基質(zhì)，尋求新型有效的預防和治療藥物來抑制T1DN的發(fā)生發(fā)展具有深遠意義。

槲皮素是一種天然黃酮類化合物，其化學名為3，3，4，5，7-五羥基黃酮，廣泛存在于蔬菜、水果等植物中[4]。槲皮素的主要藥理作用為抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)及心血管保護等作用[5]。研究表明，槲皮素可降低DN大鼠的血糖，改善DN的發(fā)展[6]。然而，槲皮素對T1DN的作用以及機制研究尚少。

本研究采用鏈脲佐菌素構建T1DN大鼠模型，檢測槲皮素對血糖和腎臟病理學的影響，并探究槲皮素對T1DN大鼠腎臟腎小球上皮細胞的間充質(zhì)轉化及腎間質(zhì)纖維化影響，為臨床患者的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級的雄性SD大鼠30只[北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（鄂）2019-0023]，12 周齡，體質(zhì)量（230±10）g。所有大鼠均飼養(yǎng)于恒溫（25±2）℃，濕度50%～60%的無特殊病原體環(huán)境中，并可隨意進食高壓滅菌的水和飼料。本實驗方案通過鄭州大學實驗動物中心倫理委員會的審核，并且在國家衛(wèi)生研究所關于保護和使用實驗動物的方針指導下進行。

1.2 實驗試劑 槲皮素（麗珠集團利民制藥公司）；尿蛋白試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司）；福爾馬林（濟南百博生物技術股份有限公司）；戊巴比妥鈉（上海信裕生物科技有限公司）；Weigert鐵蘇木素染色液（北京博潤萊特科技有限公司）；Trizol試劑、RIPA緩沖液、PMSF、BSA和BCA試劑（上海碧云天生物技術有限公司）；PrimeScript TM RT試劑盒（Takara Biotechnology）；SYBR-Green qPCR Master Mix（北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司）；兔抗鼠轉化生長因子-β（TGF-β）、smad2/3、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、Snail、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單分子抗體（Abcam）；山羊抗兔二抗（賽信通生物試劑有限公司）；超敏發(fā)光液（北京四正柏生物科技有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組和建模 隨機將30只SD大鼠分為3組：對照組、T1DN組和槲皮素組，每組10只。SD大鼠在動物房適應飼養(yǎng)1周后，T1DN組和槲皮素組單次空腹腹腔注射100 mg/kg鏈脲佐菌素。48 h后尾靜脈采血測血糖，血糖含量≥16.7 nmol/L，認定為糖尿病模型構建成功[7]。大鼠糖尿病建模4周后，收集其24 h尿液并測定尿蛋白，為T1DN建模成功。本實驗30只SD大鼠血糖含量均≥16.7 nmol/L，尿蛋白＞30 mg/24 h，成模率100%。槲皮素干預濃度參考文獻，選取100 mg/kg，每次灌胃前將槲皮素與生理鹽水渦旋成槲皮素混懸液[8]。血糖檢測完畢后，槲皮素組按100 mg/kg槲皮素混懸液灌胃，每日1次。對照組和T1DN組每日灌胃等量生理鹽水，連續(xù)8周。最后一次灌藥結束后收集24 h尿液。在所有大鼠處死之前檢測大鼠空腹血糖值，安樂死大鼠后，原位灌洗腎臟后，去除包膜，濾紙吸干后，沿著腎門沿冠狀面破開，一半放入福爾馬林中固定，通過常規(guī)脫水、浸蠟、包埋及切片，另一部分放入液氮中凍存。

1.3.2 24 h尿蛋白檢測 收集所有大鼠24 h的尿后，記錄尿量。采用尿蛋白試劑盒（比色法）檢測尿蛋白的濃度，24 h尿蛋白=尿蛋白濃度×24 h尿量。

1.3.3 天狼星紅染色 所有大鼠腎臟5 μm石蠟切片，脫蠟至水化，Weigert鐵蘇木素染色液染色10min后，生理鹽水沖洗。天狼星紅染液染色1～2 h，生理鹽水浸泡，脫水，透明，封片后，在光學顯微鏡下觀察各組大鼠腎組織的病理學變化。

1.3.4 實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)（qPCR）檢測 取所有組大鼠腎臟組織0.5 mg，放入低溫勻漿機100 Hz勻漿10 min后，使用Trizol試劑提取總RNA。用NanoDrop 2000分光光度計檢測RNA的純度和濃度后，通過PrimeScript TM RT試劑盒逆轉錄合成 cDNA（反轉錄條件：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min）。在ABI 7500實時PCR系統(tǒng)上，實時熒光定量PCR實驗。PCR擴增條件為：95℃預變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火45 s，72℃延伸30 s，共計40個循環(huán)。以GAPDH作為mRNA的標準內(nèi)參基因表達結果均以2-ΔΔct進行統(tǒng)計。目的基因及參考基因序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR所需的引物序列Tab.1 Primer sequences required for real-time PCR

1.3.5 蛋白質(zhì)免疫印記法（Western blot）檢測 所有組大鼠腎臟組織0.5 mg放入低溫勻漿機100 Hz勻漿10 min后，RIPA緩沖液和PMSF抑制蛋白降解液（100∶1）將樣本裂解后提取各組總蛋白。通過BCA試劑檢測蛋白質(zhì)的總濃度，將各組的總蛋白濃度調(diào)為一致，將其于100℃進行變性后保存至-20℃。SDS-PAGE電泳分離總蛋白后，將其轉膜至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉2h，TBST洗滌3次，每次10min，將其放入對應的一抗（TGF-β、Smad2/3、α-SMA、Snail、E-cadherin 和 GAPDH）和一抗稀釋混懸液（1∶1 000）中，4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，放入二抗和二抗稀釋液（1∶4 000）混懸液中，室溫孵育 2 h。TBST 洗滌3次，每次10 min，將超敏發(fā)光液ECL滴在膜上，放入化學發(fā)光成像儀（Invitorgen，美國）進行蛋白顯影。通過Image J軟件進行分析，相對蛋白表達以GAPDH標準化。

1.3.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism Version 7.0計量作圖，資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組數(shù)據(jù)見的比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠空腹血糖值以及24 h尿蛋白的變化 與對照組空腹血糖值（3.82±0.28）nmol/L比較，T1DN組空腹血糖值（23.25±1.88）nmol/L顯著增加（P＜0.01）。與T1DN組比較，槲皮素組空腹血糖值（10.57±1.01）nmol/L 顯著降低（P＜0.05）。與對照組的24 h尿蛋白[（41.33±2.64）μg/24 h]比較，T1DN組24 h 尿蛋白[（231.42±5.32）μg/24 h]顯著增加（P＜0.01）。與T1DN組比較，槲皮素組24 h尿蛋白[（73.72±2.51）μg/24 h]顯著降低（P＜0.05）。見圖1A和1B。

圖1 各組大鼠空腹血糖值和24 h尿蛋白含量變化Fig.1 Changes of fasting blood glucose and 24 h urine protein content of rats in each group

2.2 大鼠腎臟病理變化 天狼星染色結果顯示，對照組大鼠的腎小球和腎小管結構完整，腎小管間質(zhì)未見膠原纖維沉積。T1DN組腎小球增生，腎小管上皮損傷，腎小管間質(zhì)膠原纖維沉積明顯。槲皮素組大鼠的腎小管結構較完整，腎小球肥大程度減輕，腎小管間質(zhì)膠原纖維沉積明顯降低，見圖2。

圖2 各組大鼠腎組織病理變化（×200，標尺=10 μm）Fig.2 Pathological changes of renal tissue of rats in each group（×200，standard=10 μm）

2.3 大鼠腎組織中腎小管上皮細胞間質(zhì)轉分化標志物的變化 Western blot和qPCR結果顯示，與對照組比較，T1DN組的α-SMA、Snail蛋白和mRNA表達顯著增加（P＜0.05或 P＜0.01），E-cadherin的蛋白和mRNA表達顯著減少（P＜0.05或P＜0.01）。與T1DN組比較，槲皮素組的α-SMA、Snail蛋白和mRNA表達顯著減少（P＜0.05），E-cadherin的蛋白和 mRNA 表達顯著增加（P＜0.05）。見圖3和表2。

圖3 各組大鼠腎臟組織上皮細胞間質(zhì)轉分化標志蛋白含量變化Fig.3 Changes in protein levels of epithelial-mesenchymal trans differentiation marker proteins in kidney tissue of rats in each group

表2 各組大鼠腎臟組織中α-SMA、Snail和E-cadherin基因表達量變化（±s）Tab.2 Changes of α-SMA，Snail and E-cadherin gene expression in kidney tissue of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠腎臟組織中α-SMA、Snail和E-cadherin基因表達量變化（±s）Tab.2 Changes of α-SMA，Snail and E-cadherin gene expression in kidney tissue of rats in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與 T1DN 組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù) α-SMA Snail E-cadherin對照組 10 0.474±0.041 0.361±0.017 0.388±0.027 T1DN 組 10 0.718±0.023* 0.616±0.024* 0.132±0.017*槲皮素組 10 0.536±0.018# 0.383±0.028# 0.228±0.026#

2.4 大鼠腎組織中TGF-β/Smad信號通路的變化 Western blot和qPCR結果顯示，與對照組比較，T1DN組的TGF-β、Smad2/3蛋白和mRNA表達顯著增加（P＜0.05或 P＜0.01）。與 T1DN 組比較，槲皮素組的TGF-β、Smad2/3蛋白和mRNA表達顯著減少（P＜0.05）。見圖 4和表 3。

圖4 各組大鼠腎臟組織上皮細胞間質(zhì)轉分化標志蛋白含量變化Fig.4 Changes in protein levels of epithelial-mesenchymal trans differentiation marker proteins in kidney tissue of rats in each group

表3 各組大鼠腎臟組織中TGF-β、Smad2和Smad3基因表達量變化（±s）Tab.3 Changes of TGF-β，Smad2 and Smad3 gene expression in kidney tissue of rats in each group（±s）

表3 各組大鼠腎臟組織中TGF-β、Smad2和Smad3基因表達量變化（±s）Tab.3 Changes of TGF-β，Smad2 and Smad3 gene expression in kidney tissue of rats in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與 T1DN 組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù) TGF-β Smad2 Smad3對照組 10 0.217±0.011 0.315±0.028 0.414±0.017 T1DN 組 10 0.487±0.017* 0.634±0.014* 0.672±0.023*槲皮素組 10 0.312±0.004# 0.352±0.021# 0.534±0.019#

3 討論

中國是全世界糖尿病發(fā)病的第一大國，超過一半的糖尿病患者會發(fā)展成DN[9]。DN的基本機制是細胞內(nèi)途徑的促炎因子和促纖維化因子產(chǎn)生，引起腎損傷和纖維化的過程，并且細胞外基質(zhì)代謝不正常，在間質(zhì)內(nèi)異常積聚[10]。研究表明，腎小管上皮細胞間質(zhì)轉分化的異常導致纖維細胞增加，進而引起蛋白尿和腎小球纖維化，最終發(fā)展成終末期腎病，即T1DN[11]。本研究采用一次性腹腔注射鏈脲佐菌素誘導糖尿病模型，12周后，糖尿病大鼠的24 h尿蛋白和空腹血糖明顯增加，腎臟主要的病理變化為腎小球肥大，腎小管擴張和間質(zhì)膠原纖維沉積增多和基底膜不規(guī)則增厚，符合T1DN早期功能和結構的改變，說明實驗造模成功。研究表明，慢病腎間質(zhì)纖維化疾病中，有36%腎間質(zhì)成纖維細胞是來自腎小管上皮細胞轉分化[12-13]。因此，阻礙腎小管上皮細胞間質(zhì)轉分化對T1DN的發(fā)生發(fā)展具有重要臨床意義。α-SMA是肌成纖維細胞的標志蛋白，在纖維化早期高表達，與腎纖維化呈正相關[14]。Snail屬于鋅指蛋白家族，能促進腎小管上皮細胞間質(zhì)轉分化[15]。Snail直接抑制靶基因E-cadherin的表達，進而啟動上皮細胞間質(zhì)轉分化[16]。本研究結果表明，T1DN模型大鼠的α-SMA和Snail表達明顯增加，而E-cadherin的表達受到抑制。綜上所述，本研究的T1DN構建成功。

槲皮素存在100多種中藥草中，對多種疾病具有預防和治療作用，其中對DN有較好的效果，但作用機制尚不明確[6]。本研究結果顯示，槲皮素干預8周后，大鼠血糖和尿蛋白明顯降低，并且腎臟組織病理學形態(tài)得到改善，膠原纖維減少。Western blot和qPCR結果顯示，槲皮素可抑制T1DN大鼠腎組織中的α-SMA和Snail表達，促進E-cadherin的表達，說明槲皮素可抑制腎小管上皮細胞間質(zhì)轉分化，從而改善T1DN大鼠腎組織纖維化。

研究表明，TGF-β/Smad信號通路是調(diào)控上皮間質(zhì)轉化的中心環(huán)節(jié)，主要是TGF-β激活Smad信號蛋白，從而調(diào)節(jié)靶基因的轉錄，促進腎小管上皮間質(zhì)轉分化的α-SMA和Snail表達，抑制標志蛋白E-cadherin[17]。本研究結果顯示，槲皮素可阻礙TGF-β/Smad信號通路的傳導，主要是抑制TGF-β、Smad2/3的表達。綜上所述，槲皮素可阻斷TGF-β/Smad信號的傳遞，抑制腎小管上皮細胞間質(zhì)轉分化的標志蛋白α-SMA和Snail表達，促進E-cadherin表達，進而改善T1DN的腎損傷，降低血糖和尿蛋白。因此，槲皮素可改善鏈脲佐菌素誘導的T1DN，有望成為治療抗T1DN的藥物。