贛南早’臍橙在干旱脅迫下的生理及轉(zhuǎn)錄組研究

劉林芝　歐陽(yáng)歡　李興濤　陳健美

‘

摘 ?要：我國(guó)臍橙產(chǎn)區(qū)的季節(jié)性干旱對(duì)臍橙產(chǎn)量和品質(zhì)影響較大?！M南早臍橙作為一個(gè)新品種臍橙，目前在我國(guó)臍橙產(chǎn)區(qū)已大面積推廣。為深入了解這個(gè)新品種的耐旱性，探究早熟品種‘贛南早臍橙應(yīng)對(duì)干旱脅迫的調(diào)控機(jī)制，以‘贛南早臍橙與‘紐荷爾臍橙（對(duì)照）為材料，測(cè)定比較不同干旱脅迫程度下二者光合作用、干旱相關(guān)生理指標(biāo)等差異，并通過(guò)RNA-Seq分析比較轉(zhuǎn)錄水平差異及抗氧化物酶基因表達(dá)調(diào)控。結(jié)果表明：干旱脅迫下‘贛南早臍橙凈光合速率（P_n）、蒸騰速率（T_r）、氣孔導(dǎo)度（G_s）均顯著高于‘紐荷爾臍橙;隨著干旱脅迫程度增加，‘贛南早臍橙葉片較‘紐荷爾臍橙更舒展，‘贛南早臍橙相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量顯著低于‘紐荷爾臍橙，而保護(hù)酶超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化物歧化酶（POD）活性變化幅度更大;‘贛南早臍橙和‘紐荷爾臍橙葉片可溶性糖含量無(wú)顯著性差異，復(fù)水后，‘紐荷爾臍橙葉片中可溶性糖含量極顯著高于‘贛南早臍橙。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析表明，干旱脅迫0、10、20 d時(shí)，‘贛南早臍橙和‘紐荷爾臍橙間DEGs數(shù)量分別為1266、683、658個(gè)。GO富集分析顯示，在干旱脅迫過(guò)程中‘贛南早臍橙差異基因主要集中在細(xì)胞蛋白修飾過(guò)程、高分子修飾作用、含磷化合物代謝過(guò)程、蛋白修飾過(guò)程等通路，而‘紐荷爾臍橙未見(jiàn)明顯富集。KEGG富集分析顯示，除了富集于淀粉及蔗糖通路和氨基酸及核苷酸糖代謝途徑，‘贛南早臍橙其他差異基因富集途徑與‘紐荷爾臍橙基本一致。差異基因轉(zhuǎn)錄因子分析顯示二者在ERF家族、MYB家族、NAC家族、MYB_related家族、WRKY家族、bHLH家族、HB-other家族、HSF家族、B3家族和bZIP家族均有分布，此外，‘贛南早臍橙特異分布于GRAS家族。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析篩選出抗氧化酶相關(guān)基因30個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)48%，下調(diào)表達(dá)52%。本研究結(jié)果為‘贛南早響應(yīng)干旱脅迫的生理變化提供理論依據(jù)，并為其抗旱性研究提供分子基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：臍橙;干旱脅迫;光合作用;酶活性;丙二醛;轉(zhuǎn)錄組分析中圖分類號(hào)：S666.4??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Physiological and Transcriptome Analysis of ‘Gannan Zao Navel Orange under Drought Stress

Abstract： The seasonal drought in the navel orange producing areas in China has a great impact on the yield and quality of navel orange. ‘Gannan zao navel orange， a new variety， is widely popularized in navel orange producing areas in China. In order to deeply understand the drought tolerance of ‘Gannan zao and explore its regulation mechanism on drought stress， the differences of photosynthesis and drought related physiological indexes between ‘Gannan zao and ‘Newhall under different drought stress were measured， and the transcriptional differences and the regulation of antioxidant enzyme gene expression were compared by RNA-seq analysis. The results showed that the net photosynthetic rate （P_n）， stomatal conductance （G_s） and transpiration rate （T_r） of ‘Gannan zao were significantly higher than those of ‘Newhall under drought stress. With the increase of drought stress， the leaves of ‘Gannan zao were more stretched than that of ‘Newhall， and the relative conductivity and malondialdehyde content of ‘Gannan zao were significantly lower than that of ‘Newhall， while the activities of protective enzymes superoxide dismutase and peroxide dismutase changed more. There was no significant difference in soluble sugar content between ‘Gannan zao and ‘Newhall. After rehydration， the soluble sugar content of ‘Newhall was significantly higher than that of ‘Gannan zao . Transcriptome sequencing analysis showed that the number of DEGs between ‘Gannan Zao and ‘Newhall was 1266， 683 and 658 respectively at 0， 10 and 20 days of drought stress. Go enrichment analysis showed that the differential genes of ‘Gannan zao were mainly concentrated in the process of cell protein modification， protein modification， polymer modification and phosphorus compound metabolism， while ‘Newhall was not significantly enriched. KEGG enrichment analysis showed that the differential gene concentration pathways of ‘Gannan Zao and ‘Newhall were basically the same， while ‘Gannan zao was also enriched in starch and sucrose pathway and amino acid and nucleotide sugar metabolism pathway. ‘Gannan zao was also enriched in starch and sucrose pathway and amino acid and nucleotide sugar metabolism pathway. Both transcription factors were in ERF family， MYB family， NAC family， MYB_Related family， WRKY family， bHLH family， HB-other family， HSF family， B3 family and bZIP family were distributed. In addition， ‘Gannan zao was specifically distributed in GRAS family. According to the transcriptome molecular results， 30 antioxidant enzyme related genes were screened， of which 48% were up-regulated and 52% were down regulated. The results of this study would provide a theoretical basis for the physiological changes of gannanzao in response to drought stress， and provide a molecular basis for the study of its drought resistance.9A12BED8-D238-43C5-A21B-7259BF963ED4

Keywords： navel orange; drought stress; photosynthesis; enzymatic activity; malondialdehyde; transcriptome analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.05.003

柑橘（Citrus L.）是蕓香科、柑橘屬植物，是世界上種植面積和產(chǎn)量最大的水果。我國(guó)是柑橘的主要原產(chǎn)國(guó)之一，正逐漸向區(qū)域化、商品化、良種化、專業(yè)化、集約化等方向發(fā)展^[1]。以贛南臍橙為主的江西優(yōu)勢(shì)柑橘產(chǎn)業(yè)帶，季節(jié)性干旱頻率較高，危害嚴(yán)重，引起柑橘產(chǎn)量和品質(zhì)下降，是柑橘生產(chǎn)上亟待解決的問(wèn)題之一^[2]。水分是柑橘生長(zhǎng)過(guò)程中的必要條件^[3]。當(dāng)植物體處于干旱脅迫環(huán)境條件下時(shí)，可以通過(guò)氣孔關(guān)閉減少水分蒸發(fā)，調(diào)節(jié)可溶性糖含量，以保證植株正常代謝，抵抗逆境帶來(lái)的危害^[4]。隨著干旱脅迫程度增加，植物細(xì)胞膜過(guò)氧化程度增加，丙二醛（malonaldehyde， MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）和過(guò)氧化物歧化酶（peroxidase， POD）等保護(hù)酶可以反應(yīng)植物對(duì)干旱脅迫的耐受程度^[5]。不同的植物其生理物質(zhì)的活性和含量在干旱脅迫條件下存在差異，有關(guān)‘贛南早臍橙在此方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。‘贛南早臍橙（‘Gannan Zaonavel orange， GNZ）是從‘紐荷爾臍橙（‘Newhallnavel orange， NHE）中選育的芽變品種，有其獨(dú)特的品質(zhì)，具有轉(zhuǎn)色快、糖積累快、低酸等特性^[6]，比目前主栽品種‘紐荷爾臍橙早熟30?d以上^[7]，‘贛南早臍橙是臍橙主產(chǎn)區(qū)用于品種結(jié)構(gòu)調(diào)整的一個(gè)優(yōu)良早熟品種，在臍橙產(chǎn)區(qū)種植面積已超6666.67 hm²。本研究以‘贛南早臍橙與其對(duì)照‘紐荷爾臍橙為材料，研究二者在干旱脅迫下的主要生理指標(biāo)響應(yīng)差異，并進(jìn)一步分析其抗旱能力及基因表達(dá)差異。本研究有助于深入了解‘贛南早臍橙抗旱性，為新品種‘贛南早臍橙的栽培技術(shù)與大面積推廣提供參考，同時(shí)為柑橘抗旱遺傳改良提供重要的基因資源。

1 ?材料與方法

1.1 材料

1.1.1 ?植物材料??自然干旱試驗(yàn)材料‘贛南早（Gannan Zao， GNZ）臍橙和‘紐荷爾（Newhall， NHE）臍橙種植于江西省贛州市信豐縣正平鎮(zhèn)‘贛南早臍橙基地，為4年生枳殼砧臍橙樹(shù)，同排種植，每個(gè)品種各選3株。盆栽控水干旱試驗(yàn)材料來(lái)自贛南師范大學(xué)國(guó)家臍橙工程技術(shù)研究中心柑橘種質(zhì)資源圃，是‘贛南早臍橙和‘紐荷爾臍橙枳殼砧一年半生苗，每個(gè)品種各20株苗。對(duì)自然干旱材料進(jìn)行光合指標(biāo)測(cè)定，生理及轉(zhuǎn)錄組分析材料均取自盆栽控水干旱試驗(yàn)材料，生理指標(biāo)測(cè)定材料于干旱處理0、5、10、15、20?d和復(fù)水5?d（F5）時(shí)取‘贛南早和‘紐荷爾臍橙成熟枝條葉片，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析材料取干旱處理0、10、20?d的葉片。樣品液氮速凍后，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室–80℃保存?zhèn)溆?，以上取樣均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.1.2 ?干旱處理??自然干旱處理為2019年9—11月田間自然干旱60 d進(jìn)行光合指標(biāo)測(cè)定，期間贛南地區(qū)連續(xù)無(wú)超10 mm降水且試驗(yàn)用樹(shù)未人工施水，復(fù)水5?d后再次測(cè)定。盆栽控水干旱處理材料生長(zhǎng)環(huán)境一致（盆高38 cm，直徑25 cm，基質(zhì)為園土∶甜葉菊渣∶沙土=1∶1∶1），正常管理6個(gè)月后，在處理前正常澆水3?d，最后一次澆透水后進(jìn)行控水處理，分別處理0、5、10、15、20?d，干旱處理20 d后復(fù)水5 d，并拍照記錄葉片形態(tài)。

1.2 方法

1.2.1 ?生理指標(biāo)測(cè)定??光合作用參數(shù)凈光合速率（P_n）、氣孔導(dǎo)度（G_s）、胞間CO₂濃度（C_i）和蒸騰速率（T_r）使用Li-6400XT便攜式光合儀測(cè)定，設(shè)定空氣流速為500?mol/s，CO₂濃度400?μmol/mol。相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛及葉片可溶性糖含量測(cè)定操作參考《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》^[8]，用電導(dǎo)率儀（雷磁DDS-307，上海）測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率值。分別用硫代巴比妥酸法、蒽酮比色法檢測(cè)并計(jì)算丙二醛和可溶性糖含量^[9]，超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶活性測(cè)定^[9]采用氮藍(lán)四唑法和愈創(chuàng)木酚法。

1.2.2 ?轉(zhuǎn)錄組測(cè)序??由美吉生物科技有限公司（上海，中國(guó)）對(duì)‘贛南早臍橙和‘紐荷爾臍橙干旱處理0、10、20 d葉片，共18個(gè)樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，以甜橙基因組為參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)分析。參考基因組來(lái)源：Citrus_sinensis， http：//citrus.hzau.edu.cn/orange/download/index.php，參考基因組版本：hzau。Illumina平臺(tái)通過(guò)將測(cè)序圖像信號(hào)經(jīng)CASAVA堿基識(shí)別（base calling）轉(zhuǎn)換成文字信號(hào)，并將其以fastq格式儲(chǔ)存起來(lái)作為原始數(shù)據(jù)。根據(jù)index序列區(qū)分各個(gè)樣本的數(shù)據(jù)，以便進(jìn)行后續(xù)分析。原始數(shù)據(jù)已上傳NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，SubmissionID：SUB10857158，BioProjectID：?PRJNA792482。9A12BED8-D238-43C5-A21B-7259BF963ED4

1.2.3??轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)質(zhì)量控制??為保證后續(xù)分析的準(zhǔn)確性，使用SeqPrep和Sickle軟件處理原始數(shù)據(jù)，去除reads中的接頭序列，將序列末端（3'端）低質(zhì)量（質(zhì)量值小于20）的堿基修剪掉，如剩余序列中仍然有質(zhì)量值小于10的堿基，則將整條序列剔除，去除含N（模塊堿基）的reads，舍棄去adapter及質(zhì)量修剪后長(zhǎng)度小于30?bp的序列，并對(duì)質(zhì)控后的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。

1.2.4??轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)分析??利用表達(dá)定量軟件RSEM分別對(duì)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，差異基因表達(dá)量及篩選，使用DESeq2軟件對(duì)樣本進(jìn)行分析，參數(shù)：P-adjust<0.05 & |log2FC|≥1。采用軟件Goatools對(duì)DEGs進(jìn)行GO富集分析，F(xiàn)isher精確檢驗(yàn)，用Bonferroni方法對(duì)P值進(jìn)行校正，P值（FDR）<0.05。采用R腳本對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG PATHWAY富集分析，F(xiàn)isher精確檢驗(yàn)，P值（correctedP-value）以0.05為閾值，滿足此條件的KEGG通路定義為在基因集中顯著富集的KEGG通路。采用PlantTFDB 4.0（http：//planttfdb.?cbi.pku.edu.cn/）對(duì)差異基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子分析。

1.3??數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2007軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、分析和作圖，并用SPSS Statistical 23.0軟件分析差異顯著性。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?自然干旱脅迫下‘贛南早和‘紐荷爾臍橙葉片形態(tài)及光合指標(biāo)差異

葉片卷曲程度是植物受干旱脅迫最直觀的表現(xiàn)，從表型觀察來(lái)看（圖1），干旱脅迫15 d時(shí)，‘紐荷爾臍橙葉片已出現(xiàn)卷曲，但‘贛南早臍橙葉片仍舒展，在干旱脅迫20 d時(shí)，‘贛南早臍橙葉片出現(xiàn)輕微卷曲，‘紐荷爾臍橙葉片卷曲程度更加嚴(yán)重，復(fù)水后葉片均恢復(fù)舒展。

在自然干旱60 d時(shí)測(cè)定田間‘贛南早臍橙和‘紐荷爾臍橙葉片凈光合速率（P_n）、氣孔導(dǎo)度（G_s）、胞間CO₂濃度（C_i）和蒸騰速率（T_r），與復(fù)水后光合作用參數(shù)，結(jié)果表明，自然干旱下‘贛南早臍橙的G_s和T_r值極顯著高于‘紐荷爾臍橙，P_n顯著高于‘紐荷爾臍橙。復(fù)水后，‘贛南早臍橙的P_n值極顯著高于‘紐荷爾臍橙，‘贛南早臍橙的T_r值顯著高于‘紐荷爾臍橙，而G_s、C_i值無(wú)顯著性差異（表1）。

2.2 干旱脅迫下‘贛南早和‘紐荷爾臍橙葉片電導(dǎo)率、丙二醛及可溶性固形物含量

相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量等可判斷柑橘干旱脅迫下細(xì)胞膜受損傷程度。結(jié)果表明，干旱處理前‘贛南早和‘紐荷爾臍橙葉片相對(duì)電導(dǎo)率差異不顯著，干旱處理中二者相對(duì)電導(dǎo)率值均呈上升趨勢(shì)，且在復(fù)水后下降（圖2A）。在干旱脅迫10 d，‘紐荷爾的相對(duì)電導(dǎo)率顯著高于‘贛南早臍橙，干旱脅迫15、20 d和復(fù)水5 d后極顯著高于‘贛南早臍橙。

如圖2B所示，干旱處理下，‘紐荷爾臍橙葉片丙二醛含量呈上升趨勢(shì)，而‘贛南早臍橙在干旱脅迫5～10 d時(shí)呈下降趨勢(shì)，后又迅速積累。干旱脅迫0、10、15?d時(shí)‘紐荷爾臍橙的丙二醛含量極顯著高于‘贛南早臍橙，干旱脅迫5、20 d時(shí)‘贛南早臍橙丙二醛含量顯著高于‘紐荷爾臍橙，復(fù)水后均下降。

可溶性糖含量檢測(cè)結(jié)果表明（圖2C），二者葉片可溶性糖含量在干旱脅迫0～5 d時(shí)呈下降趨勢(shì)，且‘紐荷爾臍橙在干旱處理15 d時(shí)顯著高于‘贛南早臍橙，二者在干旱脅迫15、20 d時(shí)含量均增加，復(fù)水后均下降，但‘紐荷爾臍橙葉片可溶性糖含量極顯著高于‘贛南早臍橙。

2.3 干旱脅迫下‘贛南早和‘紐荷爾臍橙葉片保護(hù)酶活性

保護(hù)酶活性檢測(cè)結(jié)果表明（圖3A），在干旱處理中，‘贛南早和‘紐荷爾臍橙葉片SOD活性均呈先降后升趨勢(shì)，‘贛南早葉片SOD活性在干旱處理5 d后呈上升趨勢(shì)，而‘紐荷爾臍橙在10 d后呈上升趨勢(shì)，且均在復(fù)水后下降。

如圖3B所示，在干旱處理0 d時(shí)，‘紐荷爾臍橙葉片POD活性顯著高于‘贛南早臍橙，0～10 d時(shí)POD活性均下降，10～20 d時(shí)POD活性均增強(qiáng)，且干旱處理10、15?d時(shí)‘贛南早臍橙葉片POD活性極顯著高于‘紐荷爾臍橙，復(fù)水后，‘贛南早臍橙葉片POD活性仍增強(qiáng)，而‘紐荷爾臍橙葉片POD活性下降。

2.4 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

對(duì)‘贛南早和‘紐荷爾臍橙在干旱脅迫0、10、20 d下的18個(gè)轉(zhuǎn)錄組樣本進(jìn)行測(cè)序（表2），共獲得130.96 Gb clean reads，各樣本過(guò)濾后堿基數(shù)均在6.12 Gb及以上，GC含量均在44.50%左右，較穩(wěn)定，Q₂₀≥97.71%，Q₃₀>93.19%，錯(cuò)誤率在0.025%左右，表明此測(cè)序結(jié)果及質(zhì)控效果較好，可用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析。9A12BED8-D238-43C5-A21B-7259BF963ED4

2.5 干旱脅迫下‘贛南早臍橙和‘紐荷爾臍橙的差異表達(dá)基因

將干旱脅迫0、10、20 d的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析（圖4），在相同脅迫時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行比較，‘贛南早和‘紐荷爾臍橙間獲得了大量差異表達(dá)基因（DEGs），分別為1266、683、658個(gè)，

其中上調(diào)基因數(shù)為350、231、410個(gè)，下調(diào)基因數(shù)為916、452、248個(gè)。以干旱脅迫0 d為對(duì)照，‘贛南早臍橙在脅迫10、20 d時(shí)差異基因數(shù)為3942、3304個(gè)，‘紐荷爾臍橙在脅迫10、20 d時(shí)分別有236、2041個(gè)差異表達(dá)基因。干旱脅迫10 d和20 d比較，‘贛南早臍橙鑒定出3752個(gè)差異表達(dá)基因，而‘紐荷爾臍橙差異基因?yàn)?108個(gè)，以上篩選出的差異基因均為下調(diào)表達(dá)更多。

2.6差異表達(dá)基因GO富集分析及KEGG富集分析

為闡明差異表達(dá)基因行使的基因功能，采用軟件Goatools對(duì)差異基因進(jìn)行GO富集分析，按P-adjust<0.05的條件選取top20的富集結(jié)果，干旱脅迫0 d和10 d差異基因?qū)Ρ确治霭l(fā)現(xiàn)，‘贛南早臍橙2組間的差異基因主要集中在細(xì)胞蛋白修飾過(guò)程（cellular protein modification process）、蛋白修飾過(guò)程（protein modification process）、高分子修飾作用（macromolecule modification）、含磷化合物代謝過(guò)程（phosphate-con taining compound metabolic process）、磷代謝過(guò)程（phosphorus metabolic process）和小分子代謝過(guò)程（small molecule metabolic process）（圖5A），而‘紐荷爾臍橙未見(jiàn)明顯富集。干旱脅迫0?d與20?d差異基因?qū)Ρ劝l(fā)現(xiàn)，‘贛南早和‘紐荷爾臍橙差異基因均集中于生物學(xué)過(guò)程（biological?process）。此外，‘贛南早臍橙還特異性富集于氧化還原酶（oxidoreductase activity）、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）、磷酸化作用（phosphorylation）和氧己酸代謝過(guò)程（oxoacid metabolic process）等通路中（圖5B、5C）。

采用R腳本對(duì)樣本差異基因進(jìn)行KEGG PATHWAY富集分析，功能分類及PATHWAY注釋顯示（圖6），按P-adjust<0.05的條件選取top20的富集結(jié)果，干旱脅迫0 d和10 d差異基因?qū)Ρ确治霭l(fā)現(xiàn)，‘贛南早臍橙差異基因主要集中在植物MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway-?plant）、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（plant hormone signal transduction）和苯丙烷生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）（圖6A），而‘紐荷爾臍橙主要集中在苯丙烷生物合成、倍半萜和三萜生物合成（sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工（protein processing in endoplasmic reticulum）通路（圖6C）。干旱脅迫0?d和20?d差異基因?qū)Ρ确治霭l(fā)現(xiàn)，‘贛南早臍橙還富集在

植物-病原相互作用（plant-pathogen interaction）通路中（圖6B），而‘紐荷爾富集在光合作用（photosynthesis）、光合生物的固碳作用（carbon fixation in photosynthetic organisms）和糖酵解/糖異生（glycolysis/glucon eogenesis）途徑（圖6D）。此外，‘贛南早臍橙特異性富集于淀粉及蔗糖通路（starch and sucrose metabolism）和氨基酸及核苷酸糖代謝（amio sugar and nucleotide sugar metabolism）途徑。

2.7轉(zhuǎn)錄因子分析及抗氧化保護(hù)酶相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

植物響應(yīng)干旱脅迫過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor， TFs）發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。本研究對(duì)4組比較組獲得的差異基因進(jìn)行了

轉(zhuǎn)錄因子分析，結(jié)果顯示，‘贛南早臍橙和‘紐荷爾臍橙轉(zhuǎn)錄因子在ERF家族、MYB家族、NAC家族、MYB_related家族、WRKY家族、bHLH家族、HB-other家族、HSF家族、B3家族和bZIP家族均有分布。二者比較發(fā)現(xiàn)，‘紐荷爾臍橙特異性分布于LBD（AS2/LOB）家族、ARF家族和AP2家族，‘贛南早臍橙特異性分布于GRAS家族。干旱脅迫0 d和10 d對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，‘贛南早臍橙差異基因主要分布于ERF家族（29個(gè)）（圖7A），‘紐荷爾臍橙為WRKY家族（7個(gè)）（圖7C），干旱脅迫0 d和20 d對(duì)比分析表明，‘贛南早臍橙差異基因主要分布于MYB家族（23個(gè)）（圖7B），‘紐荷爾臍橙為bHLH家族（17個(gè)）（圖7D）。

根據(jù)差異基因富集分析及轉(zhuǎn)錄因子分析結(jié)果，從轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因中挖掘出30個(gè)編碼抗氧化保護(hù)酶基因（表3），過(guò)氧化物酶（POD）基因Cs8g17370、Cs7g05450、Cs2g25450和Cs2g03110等上調(diào)表達(dá)，Cs3g21730、Cs6g20170、Cs7g19270、Cs1g18600和Cs9g05140等下調(diào)表達(dá)。編碼抗壞血酸過(guò)氧化物酶（aseorbateperoxidase， APX）基因Cs8g17370和Cs7g05450上調(diào)表達(dá)，而Cs7g05430下調(diào)表達(dá)。編碼超氧化物歧化酶（SOD）基因Cs8g15520和過(guò)氧化氫酶（catalase，?CAT）基因Cs3g27280均下調(diào)表達(dá)。9A12BED8-D238-43C5-A21B-7259BF963ED4

3 ?討論

凈光合速率反應(yīng)植物的光合能力的大小^[10]，隨著凈光合速率增大，植物消耗CO₂量增大，胞間CO₂減少，植物就通過(guò)增大氣孔導(dǎo)度獲取更多的CO₂^[11]。在自然干旱條件下，‘贛南早臍橙凈光合速率及氣孔導(dǎo)度均高于‘紐荷爾臍橙，說(shuō)明‘贛南早臍橙在干旱脅迫下的光合作用能力強(qiáng)于‘紐荷爾臍橙。通常細(xì)胞膜能維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，但干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞膜破壞導(dǎo)致大量電解質(zhì)外滲，因此可以根據(jù)植物在干旱脅迫下的相對(duì)電導(dǎo)率來(lái)評(píng)估其抗旱性。同時(shí)，當(dāng)植物在逆境條件下，往往發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用，丙二醛是其產(chǎn)物之一，通常利用它表示植物對(duì)逆境反應(yīng)的強(qiáng)弱^[12]。本研究結(jié)果表明，隨著干旱脅迫天數(shù)增加，‘贛南早和‘紐荷爾臍橙葉片相對(duì)電導(dǎo)率值均上升，且‘贛南早臍橙的相對(duì)電導(dǎo)率值

均低于‘紐荷爾臍橙，說(shuō)明干旱脅對(duì)‘紐荷爾臍橙葉片細(xì)胞損傷程度大于‘贛南早臍橙。二者葉片丙二醛含量也均呈上升趨勢(shì)，在脅迫10、15?d時(shí)‘紐荷爾臍橙葉片丙二醛含量高于‘贛南早臍橙，說(shuō)明‘紐荷爾臍橙葉片膜脂過(guò)氧化程度比‘贛南早臍橙高，細(xì)胞膜受損更嚴(yán)重。

SOD、POD是植物中防止膜脂過(guò)氧化的重要酶，因此SOD和POD活性能較好地反映植物對(duì)逆境的耐受能力^[13-14]，植物為避免細(xì)胞遭到氧化損傷，通過(guò)自我調(diào)節(jié)啟動(dòng)一系列抗氧化酶清除過(guò)量的活性氧物質(zhì)，超氧化物歧化酶（SOD）是第一個(gè)參與植物細(xì)胞內(nèi)活性氧清除的抗氧化酶，當(dāng)SOD催化超氧根陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)后將產(chǎn)生H₂O₂和O₂，由POD和CAT等保護(hù)酶負(fù)責(zé)進(jìn)一步將H₂O₂分解成H₂O和O₂^[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫5 d時(shí)‘贛南早臍橙葉片SOD活性增強(qiáng)，而‘紐荷爾臍橙葉片SOD酶活性在干旱脅迫10 d時(shí)增強(qiáng)，且干旱脅迫10 d后‘贛南早臍橙葉片SOD活性顯著高于‘紐荷爾臍橙，而二者葉片POD活性變化較為一致，干旱脅迫10 d后活性均上升，且‘贛南早臍橙葉片POD活性極顯著高于‘紐荷爾臍橙，說(shuō)明與‘紐荷爾臍橙相比，‘贛南早臍橙對(duì)干旱脅迫環(huán)境刺激更敏感，干旱脅迫加劇時(shí)，通過(guò)提高保護(hù)酶活性來(lái)抵御干旱逆境能力更強(qiáng)。

轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控靶基因表達(dá)，在植物抵抗生物及非生物脅迫中起重要作用^[16]?！M南早臍橙和‘紐荷爾臍橙轉(zhuǎn)錄因子分析比較發(fā)現(xiàn)，‘贛南早臍橙特異性分布于GRAS家族，GRAS家族基因具有促進(jìn)分生組織發(fā)育，光敏信號(hào)傳導(dǎo)和GA代謝調(diào)節(jié)等作用^[17]，說(shuō)明‘贛南早臍橙抗干旱能力可能還與植物激素類代謝有關(guān)。干旱脅迫0 d和10 d對(duì)比發(fā)現(xiàn)，‘贛南早臍橙有29個(gè)差異基因分布于ERF家族，‘紐荷爾臍橙有7個(gè)差異基因分布于WRKY家族。干旱脅迫0 d和20 d對(duì)比分析表明，‘贛南早臍橙有23個(gè)差異基因分布于MYB家族，‘紐荷爾臍橙有17個(gè)差異基因分布于bHLH家族。ERF家族和MYB家族均為復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄因子家族，不僅在種子萌發(fā)等植物發(fā)育過(guò)程中起重要作用，而且一些基因已被證明在干旱、高溫等非生物脅迫中起重要作用^[18-21]，而WRKY家族通過(guò)調(diào)節(jié)激素類物質(zhì)代謝幫助植物抵抗逆境^[22]。bHLH家族則以結(jié)合作用，與其他蛋白互作響應(yīng)干旱脅迫^[23]，說(shuō)明干旱脅迫下ERF家族、MYB家族、WRKY家族和bHLH家族在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起重要作用，‘贛南早臍橙和‘紐荷爾臍橙對(duì)干旱脅迫耐受能力不同可能與轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控有關(guān)，有待進(jìn)一步發(fā)掘與考證。

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