種子成熟度差異對(duì)老山芹種子層積效果的影響

李富恒，張宏發(fā)，張永芳，于 萍，張曉雯

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 大同 037009；3.北京閱微基因技術(shù)股份有限公司，北京 100044)

老山芹是東北林區(qū)主要山野菜之一，為傘形科獨(dú)活屬多年生宿根草本植物[1]，包括短毛獨(dú)活（Heracleum moellendorffiiHance）和興安獨(dú)活（Hera?cleum dissectumLedeb）兩個(gè)種。其富含維生素C、核黃素和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2]，具有祛風(fēng)除濕、退熱解毒、清潔血液、降糖降壓等功效，被稱為山野菜中的“綠色黃金”[3]。

老山芹種子具有較強(qiáng)休眠特性，采收后種胚尚未發(fā)育完全，需經(jīng)歷后熟過(guò)程，秋季播種后到第二年春天才發(fā)芽。生產(chǎn)上存在種子發(fā)芽率低、出苗不整齊、育苗技術(shù)不成熟、育苗周期過(guò)長(zhǎng)等問(wèn)題，成為老山芹規(guī)?；斯ぴ耘嘞拗埔蛩亍Ｔ谛枨罅坎粩嘣黾?、野生資源日益枯竭情況下，開(kāi)展老山芹育苗技術(shù)研究具有重要理論及實(shí)踐意義，滿足保護(hù)林區(qū)生態(tài)環(huán)境、發(fā)展林下經(jīng)濟(jì)、實(shí)現(xiàn)老山芹大面積人工栽培需求。

選擇高成熟度種子是完善育苗技術(shù)前提和保障，有利于提高種子處理效果和發(fā)芽率。以往老山芹研究主要集中于植株及種子生長(zhǎng)發(fā)育特性[4]、遮陰處理對(duì)幼苗生長(zhǎng)及生理特性影響[5]、層積條件下種子后熟過(guò)程[6]、變溫層積效果比較[7]、提取物活性成分及作用[8]、層積過(guò)程中種胚主要發(fā)育期間差異蛋白變化[9]等方面。本研究前期對(duì)老山芹種子成熟度差異研究結(jié)果表明，種子采收時(shí)個(gè)體間胚發(fā)育狀態(tài)不一致，主要處于心形胚和魚雷形胚時(shí)期；種子質(zhì)量與種子形態(tài)和胚發(fā)育各項(xiàng)指標(biāo)密切相關(guān)，質(zhì)量越大，成熟度越高[10]。但有關(guān)老山芹不同成熟度種子對(duì)層積效果影響相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以夏季采收短毛獨(dú)活種子為材料，種子按成熟度分成高、中、低3 組，分別層積處理，測(cè)定層積過(guò)程中種子及種胚形態(tài)指標(biāo)，觀測(cè)并記錄層積過(guò)程中種胚所處發(fā)育時(shí)期，統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽數(shù)量，比較不同成熟度種子后熟過(guò)程動(dòng)態(tài)變化及種子發(fā)芽率差異。為深入研究老山芹種子休眠及萌發(fā)機(jī)制、提高種子處理效果和發(fā)芽率、保障種苗供應(yīng)、發(fā)展老山芹產(chǎn)業(yè)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為短毛獨(dú)活種子，于2020年8月采集于黑龍江省森林植物園（哈爾濱市）試驗(yàn)田。

1.2 方法

1.2.1 種子按成熟度分組

利用直徑為7.5、6.0 及5.0 mm 篩子將種子分成3 組，分別作為高成熟度（平均質(zhì)量12.5 mg）、中成熟度（平均質(zhì)量9.2 mg）和低成熟度（平均質(zhì)量6.1 mg）種子。

1.2.2 種子及基質(zhì)處理

種子用75%乙醇消毒30 s，蒸餾水沖洗干凈后浸種6 h，撈出備用。取干凈細(xì)砂置于110 ℃烘箱中高溫滅菌3 h，晾至室溫后加水?dāng)嚢杈鶆颍蛊浜窟_(dá)70%左右。

1.2.3 層積處理

將處理后種子與細(xì)砂按1∶3 攪拌均勻，放入長(zhǎng)×寬×高分別為19 cm×13 cm×11 cm塑料盒中，在蓋子上打孔以利于空氣交換，于4 ℃低溫條件下層積處理，每隔10 d清洗1次。

1.2.4 取樣

分別在層積0、20、40、60、80、100、120 d時(shí)取樣，測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.2.5 種子形態(tài)指標(biāo)測(cè)定

利用游標(biāo)卡尺測(cè)定種子最大長(zhǎng)度及寬度（mm）、胚乳最大長(zhǎng)度及寬度（mm），分別代表種長(zhǎng)及種寬、胚乳長(zhǎng)及胚乳寬，重復(fù)測(cè)量10次，取平均值。

1.2.6 種胚形態(tài)指標(biāo)觀測(cè)

利用解剖刀切開(kāi)種子并剝離種胚制成臨時(shí)裝片，在顯微鏡下運(yùn)用直線式測(cè)微尺分別測(cè)定胚長(zhǎng)、胚寬，重復(fù)測(cè)量10次，取平均值，計(jì)算胚率。

測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)如下：

胚長(zhǎng)（mm）：直線測(cè)微尺測(cè)量種胚長(zhǎng)度最大值；

胚寬（mm）：直線測(cè)微尺測(cè)量種胚寬度最大值；

胚率計(jì)算公式：胚率（%）=胚長(zhǎng)（mm）/胚乳長(zhǎng)（mm）×100%；

測(cè)微尺校正：將目微尺放于目鏡內(nèi)，臺(tái)微尺放在顯微鏡載物臺(tái)上。移動(dòng)臺(tái)微尺至兩尺平行，起點(diǎn)線重合，確定另一兩尺刻度重合處，記錄起點(diǎn)線到重合線間各尺刻度（格數(shù)）。按下式計(jì)算該放大倍數(shù)下目微尺每格所代表實(shí)際長(zhǎng)度：

目鏡測(cè)微尺每格所代表實(shí)際長(zhǎng)度=（臺(tái)微尺格數(shù)/目微尺格數(shù)）×10 μm。

1.2.7 種胚發(fā)育時(shí)期觀測(cè)

利用解剖刀切開(kāi)種子并剝離種胚制成臨時(shí)裝片，在顯微鏡下觀測(cè)胚發(fā)育時(shí)期差異并作顯微攝影。各處理每次解剖30 粒種子，重復(fù)測(cè)量3 次，取平均值。

種胚發(fā)育時(shí)期包括心形胚前、中及后期，魚雷形胚前、中及后期，子葉期胚前、中及后期，共分為9個(gè)發(fā)育時(shí)期。

1.2.8 種子發(fā)芽數(shù)量統(tǒng)計(jì)和計(jì)算

在層積期間定期觀察記錄各處理已發(fā)芽種子數(shù)量，計(jì)算發(fā)芽率。分析各處理層積期間種子發(fā)芽率動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，比較各處理間差異。種子發(fā)芽率計(jì)算公式如下：

1.2.9 數(shù)據(jù)處理與分析

運(yùn)用SPSS Statistics 19 和Excel 2019 軟件分析處理數(shù)據(jù)并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 層積過(guò)程中不同成熟度種子種胚發(fā)育進(jìn)程動(dòng)態(tài)變化與比較

2.1.1 種胚發(fā)育進(jìn)程

老山芹種子存在形態(tài)后熟現(xiàn)象，即采收時(shí)種胚未發(fā)育完全，在層積過(guò)程中種胚繼續(xù)發(fā)育，經(jīng)心形胚-魚雷形胚-子葉期胚階段，逐漸完成胚后熟過(guò)程。僅完成形態(tài)后熟后種子才可能發(fā)芽。不同成熟度種子層積前種胚所處發(fā)育時(shí)期有差異，層積過(guò)程中在種胚形態(tài)、發(fā)育進(jìn)程等方面也有區(qū)別。

層積前高、中、低三類成熟度種子種胚大小不同，所處發(fā)育時(shí)期也有區(qū)別。高、中兩類成熟度種子胚所處發(fā)育時(shí)期多數(shù)在心形胚后期（見(jiàn)圖1 A1 和B1），低成熟度種子胚所處發(fā)育時(shí)期多數(shù)在心形胚中期（見(jiàn)圖1 C1）。

層積至20 d 時(shí)，高、中兩類成熟度種子胚發(fā)育時(shí)期多為魚雷形胚前期（見(jiàn)圖1 A2 和B2），低成熟度種子胚發(fā)育時(shí)期多為心形胚后期（見(jiàn)圖1 C2）。此時(shí)低成熟度種子胚形態(tài)與高、中兩類成熟度種子未層積時(shí)種胚相似。高成熟度種子胚伸長(zhǎng)，子葉原基基部向內(nèi)凹陷。

層積至40 d 時(shí)，高、中兩類成熟度種子仍保持較一致的胚發(fā)育進(jìn)程，種胚發(fā)育時(shí)期主要集中在魚雷形胚中期（見(jiàn)圖1 A3 和B3）。低成熟度種子種胚發(fā)育時(shí)期主要集中在魚雷形胚前期（見(jiàn)圖1 C3）。與層積20 d相比，高成熟度種子子葉原基基部向內(nèi)凹陷更明顯，子葉原基向內(nèi)彎曲程度更大，兩原基間夾角也變大；中成熟度種子子葉原基基部向內(nèi)凹陷，子葉原基尖端向內(nèi)彎曲；低成熟度種子子葉原基尖端稍向內(nèi)測(cè)彎曲，無(wú)子葉原基基部向內(nèi)凹陷。

層積至60 d 時(shí)，高、中兩類成熟度種子胚發(fā)育時(shí)期主要集中在魚雷形胚后期（見(jiàn)圖1 A4 和B4），低成熟度種子胚發(fā)育時(shí)期多在魚雷形胚中期（見(jiàn)圖1 C4）。此時(shí)高成熟度種子子葉原基及胚軸進(jìn)一步變寬變長(zhǎng)，初具子葉輪廓；中成熟度種子胚出現(xiàn)與高成熟度種子類似現(xiàn)象，但變化幅度較??；低成熟度種子胚形態(tài)發(fā)生明顯變化，出現(xiàn)較為清晰的子葉原基基部向內(nèi)凹陷。

層積至80 d 時(shí)，高、中兩類成熟度種子胚發(fā)育時(shí)期已進(jìn)入子葉期胚前期階段（見(jiàn)圖1 A5 和B5），低成熟度種子胚發(fā)育時(shí)期還處在魚雷形胚后期階段（見(jiàn)圖1 C5）。與層積60 d 相比，高成熟度種子子葉原基已初步發(fā)育成子葉，子葉主脈已能觀察到，胚軸變細(xì)伸長(zhǎng)，不再是橢圓形；中成熟度種子剛剛形成子葉輪廓，未觀察到主脈；低成熟度種子子葉原基與胚軸進(jìn)一步伸長(zhǎng)。

層積至100 d時(shí)，多數(shù)高、中兩類成熟度種子胚發(fā)育至子葉期胚中期階段（見(jiàn)圖1 A6 和B6），低成熟度種子種胚發(fā)育時(shí)期仍集中在魚雷形胚后期階段（見(jiàn)圖1 C6）。此時(shí)高成熟度種子子葉進(jìn)一步變長(zhǎng)、變寬，兩子葉間夾角變大，子葉主脈清晰可見(jiàn)，網(wǎng)狀脈序基本形成；中成熟度種子兩片子葉上出現(xiàn)主脈；部分低成熟度種子胚發(fā)育時(shí)期仍處于魚雷形胚后期階段，但胚軸、子葉原基伸長(zhǎng)生長(zhǎng)較明顯，形態(tài)與高、中兩類成熟度種子層積60 d時(shí)接近。

層積至120 d 時(shí)，多數(shù)高成熟度種子胚發(fā)育至子葉期胚后期階段（見(jiàn)圖1 A7），完成形態(tài)后熟；中成熟度種子胚發(fā)育仍集中在子葉期胚中期階段（見(jiàn)圖1 B7）；低成熟度種子胚發(fā)育時(shí)期集中在子葉期胚前期階段（見(jiàn)圖1 C7）。與層積100 d 時(shí)相比，高成熟度種子胚進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育，子葉上網(wǎng)狀脈序已清晰可見(jiàn)，子葉及胚軸變寬、變長(zhǎng)，兩子葉間夾角進(jìn)一步變大；中成熟度種子胚進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育，胚軸變長(zhǎng)，子葉間夾角變大，子葉主脈更清晰；低成熟度種子胚發(fā)育進(jìn)入子葉期胚前期階段，大致輪廓與中成熟度種子層積80 d 時(shí)種胚狀態(tài)類似，子葉主脈尚不清晰。

圖1 層積過(guò)程中不同成熟度種子種胚發(fā)育進(jìn)程Fig.1 Development process of seed embryo in different maturity during stratification

由以上分析可見(jiàn)，不同成熟度種子在層積過(guò)程中胚發(fā)育進(jìn)程區(qū)別明顯，成熟度越高，胚發(fā)育進(jìn)程越快。選擇高成熟度種子可縮短層積時(shí)間，有利于種子早發(fā)芽及發(fā)芽整齊，提高育苗質(zhì)量。

2.1.2 種胚發(fā)育進(jìn)程量化分析

老山芹種子成熟度不一致，雖將種子分成高、中和低成熟度三類，但每類種子內(nèi)部依然存在這種差異。因此，有必要量化分析不同成熟度種子在層積過(guò)程中胚發(fā)育進(jìn)程，定量化比較這三類種子胚發(fā)育進(jìn)程差異。

由表1可看出，層積前，高、中和低三類不同成熟度種子，可觀測(cè)到種胚發(fā)育時(shí)期及其所占比例有區(qū)別。其中高和中兩類成熟度種子，部分種子已發(fā)育至魚雷形胚后期，分別占6.67%和3.33%，而低成熟度種子僅有4.44%發(fā)育至魚雷形胚中期；高和中兩類成熟度種子，心形胚后期種胚占比最高，分別占供試種子總數(shù)31.11%和42.22%，低成熟度種子心形胚中期種胚占比最大，為35.56%。說(shuō)明低成熟度種子種胚發(fā)育程度低于高和中兩類成熟度種子；種子成熟度越高，其種胚發(fā)育程度亦高，二者呈正相關(guān)關(guān)系。

層積至20 d 時(shí)，高成熟度種子可觀測(cè)到由心形胚中期至子葉期胚中期7個(gè)種胚發(fā)育時(shí)期，其中占比最高是魚雷形胚前期種子，占供試種子總數(shù)28.89%，極顯著高于除心形胚后期外其他各發(fā)育時(shí)期種子所占比例；占比最低是子葉期胚中期種子，占供試種子總數(shù)3.33%，極顯著低于除心形胚中期和子葉期胚前期外其他各發(fā)育時(shí)期種子所占比例。中成熟度種子也可觀測(cè)到心形胚前期至子葉期胚前期7個(gè)種胚發(fā)育時(shí)期，其中占比最高是魚雷形胚前期，占供試種子總數(shù)35.56%，除與心形胚后期種子占比差異不顯著外，極顯著高于其他各發(fā)育時(shí)期種子所占比例；占比最低是子葉期胚前期種子，占供試種子總數(shù)2.22%，除與魚雷形胚中期及后期種子所占比例差異不顯著外，極顯著低于其他各發(fā)育時(shí)期種子所占比例。低成熟度種子可觀測(cè)到心形胚前期至魚雷形胚后期6個(gè)種胚發(fā)育時(shí)期，比高和中成熟度處理少一個(gè)發(fā)育時(shí)期，其中占比最高是心形胚后期，占供試種子總數(shù)27.78%，極顯著高于除心形胚中期及魚雷形胚前期外其他各發(fā)育時(shí)期種子占比；占比最低是魚雷形胚后期種子，占供試種子總數(shù)3.33%，除與魚雷形胚中期種子占比差異不顯著外，極顯著低于其他各發(fā)育時(shí)期種子占比。

層積至40 d 時(shí)，高成熟度種子可觀測(cè)到由心形胚中期至子葉期胚后期8個(gè)種胚發(fā)育時(shí)期，比層積20 d時(shí)多一個(gè)發(fā)育時(shí)期，2.22%種子已進(jìn)入子葉期胚后期，但占比最低，除與心形胚及子葉期胚中期種子占比差異不顯著外，極顯著低于其他各發(fā)育時(shí)期種子占比；占比最高是魚雷形胚中期，占供試種子總數(shù)23.33%，極顯著高于除心形胚后期外其他各發(fā)育時(shí)期種子占比。中成熟度種子可觀測(cè)到心形胚前期至子葉期胚中期8 個(gè)種胚發(fā)育時(shí)期，其中占比最高的處于魚雷形胚中期，占供試種子總數(shù)26.67%，除與魚雷形胚前期種子占比差異不顯著外，極顯著高于其他各發(fā)育時(shí)期種子占比；占比最低是心形胚前期種子，僅占供試種子總數(shù)2.22%，除與心形胚及子葉期胚中期種子占比差異不顯著外，極顯著低于其他各發(fā)育時(shí)期種子占比。低成熟度種子此時(shí)也可觀測(cè)到心形胚前期至子葉期胚中期8個(gè)種胚發(fā)育時(shí)期，其中占比最高是魚雷形胚前期，占供試種子總數(shù)26.67%，極顯著高于其他各發(fā)育時(shí)期種子占比；占比最低是心形胚前期種子，僅占供試種子總數(shù)3.33%，極顯著低于除子葉期胚中期之外其他各發(fā)育時(shí)期種子占比。

層積至60 d 時(shí)，高成熟度種子可觀測(cè)到由心形胚后期至子葉期胚后期7個(gè)種胚發(fā)育時(shí)期，其中占比最高是魚雷形胚后期，占供試種子總數(shù)24.44%，極顯著高于其他各發(fā)育時(shí)期種子占比；占比最低是魚雷形胚前期，占供試種子總數(shù)7.78%，極顯著低于除子葉期胚前期之外其他各發(fā)育時(shí)期種子占比。中、低兩類成熟度種子均可觀測(cè)到心形胚中期至子葉期胚后期8 個(gè)種胚發(fā)育時(shí)期，其中中成熟度種子占比最高也是魚雷形胚后期，占供試種子總數(shù)21.11%，極顯著高于其他各發(fā)育時(shí)期種子占比；占比最低是心形胚中期，僅占供試種子總數(shù)3.33%，極顯著低于其他各發(fā)育時(shí)期種子占比。低成熟度種子占比最高是魚雷形胚中期，占供試種子總數(shù)22.22%，極顯著高于除魚雷形胚前期外其他各發(fā)育時(shí)期種子占比；占比最低是心形胚中期及子葉期胚后期種子，均占供試種子總數(shù)4.44%，極顯著低于除心形胚后期外其他各發(fā)育時(shí)期種子占比。

層積至80 d 時(shí)，高成熟度種子可觀測(cè)到種胚發(fā)育時(shí)期與層積60 d 時(shí)一致，仍為心形胚后期至子葉期胚后期7個(gè)種胚發(fā)育時(shí)期，但占比最高的發(fā)育時(shí)期由魚雷形胚后期變?yōu)樽尤~期胚前期，占供試種子總數(shù)32.22%，極顯著高于其他各發(fā)育時(shí)期種子占比；占比最低的發(fā)育時(shí)期由魚雷形胚前期變?yōu)樾男闻吆笃冢瑑H占供試種子總數(shù)2.22%，極顯著低于其他各發(fā)育時(shí)期種子占比。中、低兩類成熟度種子也均可觀測(cè)到與高成熟度一致的心形胚后期至子葉期胚后期7個(gè)種胚發(fā)育時(shí)期，但占比不同，其中占比最高的發(fā)育時(shí)期分別為子葉期胚前期和魚雷形胚后期，分別占供試種子總數(shù)24.44%和26.67%，均極顯著高于其他各發(fā)育時(shí)期種子占比；占比最低的與高成熟度種子一致，均為心形胚后期，分別占供試種子總數(shù)6.67%和4.44%，中成熟度種子除與魚雷形胚后期、低成熟度種子除與子葉期胚后期種子占比差異不顯著外，均極顯著低于其他各發(fā)育時(shí)期種子占比。

層積至100 d時(shí)，高成熟度種子可觀測(cè)到由魚雷形胚前期至子葉期胚后期6個(gè)種胚發(fā)育時(shí)期，其中占比最高是子葉期胚中期，占供試種子總數(shù)38.89%，極顯著高于其他各發(fā)育時(shí)期種子占比；占比最低是魚雷形胚前期，僅占供試種子總數(shù)4.44%，極顯著低于其他各發(fā)育時(shí)期種子占比。中、低成熟度種子可觀測(cè)到仍為心形胚后期至子葉期胚后期7個(gè)種胚發(fā)育時(shí)期，其中中成熟度種子占比最高的發(fā)育時(shí)期為子葉期胚中期，占供試種子總數(shù)22.22%，極顯著高于其他各發(fā)育時(shí)期種子占比；而低成熟度種子占比最高的發(fā)育時(shí)期仍為魚雷形胚后期，占供試種子總數(shù)23.33%，極顯著高于除魚雷形胚中期外其他各發(fā)育時(shí)期種子占比，此時(shí)發(fā)育至子葉期胚種子占比顯著上升；占比最低仍為心形胚后期，分別占供試種子總數(shù)3.33%和2.22%，均極顯著低于其他各發(fā)育時(shí)期種子占比。

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層積至120 d時(shí)，高成熟度種子可觀測(cè)到種胚發(fā)育時(shí)期仍為魚雷形胚前期至子葉期胚后期6個(gè)種胚發(fā)育時(shí)期，其中占比最高的時(shí)期由子葉期胚中期變?yōu)樽尤~期胚后期，占供試種子總數(shù)45.56%，極顯著高于其他各發(fā)育時(shí)期種子占比；占比最低的仍是魚雷形胚前期種子，僅占供試種子總數(shù)2.22%，極顯著低于除魚雷形胚中期外其他各發(fā)育時(shí)期種子占比。中和低兩類成熟度種子也均可觀測(cè)到魚雷形胚前期至子葉期胚后期6個(gè)種胚發(fā)育時(shí)期。其中中成熟度種子占比最高的發(fā)育時(shí)期仍與上一次取樣時(shí)一致，處于子葉期胚中期，占供試種子總數(shù)30.00%，較上一時(shí)期顯著上升，除與子葉期胚后期種子占比差異不顯著外，均極顯著高于其他各發(fā)育時(shí)期種子占比；占比最低是魚雷形胚前期，占供試種子總數(shù)6.67%，極顯著低于其他各發(fā)育時(shí)期種子占比。低成熟度種子占比最高是子葉期胚前期種子，占供試種子總數(shù)24.44%，極顯著高于其他各發(fā)育時(shí)期種子占比；占比最低是魚雷形胚前期種子，占供試種子總數(shù)5.56%，極顯著低于其他各發(fā)育時(shí)期種子占比。

由以上分析可知，不同成熟度種子在不同取樣期均可觀察到多個(gè)種胚發(fā)育時(shí)期，但總體上高成熟度種子種胚發(fā)育更快，最先進(jìn)入子葉期胚后期階段。

2.1.3 種胚后熟過(guò)程快慢比較

老山芹種子成熟度不一致，各取樣時(shí)期均包括多個(gè)胚發(fā)育進(jìn)程，后續(xù)比較各處理種胚后熟過(guò)程存在困難。為此，僅以高、中和低三類成熟度種子占比最大的發(fā)育時(shí)期為研究對(duì)象，用占比最大的胚發(fā)育時(shí)期代表此時(shí)種胚發(fā)育狀況，比較各處理種胚后熟過(guò)程快慢。

由圖2可見(jiàn)，層積前高、中和低三類成熟度種子占比最大的胚發(fā)育時(shí)期均在心形胚時(shí)期，其中高和中兩類成熟度種子占比最大的胚發(fā)育時(shí)期為心形胚后期，而低成熟度種子是心形胚中期。

圖2 層積過(guò)程中不同成熟度種子占比最大的種胚發(fā)育時(shí)期動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamic change of the largest proportion of seeds with different maturity during seed embryo development during stratification process

層積至20 d 時(shí)，高和中兩類成熟度種子占比最大的胚發(fā)育時(shí)期已進(jìn)入魚雷形胚階段（魚雷形胚前期），而低成熟度種子還停留在心形胚階段（心形胚后期）。

層積至80 d 時(shí)，高和中兩類成熟度種子占比最大的胚發(fā)育時(shí)期已進(jìn)入子葉期胚階段（子葉期胚前期），而低成熟度種子還停留在魚雷形胚階段（魚雷形胚后期）。

層積至120 d時(shí)，高成熟度種子占比最大的胚發(fā)育時(shí)期已達(dá)到子葉期胚后期階段，即多數(shù)種子已完成形態(tài)后熟，陸續(xù)進(jìn)入發(fā)芽階段；中成熟度種子占比最大的胚發(fā)育時(shí)期達(dá)到子葉期胚中期階段；低成熟度種子占比最大的胚發(fā)育時(shí)期達(dá)到子葉期胚前期階段。三類成熟度種子均進(jìn)入了子葉期胚階段。

計(jì)算層積過(guò)程中各處理占比最大種胚發(fā)育速率（每經(jīng)歷一個(gè)胚發(fā)育時(shí)期所需層積天數(shù)，d·D-1），結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，在層積80 d范圍內(nèi)，各成熟度處理占比最大胚發(fā)育速率相同，均為20 d·D-1；在層積100 d 時(shí)間范圍內(nèi)，高和中兩類成熟度處理占比最大的胚發(fā)育速率保持不變，為20 d·D-1，而低成熟度種子占比最大的胚發(fā)育速率變慢，為25 d·D-1；在整個(gè)層積過(guò)程中，高成熟度處理占比最大的胚發(fā)育速率為20 d·D-1，而中和低成熟度種子為24 d·D-1。

表2 層積過(guò)程中不同成熟度種子占比最大的種胚發(fā)育速率動(dòng)態(tài)變化Table 2 Dynamic change of embryo development rate was the largest proportion of seeds with different maturity during stratification

2.2 層積過(guò)程中不同成熟度種子形態(tài)指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化

2.2.1 種子形態(tài)指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化

由圖3可知，隨層積時(shí)間增加，不同成熟度種子種長(zhǎng)、種寬、胚乳長(zhǎng)及胚乳寬等形態(tài)指標(biāo)均呈現(xiàn)前期增加后期變緩趨勢(shì)。在層積40 d 以前，各形態(tài)指標(biāo)增長(zhǎng)幅度較大，40 d以后無(wú)變化。原因是層積前期種子吸水膨脹，各形態(tài)指標(biāo)數(shù)值變大，種子充分吸水膨脹后變化停止。

圖3 層積過(guò)中不同成熟度種子形態(tài)指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic change of seed morphology indexes of seeds with different maturity during stratification

三類成熟度種子種長(zhǎng)、種寬、胚乳長(zhǎng)及胚乳寬差別較大，這與各處理種子采收時(shí)種胚發(fā)育程度不同有關(guān)。成熟度越高，種胚發(fā)育程度也高，體積和質(zhì)量大，各形態(tài)指標(biāo)高于成熟度低處理。

2.2.2 胚形態(tài)指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化

由圖4可知，胚長(zhǎng)與胚率間為正相關(guān)關(guān)系，即胚長(zhǎng)越長(zhǎng)，胚率越大；層積過(guò)程中不同成熟度種子胚長(zhǎng)及胚率增長(zhǎng)幅度及達(dá)到最大增幅時(shí)間均有差異。

圖4 層積過(guò)程中不同成熟度種子胚長(zhǎng)及胚率動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic change of long embryo rate of seed embryos with different maturity during stratification

層積前，高、中和低三類成熟度種子胚長(zhǎng)及胚率差別明顯，胚長(zhǎng)分別為0.82、0.61和0.46 mm，胚率分別為17.47%、14.13%和12.74%。高成熟度種子胚長(zhǎng)及胚率為中成熟度種子1.34 和1.24 倍，是低成熟度種子1.78 和1.37 倍。中成熟度種子胚長(zhǎng)及胚率是低成熟度種子1.33 和1.11 倍。高成熟種子胚長(zhǎng)和胚率顯著高于中、低兩類成熟度種子。

層積至20 d 時(shí)，高、中、低三類成熟度種子胚長(zhǎng)分別為1.19、0.80 和0.55 mm，胚率分別為25.11%、18.22%和15.10%，較層積前胚長(zhǎng)增幅分別為45.12%、31.15%和19.57%，胚率增幅分別為43.73%、28.95%和18.52%。高成熟度種子胚長(zhǎng)和胚率增幅極顯著高于中、低成熟度種子，中成熟度種子極顯著高于低成熟度種子。

層積至40 d 時(shí)，高、中、低三類成熟度種子胚長(zhǎng)分別為1.86、1.15 和0.68 mm，胚率分別為36.74%、24.61%和17.64%，相比上一取樣時(shí)期胚長(zhǎng)增幅分別為56.30%、43.75%和23.64%，胚率增幅分別為46.32%、35.07%和16.82%。胚長(zhǎng)和胚率較上一層積時(shí)期增幅同樣表現(xiàn)為高成熟種子極顯著高于其他兩類成熟度種子。此時(shí)高成熟度種子胚長(zhǎng)及胚率增幅均達(dá)到最大值，而其他兩類成熟度種子尚未達(dá)到最大值。

層積至60 d 時(shí)，高、中、低三類成熟度種子胚長(zhǎng)分別為2.74、1.75 和0.98 mm，胚率分別為53.26%、36.92%和25.06%，相比上一取樣時(shí)期胚長(zhǎng)增幅分別為47.31%、52.17%和44.12%，胚率增幅分別為44.96%、50.02%和42.06%。中成熟度種子胚長(zhǎng)和胚率增幅極顯著高于高和低兩類成熟度種子，而高和低兩類成熟度種子之間差異不顯著。此時(shí)中成熟度種子胚長(zhǎng)及胚率增幅均已達(dá)層積期間最大值，比高成熟度種子增幅達(dá)到最大值時(shí)間晚20 d左右。

層積至80 d 時(shí)，高、中、低三類成熟度種子胚長(zhǎng)分別為3.36、2.41 和1.43 mm，胚率分別為64.74%、50.48%和36.37%，相比上一取樣時(shí)期胚長(zhǎng)增幅分別為22.63%、37.71%和45.92%，胚率增幅分別為21.55%、36.73%和45.13%。此時(shí)低成熟度種子胚長(zhǎng)和胚率增幅達(dá)到最大值，極顯著高于高、中兩類成熟度種子，比中成熟度種子增幅達(dá)到最大值時(shí)間晚20 d，比高成熟度種子晚40 d左右。

層積至100 d時(shí)，高、中、低三類成熟度種子胚長(zhǎng)分別為3.53、2.66和1.69 mm，胚率分別為67.41%、55.27%和42.75%，相比上一取樣時(shí)期胚長(zhǎng)增幅分別為5.06%、10.37%和18.18%，胚率增幅分別為4.12%、9.49%和17.54%。此時(shí)低成熟度種子胚長(zhǎng)和胚率增幅仍極顯著高于其他兩類成熟度種子。

層積至120 d 時(shí)，高、中、低三類成熟度種子胚長(zhǎng)分別為3.68、2.88 和1.82 mm，胚率分別為69.83%、59.60%和45.94%，相比上一取樣時(shí)期胚長(zhǎng)增幅分別為4.25%、8.27%和7.69%，胚率增幅分別為3.59%、7.83%和7.46%。此時(shí)，中、低兩類成熟度種子胚長(zhǎng)和胚率增幅均顯著高于高成熟度種子，而二者之間差異不顯著。

2.3 層積過(guò)程中不同成熟度種子發(fā)芽率動(dòng)態(tài)變化

由圖5可看出，三類成熟度種子層積至50 d時(shí)陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)芽現(xiàn)象，但不同成熟度種子在層積過(guò)程中種子發(fā)芽率均存在較大差別。

圖5 層積過(guò)程不同成熟度種子萌發(fā)率動(dòng)態(tài)變化Fig.5 Dynamic change of seed germination rate at different maturity during stratification

層積至50 d 時(shí)，高、中和低三類成熟度種子發(fā)芽率分別為16.96%、8.33%和3.89%。高成熟度種子發(fā)芽率約為中和低成熟度種子發(fā)芽率2.04 和4.36倍。高成熟度種子發(fā)芽率極顯著高于中和低兩類成熟度種子，中成熟種子發(fā)芽率極顯著高于低成熟度種子，說(shuō)明種子成熟度對(duì)種子發(fā)芽初期影響較大。

層積至60 d 時(shí)，高成熟度種子發(fā)芽率為23.65%，較上一層積時(shí)期增幅為39.45%。中成熟度種子發(fā)芽率為14.32%，較上一層積時(shí)期增幅為71.91%，增幅達(dá)到最大值。低成熟度種子發(fā)芽率為5.74%，較上一層積時(shí)期增幅為47.56%。高成熟度種子發(fā)芽率極顯著高于中和低成熟度種子，而發(fā)芽率增幅則表現(xiàn)為中成熟度種子極顯著高于高、低兩類成熟度種子。

層積至70 d 時(shí)，高成熟度種子發(fā)芽率為30.48%，發(fā)芽率增幅降低至28.88%。中成熟度種子發(fā)芽率為18.33%，增幅降低為28.00%。低成熟度種子發(fā)芽率為9.98%，增幅達(dá)到最大值，為73.87%。此時(shí)低成熟度種子發(fā)芽率增幅極顯著高于高和中兩類成熟度種子，而高和中兩類成熟度種子差異不顯著。

層積至80 d 時(shí)，高成熟度種子發(fā)芽率為35.42%，增幅為16.21%。中成熟度種子發(fā)芽率為23.13%，增幅為26.19%。低成熟度種子發(fā)芽率為14.41%，增幅為44.39%。此時(shí)低成熟度種子發(fā)芽率增幅仍極顯著高于高和中兩類成熟度種子，而中成熟度種子顯著高于高成熟度種子。

層積至90 d 時(shí)，高成熟度種子發(fā)芽率為38.08%，增幅降低為7.51%。中成熟度種子發(fā)芽率為26.40%，增幅為14.14%。低成熟度種子發(fā)芽率為17.35%，增幅為20.40%。低成熟度種子發(fā)芽率增幅極顯著高于高成熟度種子，顯著高于中成熟度種子。

層積至100 d 時(shí)，高成熟度種子發(fā)芽率為40.50%，增幅降至6.36%。中成熟度種子發(fā)芽率為29.95%，增幅為13.45%。低成熟度種子發(fā)芽率為20.58%，增幅為18.62%。低成熟度種子發(fā)芽率增幅極顯著高于高成熟度種子，顯著高于中成熟度種子。

層積至110 d 時(shí)，高成熟度種子發(fā)芽率為42.42%，增幅降低為4.74%。中成熟度種子發(fā)芽率為33.23%，增幅持續(xù)降低，為10.95%。低成熟度種子發(fā)芽率為24.24%，增幅變化小，為17.82%。低成熟度種子發(fā)芽率增幅仍極顯著高于高成熟度種子，顯著高于中成熟度種子。

層積至120 d 時(shí)，高成熟度種子發(fā)芽率為43.70%，增幅降至3.02%。中成熟度種子發(fā)芽率為34.90%，增幅為5.03%。低成熟度種子發(fā)芽率為28.41%，增幅為17.20%，此時(shí)低成熟度種子增幅極顯著高于高和中兩類成熟度種子，而高和中兩類成熟度種子增幅差異不顯著。

層積期間高、中和低三類成熟度種子發(fā)芽率為28%～44%，表現(xiàn)為高成熟度種子＞中成熟度種子＞低成熟度種子。說(shuō)明選擇高成熟度種子可提高發(fā)芽率、育苗效率和質(zhì)量。各處理發(fā)芽率低與老山芹是野生山野菜植物有關(guān)，這是其固有生物學(xué)特性。

3 討 論

由于人工選擇和長(zhǎng)期馴化結(jié)果，栽培植物（如各種農(nóng)作物）基因型、成熟期和種子成熟度相對(duì)一致，種子休眠性弱或休眠期短，因此種子成熟度差異對(duì)生產(chǎn)影響較小，栽培時(shí)可不考慮這一因素。野生植物未經(jīng)人工選擇和馴化過(guò)程，以物種為單位種植，種內(nèi)基因型多樣，成熟期不一致，種子成熟度差異較大。為適應(yīng)和抵御不良環(huán)境條件，野生植物種子多具有休眠特性，播種后需較長(zhǎng)時(shí)間才發(fā)芽，存在出芽率低、出苗不齊和育苗周期長(zhǎng)等問(wèn)題，給野生植物大規(guī)模人工栽培帶來(lái)困難。選擇成熟度相對(duì)一致高成熟度種子可縮短種子后熟過(guò)程，有利于提高種子處理效果和發(fā)芽率，使出苗整齊一致，便于管理。

植物后熟作用主要體現(xiàn)在種子后熟及果實(shí)后熟兩方面。后熟作用是指成熟種子或果實(shí)離開(kāi)母體后，仍需經(jīng)一系列生理生化變化后才完成生理成熟并具備發(fā)芽能力的生理過(guò)程[11]。種子后熟作用可分為形態(tài)后熟、生理后熟和形態(tài)生理后熟三種類型，其中老山芹種子屬于形態(tài)生理后熟類型。研究發(fā)現(xiàn)，成熟度較高（發(fā)育期120～130 d）時(shí)，可抑制“紅陽(yáng)”獼猴桃果實(shí)生理后熟代謝過(guò)程、延長(zhǎng)果實(shí)貨架期，保障果實(shí)品質(zhì)[12]。本研究中，高成熟度老山芹種子胚發(fā)育速率高于中、低成熟度種子，后熟過(guò)程顯著加快，表明種子成熟度差異可通過(guò)影響老山芹種胚發(fā)育速率進(jìn)而調(diào)控后熟過(guò)程完成。

種子萌發(fā)是指種子吸脹后一系列有序的形態(tài)發(fā)生和生理過(guò)程[13]，種子萌發(fā)受多種因素協(xié)同調(diào)控，其中種子成熟度差異對(duì)其影響較為關(guān)鍵。種子成熟度差異原因較多，植株不同部位種子其成熟度也不同。對(duì)川澤瀉（Alisma plantago- aquaticaLinn.）研究表明，主花莖第三輪及中上部位種子成熟度高于其他部位，且種子發(fā)芽率隨種子成熟度增加呈雙峰狀變化，即開(kāi)花后第20 天達(dá)到最大值（37.5%），而在第35 天達(dá)到次級(jí)高峰（31.3%）[14]。品種不同其種子成熟度也存在差異。研究發(fā)現(xiàn)，北柴胡（Bupleurum chinenseDC.）綠熟及黃熟種子發(fā)芽率顯著高于褐熟及黑熟種子[15]。成熟度差異與種子活力有密切關(guān)系。益智（Alpinia oxyphyllaMiq.）果實(shí)開(kāi)花后110 d時(shí)種子活力最大，此時(shí)種子成熟度達(dá)到最高、種子發(fā)芽率達(dá)到最大值，為最佳采收時(shí)期[16]。成熟度差異與種子硬實(shí)性有關(guān)。硬實(shí)苦參（Sophora flavescensAit．）種子其成熟度相對(duì)較高，繼而種子發(fā)芽率及發(fā)芽勢(shì)也表現(xiàn)出顯著優(yōu)越性[17]。成熟度差異與種子儲(chǔ)存時(shí)間有關(guān)。研究不同成熟期穿心蓮[Andrographis paniculata(Burm. f.) Nees]種子休眠和發(fā)芽規(guī)律發(fā)現(xiàn)，儲(chǔ)存9 個(gè)月高成熟度（灰棕色種皮）種子達(dá)到50%發(fā)芽率可比低成熟度（灰紫色種皮）種子提早兩天[18]。成熟度差異與種子采收時(shí)期有關(guān)。于大花杓蘭（Cypripedium macran?thumSw.）授粉后60 和75 d 收集種子為早熟種子，此時(shí)種子成熟度中等，若播種在培養(yǎng)基上其發(fā)芽率及原球莖形成率均顯著高于未成熟（45 d，成熟度低）和成熟（90 d，成熟度高）種子[19]。研究枇杷[Eriobotrya japonica(Thunb.) Lindl.]不同種種子發(fā)芽率及苗高發(fā)現(xiàn)，完熟期采收的品種“大房”種子其發(fā)芽率顯著高于轉(zhuǎn)色期種子，而品種“軟條白沙”種子發(fā)芽后苗高（43.3%）顯著高于轉(zhuǎn)色期果實(shí)[20]。種子成熟度差異還與坐果時(shí)間有關(guān)。紫薇（Lagerstro?emia indicaL.）坐果后56 d 其種子（中成熟度）發(fā)芽率最高可達(dá)到93.86%，其次是坐果后63 d種子（高成熟度）發(fā)芽率為86.39%，坐果后49 d 種子（低成熟度）發(fā)芽率最低為80.71%[21]。本研究中，以種子質(zhì)量作為種子成熟度分類標(biāo)準(zhǔn)，將老山芹種子分為高成熟度（平均質(zhì)量12.5 mg）、中成熟度（平均質(zhì)量9.2 mg）和低成熟度（平均質(zhì)量6.1 mg）3組，通過(guò)對(duì)層積過(guò)程中種胚形態(tài)發(fā)育指標(biāo)測(cè)定、對(duì)比發(fā)現(xiàn)，成熟度差異與種子質(zhì)量密切相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，高成熟度種子其發(fā)芽率也較高。漆樹[Toxicodendron vernicifluum(Stokes) F. A. Barkl.]地面收集及完全成熟的種子在發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及種子活力指數(shù)等方面均顯著優(yōu)越于半成熟度和未成熟的種子[22]。同樣，高成熟度（紅果）構(gòu)樹[Brous?sonetia papyifera(Linn.)]果實(shí)種子發(fā)芽率最高，而低成熟度（微紅果）果實(shí)種子發(fā)芽率較低，未成熟（青果）種子未出現(xiàn)發(fā)芽現(xiàn)象[23]。本研究中，隨層積時(shí)間增加，不同成熟度種子發(fā)芽率不斷升高，其中高成熟度種子發(fā)芽率（42.42%）顯著高于其他兩個(gè)成熟度種子，結(jié)果表明老山芹種子成熟度越高其發(fā)芽率越高。

本研究結(jié)果表明播種和層積處理時(shí)選擇高成熟度種子有利于提高層積效果和出芽率，這為提高野生植物育苗技術(shù)提供新思路和新措施。今后仍需對(duì)不同成熟度老山芹種子生理后熟過(guò)程作進(jìn)一步探究，包括測(cè)定糖類、可溶性蛋白等貯藏物質(zhì)含量及調(diào)控物質(zhì)代謝關(guān)鍵酶活性等，以深入研究種子成熟度差異對(duì)老山芹種子后熟過(guò)程的影響機(jī)制。

4 結(jié) 論

a.層積過(guò)程中不同成熟度老山芹種子胚發(fā)育進(jìn)程有區(qū)別，成熟度越高，胚發(fā)育進(jìn)程越快。高成熟度種子每經(jīng)歷一個(gè)胚發(fā)育時(shí)期所需層積天數(shù)為20 d，而中和低成熟度種子為24 d。

b. 高、中和低三類成熟度種子種長(zhǎng)、種寬、胚乳長(zhǎng)及胚乳寬等形態(tài)指標(biāo)在層積40 d 前增加，40 d后基本無(wú)變化。胚長(zhǎng)、胚率及發(fā)芽率均表現(xiàn)為高成熟度＞中成熟度＞低成熟度。

c.本試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，高成熟度種子發(fā)芽率可達(dá)42.42%，高于中和低成熟度種子。