核桃蛋白的酶解及脫色工藝優(yōu)化

王 薇，李亞娟，蔣 悅，沈明娟

（1. 贛南衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，江西 贛州 341000；2. 雪山中心學(xué)校，云南 臨滄 675906；3. 西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224）

核桃（Juglans regia L.）富含油脂、蛋白質(zhì)及維生素等營養(yǎng)成分，其中蛋白質(zhì)含量占比 14%～28%，消化吸收率可達85%[1-2]。核桃仁經(jīng)榨油后的餅粕是潛在的食品蛋白質(zhì)來源，但因所含蛋白質(zhì)的加工特性不理想，且色澤較深，限制了其在食品工業(yè)上的高值化應(yīng)用。

酶法水解蛋白質(zhì)具有反應(yīng)條件溫和、高效、成本低等優(yōu)點[3]。研究發(fā)現(xiàn)核桃蛋白經(jīng)不同程度酶解后，其溶解度、持水性、乳化性能、起泡性能等加工特性有所提高[4-5]，此外，核桃蛋白的抗氧化活性、二肽基肽酶IV抑制肽含量等也顯著增加[6-8]。因此，可通過蛋白酶的選擇和參數(shù)的優(yōu)化，獲得水解度（degree of hydrolysis，DH）較高的蛋白酶解產(chǎn)物，從而達到改善其功能性質(zhì)的目的。但由于蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后色澤加深，限制了其在食品工業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用?；钚蕴课匠Ｓ糜诘鞍酌附庖旱拿撋缃购妊芯苛嘶钚蕴繉β腰S多肽的最優(yōu)脫色工藝[9]，肖懷秋等優(yōu)化了活性炭對花生蛋白酶解液的脫色工藝[10]，而目前關(guān)于核桃蛋白酶解液脫色方面的研究較少，活性炭脫色可能會使蛋白被吸附損失，因此如何控制脫色的工藝條件，以獲得理想的脫色率和蛋白回收率，是核桃蛋白酶解液脫色的關(guān)鍵。

本文以核桃餅粕中蛋白質(zhì)為研究對象，采用單因素和正交實驗優(yōu)化胰蛋白酶水解核桃蛋白的工藝條件，并以脫色率和蛋白回收率為考察指標，優(yōu)化活性炭對核桃蛋白酶解液的脫色工藝，以期獲得優(yōu)良加工特性的核桃蛋白制品，本文對于核桃產(chǎn)業(yè)加工副產(chǎn)物的進一步開發(fā)利用具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷榨核桃餅：由迪慶香格里拉舒達有機食品有限公司提供。胰蛋白酶（酶活力70 000 U/g）、Folin-酚試劑：索萊寶生物科技有限公司；牛血清蛋白：上海伯奧生物科技有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、活性炭：天津市大茂化學(xué)試劑廠。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

5804R型多功能臺式高速冷凍離心機：美國Eppendorf公司；FJ200-SH數(shù)顯高速分散均質(zhì)機：上海標本模型廠；UV-2600紫外可見分光光度計：日本島津公司；F50型酶標儀：瑞士Tecan公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程

冷榨核桃餅→粉碎過篩→堿提酸沉→核桃蛋白→酶解工藝的優(yōu)化→滅酶（90 ℃, 15 min）→離心→上清液→脫色工藝的優(yōu)化[11]

1.3.2 核桃蛋白的制備

采用堿溶酸沉法提取核桃蛋白。核桃餅粕經(jīng)粉碎過60目篩后，按料液比1∶25（W/V）加入蒸餾水，以NaOH溶液調(diào)pH至8.7，于48 ℃攪拌提取1 h后，4 000 r/min離心20 min，取上清液以鹽酸溶液調(diào)至pH 5并在4 ℃靜置過夜，按上述條件離心取沉淀洗滌至中性，凍干為核桃蛋白（walnut protein，WP）[12]。

1.3.3 冷榨核桃餅和核桃蛋白主要理化指標的測定

觀察冷榨核桃餅、所提取核桃蛋白樣品的色澤和形態(tài)，其粗蛋白、水分、粗脂肪和灰分含量分別按照 GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》、GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》、GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》和 GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》中方法測定。

1.3.4 核桃蛋白酶解單因素實驗

稱取0.25 g核桃蛋白，控制底物質(zhì)量濃度為3%（W/V），pH為7.5，酶解溫度為55 ℃，加酶量為5 000 U/g，分別酶解1，2，3，4和5 h，經(jīng)90 ℃，15 min滅酶后，測定相應(yīng)條件下核桃蛋白酶解液的水解度，考察酶解時間對核桃蛋白水解度的影響。

同時，固定其它酶解參數(shù)條件，分別以底物濃度（2%、3%、4%、5%和6%，W/V），酶解溫度（45、50、55、60和65 ℃），加酶量（2 500、3 750、5 000、6 250和7 500 U/g）為單因素變量，考察底物濃度、酶解溫度、加酶量對核桃蛋白水解度的影響[16]。

1.3.5 核桃蛋白酶解正交實驗

根據(jù)單因素實驗所得結(jié)果，以酶解時間、底物濃度、酶解溫度、加酶量為影響因素，每個因素選 3個水平，設(shè)計 L9(34)正交實驗（如表 1所示），以水解度為指標，確定胰蛋白酶酶解核桃蛋白的最優(yōu)條件。

表1 酶解工藝正交實驗因素水平表Table 1 Factor level of enzymolysis orthogonal experiment

1.3.6 水解度的測定

核桃蛋白酶解液的水解度參照公式（1）和（2）計算。其中酶解液的總氮含量采用凱氏定氮法測定，氨基氮的含量采用甲醛滴定法測定，分別稱取一定量的兩份樣品于三角燒瓶，一份加入中性紅指示劑2～3滴，用0.100 mol/L NaOH溶液滴定終點，另一份加入麝香草酚酞3滴和中性甲醛20 mL，搖勻，以0.100 mol/L NaOH準溶液滴定至淡藍色[13]。

式中：DH為酶解液的水解度，%；N為氨基氮含量，%；N0為總氮含量，%。

式中：N為氨基氮含量，%；V1為以中性紅為指示劑滴定到終點所消耗的標準NaOH溶液體積，mL；V2為以麝香草酚酞為指示劑滴定到終點所消耗的標準 NaOH溶液體積，mL；W 為樣品的重量，g。

1.3.7 核桃蛋白酶解液脫色的單因素實驗

取核桃蛋白酶解液50 mL，調(diào)pH至4.5，分別添加 0.6%、0.8%、1.0%、1.2%和 1.4%的活性炭（W/V），于45 ℃水浴90 min后，6 000 r/min離心15 min，取上清液測定吸光度值和蛋白質(zhì)含量，以脫色率和蛋白質(zhì)回收率為指標，考察活性炭添加量對脫色效果的影響。

同時，固定其它脫色參數(shù)條件，分別以 pH（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0）、溫度（35、40、45、50、55 ℃）、時間（30、45、60、75、90 min）為單因素變量，考察pH、溫度和時間對脫色效果的影響。

1.3.8 核桃蛋白酶解液脫色的正交實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取活性炭用量、pH、溫度、時間四個因素進行正交實驗，每個因素三個水平，選擇 L9(34)正交表進行實驗，分別以脫色率、蛋白回收率和加權(quán)評分為考察指標，優(yōu)化核桃蛋白酶解液的脫色工藝，正交實驗因素水平表如表2所示。

表2 脫色工藝正交實驗因素水平表Table 2 Factor level of decolorization orthogonal experiment

1.3.9 核桃蛋白酶解液的脫色評價方法

取一定體積核桃蛋白酶解液，添加 1.2%（W/V）的活性炭，調(diào)節(jié)pH為4.5，并保溫90 min后，于6 000 r/min離心15 min，取上清液分別測定吸光度值和蛋白質(zhì)含量，根據(jù)公式（3）和（4）計算脫色率和蛋白質(zhì)回收率[14]。采用公式（5）的加權(quán)評分法考察酶解液的脫色效果[10,15]。

式中：X為脫色率，%；A0為核桃蛋白酶解液在314.5 nm處的吸光度；A為核桃蛋白酶解脫色液在314.5 nm處的吸光度。

式中：Y為蛋白回收率，%；W1為脫色后蛋白質(zhì)的含量，mg/mL；W2為脫色前蛋白質(zhì)含量，mg/mL。

式中：Z為脫色綜合評分；X為脫色率，%；Y為蛋白回收率，%。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗重復(fù) 3次，正交實驗采用 SPSS軟件分析，采用OriginPro 2019b 64-bit繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷榨核桃餅、核桃蛋白的主要物理化學(xué)指標

冷榨核桃餅、核桃蛋白的主要物理化學(xué)指標如表3所示。相較冷榨核桃餅，所提取的核桃蛋白色澤較淺，粒度較小，粗脂肪、水分和灰分含量低，粗蛋白含量接近90%，說明核桃蛋白樣品的純度較高，可用于下一步的酶解和脫色實驗。

表3 冷榨核桃餅及核桃蛋白的主要物理化學(xué)指標Table 3 Main physicochemical indicators of cold-pressed walnut meal and WP %

2.2 核桃蛋白酶解單因素水平的確定

2.2.1 加酶量對核桃蛋白水解度的影響

胰蛋白酶添加量對核桃蛋白水解度的影響如圖1所示，隨著胰蛋白酶添加量的增大（2 500～6 250 U/g），核桃蛋白水解度的增幅較大，而當加酶量繼續(xù)增加（>6 250 U/g），水解度上升的趨勢變緩，因此綜合成本等因素，選擇胰蛋白酶添加量為6 250 U/g進行下一步實驗。

圖1 加酶量對核桃蛋白水解度的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on DH of WP

2.2.2 底物濃度對核桃蛋白水解度的影響

底物濃度對核桃蛋白水解度的影響如圖 2所示，隨著底物濃度的增加（1%～3%，W/V），核桃蛋白的水解度大幅度上升，但當?shù)孜餄舛冗_ 3%（W/V）后，水解度呈下降趨勢，這可能是因為在低底物濃度時，核桃蛋白分散液的流動性好，酶與核桃蛋白更易接觸反應(yīng)，從而使水解度呈上升趨勢[17]；而當?shù)孜餄舛?3%（W/V），蛋白分散液的流動性變小，不利于酶的作用，水解度也隨之下降。因此，底物濃度宜選取3%（W/V）進行正交實驗。

圖2 底物濃度對核桃蛋白水解度的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on DH of WP

2.2.3 酶解溫度對核桃蛋白水解度的影響

酶解溫度對核桃蛋白水解度的影響如圖 3所示，隨著酶解溫度的升高（45～55 ℃），核桃蛋白的水解速度隨之加快，而當溫度升高到一定程度（>55 ℃），酶在高溫的作用下變性甚至失活，導(dǎo)致核桃蛋白的水解度下降[18]。因此，選取酶解溫度為55 ℃進行下一步優(yōu)化。

圖3 酶解溫度對核桃蛋白水解度的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on DH of WP

2.2.4 酶解時間對核桃蛋白水解度的影響

酶解時間對核桃蛋白水解度的影響如圖 4所示，隨著酶解時間的增加，核桃蛋白的水解度一開始呈大幅上升的趨勢，而當酶解時間超過 4 h后，水解度增幅減緩，綜合考慮生產(chǎn)效率和時間成本，選擇酶解時間4 h進行正交實驗優(yōu)化。

圖4 酶解時間對核桃蛋白水解度的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on DH of WP

2.3 正交實驗優(yōu)化核桃蛋白酶解工藝

核桃蛋白酶解的正交實驗結(jié)果及分析如表 4所示。由極差R可知，影響核桃蛋白酶解的各因素主次順序為B（底物濃度）> C（溫度）> D（加酶量）> A（時間），核桃蛋白的最佳酶解工藝為A3B2C2D2，即底物濃度3%，加酶量6 250 U/g，酶解溫度55 ℃，酶解時間5 h，在此條件下核桃蛋白的水解度最大。為避免偶然實驗因素造成誤差，對優(yōu)化的酶解工藝進行驗證，測得水解度為21.08%，高于表 4中的最大水解度（19.24%），說明 L9(34)正交實驗優(yōu)化的核桃蛋白酶解工藝準確可靠。

表4 酶解正交實驗結(jié)果及分析Table 4 Results and analysis of enzymolysis orthogonal experiment

2.4 核桃蛋白酶解液脫色單因素水平的確定

2.4.1 活性炭用量對核桃蛋白酶解液脫色效果的影響

活性炭對核桃蛋白酶解液脫色的單因素實驗結(jié)果如圖5所示。隨著活性炭用量的增大，核桃蛋白的脫色率逐漸增大，回收率逐漸減小。這是由于活性炭的用量增大，比表面積也隨之增加，可更高效地吸附酶解液中的色素物質(zhì)，同時，活性炭也會吸附酶解液中的蛋白（肽），導(dǎo)致蛋白含量的降低[19-20]。當活性炭用量為1.2%（W/V）時，脫色率達 68.68%，蛋白回收率為 81.75%，可在保留大部分核桃蛋白的前提下達到較好的脫色效果，因此選擇活性炭用量為 1.20%（W/V）進行正交實驗。

圖5 活性炭用量對核桃蛋白酶解液脫色效果的影響Fig.5 Effect of activated carbon dosage on decolorization of WP hydrolytes

2.4.2 pH對核桃蛋白酶解液脫色效果的影響

pH對核桃蛋白酶解液脫色效果的影響如圖6所示。當pH值為2.0～3.0時，活性炭對酶解液的脫色率逐漸增大，蛋白回收率逐漸減??；而當pH值為 3.0～6.0時，活性炭對酶解液脫色率逐漸減小，蛋白回收率逐漸增大。可能是因為酶解液中的色素物質(zhì)在酸性條件下與活性炭有較強的親和力，因而更容易被吸附脫色，同時，pH的變化也會影響蛋白酶解物的電荷和活性炭的表面化學(xué)性質(zhì)，導(dǎo)致一些小肽被活性炭吸附損失[14]。綜合考慮蛋白回收率和脫色率，選擇脫色pH值4.0進行下一步實驗。

圖6 pH對核桃蛋白酶解液脫色效果的影響Fig.6 Effect of pH on decolorization of WP hydrolytes

2.4.3 溫度對核桃蛋白酶解液脫色效果的影響

溫度對核桃蛋白酶解液脫色效果的影響如圖7所示。隨著溫度的升高，酶解液的脫色率呈先上升后下降的趨勢，而蛋白回收率則呈下降的趨勢。這是由于溫度升高可使酶解液的粘度降低，有利于色素物質(zhì)的擴散，從而與活性炭充分接觸，增強脫色的效果。但溫度繼續(xù)升高（>50 ℃）不利于物理吸附，脫色率隨之下降[19]。綜合考慮蛋白回收率和脫色率，選擇脫色溫度 45 ℃進行優(yōu)化實驗。

圖7 溫度對核桃蛋白酶解液脫色效果的影響Fig.7 Effect of incubating temperature on decolorization of WP hydrolytes

2.4.4 時間對核桃蛋白酶解液脫色效果的影響

時間對酶解液脫色效果的影響如圖 8所示。隨著脫色時間的延長，脫色率逐漸增大，蛋白回收率則逐漸減小。當脫色時間為75 min時，脫色效果較好，且蛋白回收率也相對較高。因此選擇脫色時間為75 min進行下一步實驗。

圖8 時間對核桃蛋白酶解液脫色效果的影響Fig.8 Effect of incubating time on decolorization of WP hydrolytes

2.5 正交實驗優(yōu)化核桃蛋白酶解液的脫色工藝

核桃蛋白酶解液脫色正交實驗的結(jié)果和直觀分析如表5所示。影響核桃蛋白酶解液脫色率的各因素主次順序為C(pH) > B(活性炭用量) > A(時間) > D(溫度)，最高脫色率的工藝為A3B2C1D3，即pH為3.0，活性炭用量為1.2%（W/V），溫度為50 ℃，脫色時間為90 min。影響核桃蛋白酶解液中蛋白回收率的各因素主次順序為 C(pH) >B(活性炭用量) > D(溫度) > A(時間)，最高蛋白回收率的工藝為A1B2C3D1，即pH為5.0，活性炭用量為 1.2%（W/V），溫度為 40 ℃，脫色時間為60 min。對加權(quán)綜合評分影響的主次順序為B(活性炭用量) > C(pH) > A(時間) > D(溫度)，最佳綜合評分組合為A3B2C2D2，即pH為4.5，活性炭用量為 1.2%（W/V），溫度為 45 ℃，脫色時間為90 min。為避免偶然因素造成誤差，對加權(quán)綜合評分的最佳實驗條件進行驗證，測得脫色率為78.05%，蛋白回收率為82.16%，加權(quán)綜合評分為80.11，說明 L9(34)正交實驗優(yōu)化的核桃蛋白酶解液最佳脫色工藝準確可靠。

表5 核桃蛋白酶解液脫色正交實驗結(jié)果及分析Table 5 Results and analysis of decoloring orthogonal experiment of WP hydrolytes

3 結(jié)論

本文以水解度為考察指標，通過單因素和正交實驗確定胰蛋白酶酶解核桃蛋白的最佳工藝為底物濃度 3%（W/V），溫度 55 ℃，加酶量為6 250 U/g，酶解時間5.0 h，在此條件下核桃蛋白的水解度為21.08%。以脫色率和蛋白回收率的加權(quán)綜合評分為考察指標，確定了活性炭對核桃蛋白酶解液脫色的最佳工藝條件為pH為4.5，活性炭用量 1.2%（W/V），溫度 45 ℃，脫色時間為90 min，在此條件下脫色率為78.05%，蛋白回收率為82.16%，加權(quán)綜合評分為80.11分。研究可為核桃餅粕中蛋白質(zhì)的高值化利用提供一定參考。