橡膠樹PR107和CATAS8-79中膠乳蛋白的差異分析及磷酸化蛋白的鑒定

王丹　徐兵強　孫勇　彭存智　常麗麗　仝征

摘 ?要：橡膠樹是合成天然橡膠的重要植物。PR107和CATAS8-79是具有不同產(chǎn)排膠性狀的2個無性系。在以往的研究中，膠乳中蛋白表達差異被認為是影響天然橡膠合成的關(guān)鍵因子之一。然而，這2個無性系之間與膠乳產(chǎn)量相關(guān)的蛋白質(zhì)圖譜尚未明確。本研究采用蛋白質(zhì)組學方法對這些蛋白質(zhì)進行鑒定，有助于探討巴西橡膠樹膠乳合成機理。經(jīng)雙向凝膠電泳和質(zhì)譜鑒定分析，共獲得65個差異表達蛋白信息。通過磷酸化蛋白質(zhì)組分析，在PR107膠乳中鑒定出31個磷酸化蛋白質(zhì)，含有74個磷酸化氨基酸殘基，在CATAS8-79膠乳中鑒定出80個磷酸化蛋白質(zhì)，含有166個磷酸化氨基酸殘基。橡膠延伸因子/小橡膠粒子蛋白（REF/SRPP）家族成員被鑒定為差異表達蛋白和磷酸化修飾蛋白，這些蛋白在調(diào)節(jié)天然橡膠合成中起著重要作用。pro-hevein和hevamine也表現(xiàn)出不同的磷酸化修飾水平，它們主要在天然橡膠排膠過程中起作用。一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白磷酸酶激酶的磷酸化和去磷酸化修飾可能在天然橡膠合成中起調(diào)節(jié)作用。這些結(jié)果為天然橡膠生物合成調(diào)控機制的研究提供了新的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：巴西橡膠樹;天然橡膠生物合成;磷酸蛋白質(zhì)組;雙向凝膠電泳（2-DE）中圖分類號：S794.1??????文獻標識碼：A

Comparative Proteomics Analysis and Identification of Phosphorylated Protein in Latex of Rubber Tree Clones PR107 and CATAS8-79

Abstract： Hevea brasiliensisis an important plant for producing natural rubber. RP107 and CATAS8-79 are two clones ofH. brasiliensis with different properties of rubber production and expulsion. The study of protein function in the latex may help understand the regulatory mechanism related to the properties of rubber production and expulsion. This study aimed to compare and analyze the difference in latex protein between RP107 and CATAS8-79 at the level of protein accumulation and post-translational modification. Through the two-dimensional gel electrophoresis （2-DE） analysis， 65?proteins derived from 88?spots were found to be accumulated differently in the latex between the 2 clones. Among the proteins， 44 proteins had high accumulation in the latex of PR107 and 21 had high accumulation in the latex of CATAS8-79. The high-accumulation proteins （HAPs） in the latex of CATAS8-79?were involved in intracellular organelles， external encapsulating structure， and membrane-bound organelles in terms of cellular component， and most of them had drug-binding activity and hydrolase activity. Different from CATAS8-79， the HAPs in the latex of PR107 participated in a catalytic complex， nonmembrane-bound organelles， and apoplasts. Most of them had protein-binding and transferase activities.?Furthermore， some proteins related to natural rubber synthesis and latex agglutination were found in DAPs. The rubber elongation factors?（REFs）?and small rubber particle?proteins （SRPPs）?were identified. The two classes of proteins played an important role in natural rubber biosynthesis in rubber trees. Some proteins mediating rubber particle aggregation （RPA） and participating in response to tapping?were found in DAPs too. To determinate the phosphorylated proteins and amino acids in the latex of the two clones， the phosphopeptides were enriched using a Fe-NTA Phosphopeptide Enrichment Kit and shotgun analysis was performed through the high-throughput Tandem Mass Spectrometer （MS/MS）. 74 phosphorylated amino acid residues derived from 31 phosphorylated proteins， as well as 166 phosphorylated amino acid residues derived from 80 phosphorylated proteins， were identified in PR107 and CATAS8-79， respectively. Among the phosphorylated proteins， 25 proteins of PR107 and 74 proteins of CATAS8-79 were specific in terms of the phosphorylation amino acids. Between the two clones， the members of REF/SRPP protein family， which regulate the synthesis of nature rubber （NR） in the latex， have high differentiation capacity at both protein accumulation and phosphorylation modification levels. The pro-hevein and hevamine proteins， which influence the process of rubber expulsion， also showed diversity at the phosphorylation modification level. The phosphorylation and dephosphorylation of an serine/threonine protein phosphatase kinase might play a regulatory role in NR synthesis. The results could?provide a new theoretical basis for the study of the regulatory mechanism of NR biosynthesis.0BDA810A-096C-422E-A41F-86589E036572

Keywords： Hevea brasiliensis; natural rubber biosynthesis;?phosphoproteome;?two-dimensional gel electrophoresis （2-DE）

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.05.004

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）是目前最具商業(yè)價值的天然橡膠來源^[1]。天然橡膠是在橡膠樹樹皮下韌皮部乳管系統(tǒng)的乳管細胞中合成的，適當?shù)母钇茦淦@得膠乳^[2]。自首次證明膠乳中含有蛋白質(zhì)以來^[3]，采用蛋白質(zhì)組學技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，膠乳蛋白參與諸如天然橡膠的生物合成、對病原體的防御、傷口愈合和抗應(yīng)激能力等代謝途徑的調(diào)控^[4]。基于雙向凝膠電泳技術(shù)（2-DE）結(jié)合質(zhì)譜的鑒定技術(shù)首先應(yīng)用于膠乳及其亞細胞組織中蛋白質(zhì)的檢測，確定膠乳中含有乳膠過敏原類蛋白質(zhì)^[5]、幾丁質(zhì)酶類蛋白^[6]以及包括橡膠延伸因子（REF）/小橡膠粒子蛋白（SRPP）在內(nèi)的天然橡膠合成關(guān)鍵蛋白^[7]。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，高通量非凝膠液質(zhì)連用質(zhì)譜檢測技術(shù)應(yīng)用于膠乳蛋白質(zhì)研究，大量膠乳蛋白質(zhì)及其翻譯后修飾位點被成功鑒定^[8-10]，穩(wěn)定同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）技術(shù)的應(yīng)用部分揭示了橡膠樹膠乳中天然橡膠生物合成調(diào)控機制^[11-12]。目前，雖然巴西橡膠樹膠乳中蛋白質(zhì)功能的研究取得一定突破，但這些蛋白參與的代謝途徑的確切調(diào)控機制仍不清楚，膠乳中與天然橡膠產(chǎn)量密切相關(guān)的調(diào)控機理尚未明確。

巴西橡膠樹的產(chǎn)量是由不同因素決定的，其中一個關(guān)鍵因素是割膠后排膠的持續(xù)時間。幾丁質(zhì)酶，β-1，3-葡聚糖酶，hevein蛋白以及hevein蛋白前體與細胞骨架結(jié)合一起形成了阻礙膠乳流出的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，縮短了排膠時間^[13]。類糊精中的幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶作為凝固因子在橡膠顆粒聚集中起著關(guān)鍵作用^[14]。對橡膠樹無性系CATAS7-33-97和CATAS8-79進行比較分析發(fā)現(xiàn)，水通道蛋白基因和乙烯生物合成關(guān)鍵基因表達增加，膠乳凝集因子基因表達減少等促進了割膠后排膠的過程^[15]。隨著膠乳中茉莉酸途徑和甲羥戊酸途徑（MVA）的激活，質(zhì)膜內(nèi)在蛋白、蔗糖轉(zhuǎn)運體、蔗糖合酶和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）合酶促進了天然橡膠的合成^[15]。然而，在橡膠樹高產(chǎn)和低產(chǎn)品系之間，天然橡膠生物合成途徑相關(guān)基因的表達水平?jīng)]有發(fā)現(xiàn)顯著差異^[16]。

橡膠樹無性系PR107由印度尼西亞培育^[17]。對PR107的膠乳合成特性分析表明，PR107具有較強的蔗糖代謝和基礎(chǔ)代謝能力，能優(yōu)先利用蔗糖合成天然橡膠，具有較強的抵御非生物脅迫能力^[16]。CATAS8-79是中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院自主培育的一個無性系，具有高產(chǎn)、早熟等優(yōu)良性狀^[18]。CATAS8-79的流速和排膠持續(xù)時間高于PR107^[19]?；贑ATAS8-79和PR107之間的膠乳轉(zhuǎn)錄組測序及差異表達分析，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性乙烯水平、乳管細胞壁木質(zhì)素含量和葡聚糖酶的表達與排膠持續(xù)時間有關(guān)^[19]。這2個無性系的差異基因組學、蛋白質(zhì)組學和轉(zhuǎn)錄組學分析可以揭示天然橡膠合成的一些分子機制。

蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTM）是天然橡膠合成途徑的重要調(diào)控方式之一。在這個過程中，一些激酶對蛋白質(zhì)的磷酸化起著重要的作用。羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）是MVA途徑中的一種關(guān)鍵酶，調(diào)節(jié)巴西橡膠樹的天然橡膠合成途徑^[20]。SUGDEN等^[21]發(fā)現(xiàn)SNF1相關(guān)蛋白激酶（SnRK1）對HbHMGR1活性的影響主要是調(diào)節(jié)其Ser577氨基酸殘基的磷酸化水平。在菠菜葉中，SnRK1通過調(diào)節(jié)HMGR蛋白的非活化的Ser577氨基酸位點的磷酸化來調(diào)控類異戊二烯和蔗糖的合成。一些研究還表明，天然橡膠合成相關(guān)蛋白的PTMs是橡膠樹的重要調(diào)控機制。在CATAS7-33-97中，許多與橡膠生物合成相關(guān)的蛋白質(zhì)被磷酸化。從16種橡膠延伸因子（REF）和7種小橡膠粒子蛋白（SRPP）異構(gòu)體中鑒定出138種獨特的磷酸化肽，包含129種磷酸化氨基酸^[12]。TONG等^[22]也發(fā)現(xiàn)PR107和CATAS8-79中有許多REF和SRPP被磷酸化，其中一些是PR107或CATAS8-79所特有的。0BDA810A-096C-422E-A41F-86589E036572

盡管橡膠合成相關(guān)蛋白的磷酸化修飾是一種常見現(xiàn)象，但蛋白質(zhì)磷酸化與天然橡膠合成之間的關(guān)系尚未被揭示。本研究的目的是通過蛋白質(zhì)組學分析，發(fā)現(xiàn)PR107和CATAS8-79膠乳蛋白之間的差異積累和磷酸化修飾蛋白信息，為天然橡膠生物合成調(diào)控機制的研究提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1材料

以橡膠樹無性系PR107和CATAS8-79為研究對象，PR107是由云南省熱帶作物科學研究所于1957年由印度尼西亞引進的優(yōu)良無性系品種，因其在栽培中后期的橡膠產(chǎn)量、耐刺激割膠、抗病性、立木材積量等方面表現(xiàn)優(yōu)良，于1962年選為云南大規(guī)模推廣種植品種^[17]。CATAS8-79是從1973年‘熱研88-13（母本）和‘熱研217（父本）的人工授粉苗中選出建立的具備早熟高產(chǎn)優(yōu)良性質(zhì)的無性系，2001年通過全國農(nóng)作物品種審定委員會審定^[18]。研究用橡膠樹種植在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院儋州市試驗農(nóng)場。從每個無性系中選擇30棵樹（8年樹齡，未開割）進行分析。

1.2 方法

1.2.1 ?膠乳采集及相關(guān)指標測定??割膠后，丟棄前20滴膠乳，在冰上用離心管收集隨后排出的膠乳。收集的膠乳被帶回實驗室作進一步分析。收集割膠后1?min內(nèi)流出的膠乳，檢測膠乳體積，計算初始膠乳流速。同時收集割膠后流出的所有膠乳，當2滴膠乳滴落間隔超過1?h后停止收集，測定膠乳產(chǎn)量。每個生理指標測定30個生物學重復。

1.2.2 ?蛋白質(zhì)提取及雙向電泳??膠乳中的蛋白質(zhì)提取過程如下：將3 mL膠乳添加到5 mL冷提取緩沖液（100 mmol/L乙二胺四乙酸、50 mmol/L維生素C、50 mmol/L硼砂、1%Triton X-100、1%交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮PVPP、2% β-巰基乙醇、30%蔗糖和100 mmol/L?Tris-HCl，pH 8.0）。旋渦震蕩10?min后，向管中加入8?mL?Tris飽和苯酚（pH>7.8），震蕩10 min，隨后4℃，15?000g，離心15 min。收集上層酚相，加入5倍體積的預(yù)冷過飽和硫酸銨甲醇溶液，在–20℃沉淀12?h。沉淀用冰甲醇和丙酮洗滌，自然干燥，沉淀用蛋白質(zhì)裂解緩沖液（2?mol/L硫脲、7?mol/L尿素、2% 3-[（3-膽酰胺丙基）二甲氨基]-丙磺酸鹽CHAPS、1%IPG緩沖液、13?mmol/L二硫蘇糖醇DTT）重新溶解。以BSA作為標準品，用Bradford法測定蛋白質(zhì)樣品的濃度。

從2個無性系的膠乳中提取各1300?μg蛋白質(zhì)樣品加入線性梯度IPG條（24 cm，pH 4～7）中，在25℃下持續(xù)水化18?h。等電聚焦后，用含有1% DTT的溶液ES（50?mmol/L?Tris pH 8.8，30%甘油，6?mol/L尿素，2%SDS和0.002%溴酚藍）平衡15?min，用含有4% 碘乙酰胺的ES平衡15?min。經(jīng)SDS-PAGE（12.5%）進行蛋白質(zhì)的電泳分離。凝膠用考馬斯亮藍染料染色12?h，并用圖像掃描儀III獲取凝膠圖譜。使用ImageMaster 2D Platinum軟件進行圖像分析。每組樣品進行3次生物學重復。

1.2.3??差異積累蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定??在3個生物學重復中，蛋白質(zhì)相對表達豐度變化量大于2倍的蛋白點稱為差異積累蛋白點（DAP）。人工切除凝膠上的DAP斑點并進行胰蛋白酶消化，大致過程如下：在室溫下用50%乙腈（V/V）/50 mmol/L?NH₄HCO₃溶液脫色至膠粒透明，在37℃條件下用含有5 pmol胰蛋白酶的100 mmol/L?NH₄HCO₃酶解16 h。瞬時離心后，取0.8 ?L酶解液加在基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）板（384 Opti-TOF）樣品位上，待其干燥后，再向每個樣品上加入0.8??L 5?mg/mL基質(zhì)（氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）溶解于50%乙腈和0.1%三氟乙酸）。待樣品完全干燥后，用5800 MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀進行鑒定。質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過Protein Pilot軟件（5.0版）進行分析，并根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫進行檢索（ftp：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Hevea_bra siliensis/protein/），該數(shù)據(jù)庫包括58?062個蛋白序列和27?683?334個多肽信息。DAPs的成功鑒定標準為肽段評分大于32，P值小于0.05，至少匹配2條可信多肽，匹配氨基酸序列覆蓋率大于4%。

1.2.4 ?抗體制備及蛋白表達量檢測（Western blotting） ?構(gòu)建攜帶DAPs目的基因的重組質(zhì)粒pET-30a，并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（Rosetta DE3）。用0.5 mmol/L?IPTG對重組大腸桿菌進行蛋白誘導。目的蛋白經(jīng)His標記純化。分別用Freund完全佐劑和Freund不完全佐劑乳化后，分次皮下注射新西蘭大白兔，經(jīng)多次免疫后獲得含有多克隆抗體的兔血清。獲得的抗體血清用于PR107和CATAS8-79膠乳樣品中蛋白表達量的檢測：10?μg膠乳蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，將凝膠中的蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜。用DAPs多克隆兔抗體和HRP結(jié)合抗兔IgG孵育PVDF膜。PVDF膜在黑暗的環(huán)境中經(jīng)試劑盒顯色和并用LAS-4000微型成像儀檢測DAPs蛋白條帶的圖像。所有的Western blotting進行3次生物學重復。0BDA810A-096C-422E-A41F-86589E036572

1.2.5??PR107和CATAS8-79膠乳磷酸化蛋白的富集與鑒定??分別取1?mg PR107和CATAS8-79的膠乳蛋白用于磷酸化蛋白鑒定，酶解后的多肽使用Pierce Fe NTA磷酸肽富集試劑盒富集磷酸肽：將酶解后的肽段用200?μL結(jié)合緩沖液重新懸浮并加載到Fe-NTA自旋柱。在室溫下孵育20?min后，將柱轉(zhuǎn)移到微型離心管中，并在室溫下以1000g離心1?min。使用C18柱和UltiMate 3000系統(tǒng)收集并分離磷酸肽。將收集的組分通過HPLC（Dionex Ultra 3000 nano）-ESI-MS/MS（Triple TOF 5600，ABsciex）系統(tǒng)進行分離鑒定。質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)使用ProteinPilot軟件V5.0（ABsciex）分析，獲得磷酸化蛋白質(zhì)和氨基酸位點的信息。質(zhì)譜鑒定成功的標準：未使用的置信度得分≥1.3，至少有2個匹配的多肽具有高于95%的置信度和低于1%的錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR），所有的樣品進行3個生物學重復。

1.2.6??生物信息學分析 ?使用Blast2-GO軟件對來自2-DE的DAPs和不同磷酸化蛋白進行GO基因通路分析，使用WEGO軟件進行GO基因富集分析（http：//wego.genomics.org.cn/）。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?PR107和CATAS8-79膠乳指標測定

測定了無性系PR107和CATAS8-79的膠乳流速后發(fā)現(xiàn)，2個無性系間差異極顯著。在CATAS8-?79中，割膠后的第1分鐘內(nèi)收集到約為（4.1±0.5）mL膠乳，而在PR107中只收集到（2.5±0.3）mL膠乳（圖1A）。測量了來自同一無性系的不同植株的膠乳產(chǎn)量，其中CATAS8-79收集到（139±25.6）mL膠乳，而PR107僅收集到（53±13.9）mL膠乳（圖1B）。

2.2 ?PR107和CATAS8-79膠乳中差異積累蛋白質(zhì)的鑒定及分析

經(jīng)膠乳蛋白質(zhì)提取及雙向凝膠電泳分離后，在無性系PR107的凝膠上檢測到豐度Vol>0.01%的蛋白點1301±87個，豐度在0.005%～0.01%之間的蛋白點660±47個。在無性系CATAS8-79的凝膠上，檢測到豐度Vol>0.01%的蛋白點1132±63個，0.005%～0.01%之間的蛋白點634±23個。其中88個蛋白點的豐度發(fā)生了2倍及以上的變化（P<0.05）。PR107凝膠中檢測到64個蛋白斑點的豐度高于CATAS8-79凝膠中相同蛋白斑點2倍以上（圖2A）。CATAS8-79凝膠中檢測到24個蛋白斑點的豐度高于PR107凝膠中的2倍以上（圖2B）。這些斑點中含有的蛋白是PR107和CATAS8-79膠乳中差異積累蛋白質(zhì)。使用MALDI-TOF/TOF-MS對88個蛋白斑點進行了鑒定，成功鑒定到65種差異蛋白質(zhì)。其中44個蛋白在PR107膠乳中有高積累，21個蛋白在CATAS8-79膠乳中有高積累。

在這些差異蛋白中發(fā)現(xiàn)了一些與天然橡膠合成和膠乳凝集有關(guān)的蛋白質(zhì)，并通過Western blot進行驗證（圖2C）。含有258個氨基酸的27.3-kDa REF（REF258， ref|XP_021653592.1）的7種異構(gòu)體在2個無性系的膠乳中顯示出差異積累（點13、14、18、24、67、68和73，表1）。這些異構(gòu)體具有不同的等電點（pI）和分子量（MW）。其中3個（點67、68和73）在PR107膠乳中積累較高，而在CATAS8-79中積累較低。含有175個氨基酸的19.6-kDa REF（REF175， ref|XP_?021653600.1）的2個異構(gòu)體（點77和78）在PR107膠乳中積累較高，一個異構(gòu)體（點19）在PR107膠乳中積累較低。與REF不同，含有204個氨基酸的22.3-kDa SRPP（SRPP204， ref|XP 021653597.1）的2種異構(gòu)體（點74和75）和含有243個氨基酸的27.1-kDa SRPP（SRPP243， ref|XP 021662186.1）的一種異構(gòu)體（點62）在2個無性系之間具有不同的表達水平，并且在PR107的膠乳中具有較高的積累。乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶在PR107的膠乳中有較高的積累（點41和43）（表1，圖2A和圖2B），該蛋白是橡膠生物合成中二磷酸異戊烯酯的來源，與橡膠產(chǎn)量和品質(zhì)密切相關(guān)。

一些介導橡膠顆粒聚集（RPA）和參與割膠反應(yīng)的蛋白質(zhì)也被成功鑒定。在PR107中，橡膠蛋白前體pro-hevein（spot 85）在膠乳中有較高的積累（表1，圖2C）。熱休克70 kDa蛋白的2種異構(gòu)體（點26和28）在PR107膠乳中存在積累差異，而在CATAS8-79膠乳中僅檢測到一種異構(gòu)體（點1）存在差異（表1，圖2C）。2個無性系之間的western印跡也證實了膠乳中的pro-hevein和熱休克70 kDa蛋白積累的差異（圖2C）。

此外，CATAS8-79膠乳中的高積累蛋白（HAPs）在細胞成分上涉及胞內(nèi)細胞器、外包囊結(jié)構(gòu)和膜結(jié)合細胞器，其中大部分具有藥物結(jié)合活性和水解酶活性。與CATAS8-79不同，PR107膠乳中的HAPs參與催化復合物、非膜結(jié)合細胞器和質(zhì)外體，大多數(shù)具有蛋白質(zhì)結(jié)合和轉(zhuǎn)移酶活性。在CATAS8-79中，大多數(shù)HAPs參與初級代謝過程、有機物代謝過程、氮化合物代謝過程和分解代謝過程。此外，參與毒素分解代謝過程的蛋白質(zhì)在CATAS8-79的膠乳中具有高積累，而參與響應(yīng)非生物和生物刺激的蛋白質(zhì)在PR107的膠乳中具有高積累（圖3A）。0BDA810A-096C-422E-A41F-86589E036572

2.3 ?PR107和CATAS8-79膠乳中磷酸化蛋白質(zhì)的鑒定

在PR107膠乳中鑒定出31個磷酸化蛋白，含有74個磷酸化氨基酸，置信度高于95%。這些磷酸化氨基酸包括56個絲氨酸殘基、13個蘇氨酸殘基和5個天冬氨酸殘基。在CATAS8-79膠乳中共鑒定出80種磷酸化蛋白，含有166個磷酸化氨基酸，這些磷酸化氨基酸包括141個絲氨酸殘基、22個蘇氨酸殘基和3個天冬氨酸殘基。在這些磷酸化蛋白中，有9個磷酸化蛋白包含17個磷酸化氨基酸（14個絲氨酸殘基和3個蘇氨酸殘基）只是在PR107中鑒定到，有58個磷酸化蛋白包含103個磷酸化氨基酸（92個絲氨酸殘基和11個蘇氨酸殘基）只在CATAS8-79中鑒定到。在PR107中，更多的磷酸化蛋白參與構(gòu)成多種細胞成分，如膜、共質(zhì)體、細胞連接和細胞外區(qū)域。在CATAS8-79中，更多的磷酸化蛋白參與多細胞組織過程、細胞成分組織或生物發(fā)生、色素沉著和免疫系統(tǒng)過程。與PR107相比，在CATAS8-79的膠乳中發(fā)現(xiàn)更多具有催化活性的蛋白質(zhì)被磷酸化修飾（圖3B）。

在這些磷酸化蛋白中，有7種蛋白參與了天然橡膠的合成、膠乳再生和膠乳排出時間的調(diào)控，但是它們在不同橡膠樹無性系中的磷酸化修飾位點不同。在PR107中，REF258的第49個氨基酸殘基被磷酸化（Ser49th），而在CATAS8-79中，是第3個氨基酸殘基被磷酸化（Ser3rd）（表2，圖4）。REF138的asp80、asp100和asp107僅在PR107中發(fā)生磷酸化。SRPP117的Ser45th、SRPP204的Ser26th、SRPP243的Ser109th和HMGR的Ser20th僅在CATAS8-79中發(fā)生磷酸化修飾（表2和圖4）。pro-hevein在PR107和CATAS8-79膠乳中的磷酸化程度不同（表2）。

一些參與應(yīng)激反應(yīng)和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的蛋白質(zhì)在PR107和CATAS8-79之間也具有不同的磷酸化位點。在PR107膠乳中，Hsp70-Hsp90組織蛋白3（ref|xp_021641666.1）和應(yīng)激相關(guān)蛋白（ref|xp_?021653583.1和ref|xp_021653585.1）中發(fā)現(xiàn)了更多的磷酸化氨基酸（表2）。此外，在信號轉(zhuǎn)導過程中起重要作用的pleckstrin同源結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)（ref|xp_021682526.1和ref|xp_021659098.1）在CATAS8-79中有更多的氨基酸殘基被磷酸化修飾。

3??討論

3.1 橡膠蛋白前體和幾丁質(zhì)酶的積累和磷酸化差異可能是影響膠乳凝集的重要因素之一

在巴西橡膠樹膠乳的C-血清、橡膠粒子和黃色體中，小橡膠粒子蛋白（SRPP）、葡聚糖酶（glucanase）、hevamine、hevein等蛋白通常與膠乳凝集有關(guān)^{[14， 23]}。在本研究中，CATAS8-79的流速和總產(chǎn)膠量明顯高于PR107，CATAS8-79中這些相關(guān)蛋白的表達或修飾情況可能會更傾向于增加膠乳的流動性，相互作用共同保持其較高的初始流速及最終高的產(chǎn)量。作為一種凝集素蛋白，橡膠樹蛋白前體（pro-hevein）通過與橡膠粒子膜相互作用而顯示出各種凝集特性^[24]。pro-hevein的N端結(jié)構(gòu)域帶有幾丁質(zhì)結(jié)合基序，C端結(jié)構(gòu)域可以與幾丁質(zhì)結(jié)合活性協(xié)同提供凝集活性^[25]。在本研究中，PR107中pro-hevein的豐度是CATAS8-?79的3.08倍。它也被鑒定為磷酸化蛋白，在CATAS8-79中，Pro-hevein在Barwin樣結(jié)構(gòu)域的Thr149處被磷酸化，該位置是一個C末端誘導結(jié)構(gòu)域^[24]。然而，在PR107中，pro-hevein的磷酸化位點位于Ser196th，更接近C末端（表2和圖4）。本研究認為Pro-hevein的表達量和磷酸化修飾的差異可能是影響PR107和CATAS8-79膠乳流出速度和產(chǎn)量的因子之一。

hevamine是一種具有溶菌酶和幾丁質(zhì)酶活性的植物防御蛋白^[26]。在橡膠樹中，hevamine通過堵塞乳管防止膠乳排出^[27]。諸多研究表明幾丁質(zhì)酶是決定割膠后膠乳流動持續(xù)時間的關(guān)鍵成員之一，在CATAS8-79中，割膠后膠乳幾丁質(zhì)酶基因（HbChit）下調(diào)表達^[24]。在本研究中，2個橡膠樹無性系中的hevamine-A樣蛋白（ref|xp_021671430.1）氨基酸殘基的Thr157th均發(fā)生磷酸化修飾，但在PR107的膠乳中檢測到更多含有Thr157th磷酸化位點的多肽，Thr157th位點的磷酸化修飾可能是hevamine-A行使其功能的重要修飾之一。

在膠乳凝集過程中，膠乳凝集素蛋白存在于黃色體膜上，與糖基化蛋白SRPP相互作用，充當連接橡膠粒子的多價橋梁^[28]。另一種可能是黃色體破裂后，黃色體膜內(nèi)的凝集素蛋白結(jié)合位點暴露并與SRPP結(jié)合。橡膠粒子在黃色體膜碎片上的聚集導致橡膠凝結(jié)^[29]。SRPP在膠乳凝集過程中發(fā)揮重要作用。與PR107相比，CATAS8-79膠乳中鑒定到SRPP上具備更多的磷酸化氨基酸位點，SRPP的不同磷酸化水平可能影響橡膠樹膠乳凝集過程。0BDA810A-096C-422E-A41F-86589E036572

3.2 ?磷酸化蛋白參與了PR107和CATAS8-79膠乳中橡膠合成的調(diào)控

天然橡膠的生物合成是橡膠樹乳管的主要代謝過程，這一過程涉及20多種酶反應(yīng)^[30]。在本研究中，SRPP204和SRPP243在蛋白表達水平和磷酸化修飾層面均與橡膠產(chǎn)量存在一定的相關(guān)性。REF258蛋白N端的ATP酶β-亞基結(jié)構(gòu)域第49位的氨基酸殘基僅在CATAS8-79膠乳中被磷酸化修飾。REF138中的3種氨基酸僅在PR107膠乳中磷酸化，REF/SRPP家族成員極有可能通過磷酸化修飾調(diào)控天然橡膠的合成。HMGR1是橡膠樹膠乳中主要的膠乳代謝相關(guān)蛋白之一^[20]。天然橡膠產(chǎn)量與橡膠樹中HbHMGR1表達水平顯著正相關(guān)^[31]。在橡膠草中（Taraxacum kok-saghyzR.），HMGR1在高橡膠產(chǎn)量橡膠草中表達量比較高，且與天然橡膠生產(chǎn)能力的相一致^[32]。在本研究中，PR107和CATAS8-79之間膠乳中HMGR1的蛋白積累沒有差異，但是2個橡膠樹無性系之間HMGR1在磷酸化水平上存在差異，可能與其產(chǎn)膠性狀相關(guān)。

3.3 蛋白磷酸化激酶參與了PR107和CATAS8-79膠乳的生物過程調(diào)控

蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)許多細胞過程的重要機制，如原核生物和真核生物的細胞壁生物合成、生物膜形成和應(yīng)激反應(yīng)^[33]。各種氨基酸殘基的磷酸化可控制蛋白質(zhì)–蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)聚集體的形成^[34]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶可通過在單個N-末端絲氨酸（蘇氨酸）殘基處特異性磷酸化來調(diào)節(jié)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性^[35]。在擬南芥中，STN7（絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶7的同源物）中絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化的動態(tài)調(diào)節(jié)對植物生長和環(huán)境適應(yīng)至關(guān)重要^[36]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶在調(diào)節(jié)膜相關(guān)功能、大分子生物合成過程和脂質(zhì)代謝中起著重要作用^[37]。激酶很可能通過自身的磷酸化和去磷酸化影響這些生物過程。在本研究中，PR107和CATAS8-79膠乳中一些絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族蛋白的氨基酸殘基發(fā)生了磷酸化修飾并存在差異，這一發(fā)現(xiàn)暗示這種激酶家族在PR107和CATAS8-79的乳管細胞壁形成及應(yīng)激反應(yīng)過程中可能存在不同的調(diào)控機制。

4 ?結(jié)論

橡膠樹無性系PR107與CATAS8-79在膠乳產(chǎn)量和割膠后膠乳排出持續(xù)時間上存在一定的差異。為了揭示天然橡膠合成和排膠的分子機理，本文對PR107和CATAS8-79的膠乳差異表達蛋白質(zhì)和磷酸化蛋白質(zhì)進行了比較分析。共檢測到88個差異蛋白點含有65個差異積累蛋白。其中44個蛋白在PR107膠乳中有較高的積累量，21個蛋白在CATAS8-79膠乳中有較高的積累量，在CATAS8-79膠乳中鑒定出80個獨特的磷酸化蛋白，包含166個磷酸化氨基酸。通過生物信息學分析，推測REF/SRPP超家族成員在2個無性系中通過蛋白表達和PTM調(diào)控天然橡膠合成的機制不同。基于某些形式的磷酸化修飾，橡膠蛋白前體和幾丁質(zhì)酶可能在膠乳凝集過程中起重要作用。一種絲氨酸–蘇氨酸蛋白磷酸酶激酶家族成員的磷酸化和去磷酸化也可能參與天然橡膠的合成和膠乳的排出。

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