酶催化合成酰胺類(lèi)化合物的研究進(jìn)展

李正一, 陳永正, 萬(wàn)南微

(遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 貴州省生物催化與手性藥物合成重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 貴州省綠色制藥工程研究中心,貴州 遵義 563000)

酰胺鍵的合成是有機(jī)化學(xué)中最重要的反應(yīng)之一。酰胺類(lèi)化合物具有穩(wěn)定性高、極性大等特點(diǎn),因而被廣泛地應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域,尤其在醫(yī)藥和精細(xì)化學(xué)品中扮演著重要的作用,例如丙烯酰胺(1)、煙酰胺(2)、卡巴拉汀(3)、對(duì)乙酰氨基酚(4)、β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素(5)、多替拉韋(6)等(Scheme 1)。傳統(tǒng)的化學(xué)方法是將羧酸或其衍生物與胺偶聯(lián)形成酰胺類(lèi)產(chǎn)物,但需要使用有毒或危險(xiǎn)試劑以及昂貴的偶聯(lián)試劑,存在安全性、純化操作復(fù)雜和原子經(jīng)濟(jì)性不高等問(wèn)題[1-2]。例如,制備1 kg的抗艾滋病毒藥物Fuzeon需要45 kg的原料,其中并未包括合成和純化步驟中所使用的溶劑[3],原子經(jīng)濟(jì)性差。2007年,美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)綠色化學(xué)研究所舉行的制藥圓桌會(huì)議明確提出了酰胺鍵綠色高效合成的挑戰(zhàn)和重要意義[4]。生物催化技術(shù)反應(yīng)條件溫和且選擇性較高,為酰胺類(lèi)化合物的構(gòu)建提供了一種綠色合成策略,本文概述了應(yīng)用于合成酰胺類(lèi)化合物的各類(lèi)酶促反應(yīng)的研究進(jìn)展。

Scheme 1

Scheme 2

Scheme 3

1 腈水合酶

腈水合酶(Nitrile hydratase, NHase),是一類(lèi)作用于腈類(lèi)化合物的碳氮三鍵并通過(guò)水合反應(yīng)生成相應(yīng)酰胺類(lèi)化合物的酶,被廣泛地應(yīng)用于綠色高效地生產(chǎn)酰胺類(lèi)物質(zhì)。早在1980年,日本京都大學(xué)Asano實(shí)驗(yàn)室篩選并重新鑒定出一株菌RhodococcusrhochochrousJ1,首次將含CN基團(tuán)的有機(jī)腈轉(zhuǎn)化為含CONH2基團(tuán)的酰胺類(lèi)化合物的酶命名為腈水合酶[5-6]。其催化的水合反應(yīng)還能有效地避免副產(chǎn)物羧酸的產(chǎn)生,實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)上化學(xué)、區(qū)域和對(duì)映體的選擇性,展現(xiàn)出化學(xué)合成法無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)[7]。更重要的是,隨著生物信息學(xué)、蛋白質(zhì)工程、宏基因組學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展研究,其自身耐受性和穩(wěn)定性方面的缺陷正逐漸得到改善。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),腈水合酶的催化反應(yīng)機(jī)制是在該酶作用下使腈類(lèi)化合物轉(zhuǎn)化為酰胺類(lèi)化合物,如若有酰胺酶(Amidase)的存在,則再催化酰胺最終生成有機(jī)酸(Scheme 2a)[8]。繼上海市農(nóng)藥研究所微生物法丙烯酰胺生產(chǎn)技術(shù)研發(fā)成功之后,生物法煙酰胺工業(yè)化技術(shù)也隨之發(fā)展起來(lái),能使酶活力高達(dá)1000萬(wàn)單位/毫升發(fā)酵液(Scheme 2b)[9]。

值得引起關(guān)注的是腈水合酶應(yīng)用于治療癲癇的活性成分——左乙拉西坦的綠色合成。據(jù)專(zhuān)利報(bào)道[10],利用半理性設(shè)計(jì)的腈水合酶突變體能催化得到收率43%的產(chǎn)物,且副產(chǎn)物R-型異構(gòu)體可以回收利用,但總體產(chǎn)率較低(Scheme 3a)。最近Arndt等[11]開(kāi)發(fā)了一種新的左乙拉西坦的動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分和釕催化的細(xì)胞外陽(yáng)極氧化合成方法,產(chǎn)率提升至76%,ee值超過(guò)99%(Scheme 3b)。

依賴(lài)ATP的酶包含很多,例如ATP抓取酶(ATP-grasp)、酰胺鍵合成酶(ABS)、?；o酶A合成酶(ACS)、N-?；D(zhuǎn)移酶(NAT)以及氨酰基tRNA合成酶(aaRS)等。而CapW和CapS是例外,在不依賴(lài) ATP的條件下,CapW可以利用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)甲基化提供一個(gè)甲酯,隨后通過(guò)CapS連接甲酯和胺前體獲得酰胺類(lèi)化合物(Scheme 4)[12]。

Scheme 4

Scheme 5

Scheme 6

Scheme 7

2.1 酰胺鍵合成酶

酰胺鍵合成酶(Amide bond synthase, ABS)由于其相對(duì)簡(jiǎn)單的、單一的、獨(dú)立的特點(diǎn)而成為合成應(yīng)用中較為通用的酶[13]。McbA是β-咔啉類(lèi)生物堿Marinacarbolines(MCBs)生物合成途徑中一種重要的酰胺鍵合成酶[14],能夠利用ATP作為輔助因子,并表現(xiàn)出廣泛的底物普適性,不僅可以接受苯甲酸、惰性羧酸、喹啉和苯并呋喃等不同的羧酸底物,還能接受不同的胺供體形成一系列酰胺類(lèi)產(chǎn)物[15]。2014年,Ju等[14]利用McbA酶作為一種溫和、高效且環(huán)保的生物催化劑,生成10種新的酰胺類(lèi)化合物,產(chǎn)率高達(dá)93%,展現(xiàn)出其廣泛的底物靈活性(Scheme 5)。

2.2 泛酸合成酶

來(lái)自大腸桿菌的泛酸合成酶(Pantothenate synthase, PSE.coli)是一類(lèi)結(jié)合三磷酸腺苷(ATP)催化羧酸和胺形成酰胺的連接酶。該酶可以催化(R)-泛解酸和β-丙氨酸的縮合反應(yīng)生成輔酶A的前體物質(zhì)——(R)-泛酸(維生素B5)[16]。2021年,Poelarends等[17]研究發(fā)現(xiàn)PSE.coli除了能夠催化β-丙氨酸外,還能接受各種不同結(jié)構(gòu)的胺,具有較廣泛的底物譜,可以得到轉(zhuǎn)化率高達(dá)99%以上的酰胺類(lèi)化合物(Scheme 6)。

2.3 冠狀酸連接酶

2021年,Jason等[18]發(fā)現(xiàn)冠狀酸連接酶(Coronafacic acid ligase, CfaL)可以催化茉莉酸與異亮氨酸反應(yīng),生成植物激素茉莉酸-L-異亮氨酸(JA-Ile),且進(jìn)一步證明了該酶可以接受不同的羧酸底物(脂肪族羧酸與一些手性化合物等)和氨基酸底物來(lái)合成不同的酰胺(Scheme 7),轉(zhuǎn)化率高達(dá)99%,并通過(guò)與改進(jìn)的ATP再生技術(shù)相結(jié)合等方法,提高了酶的活性以及穩(wěn)定性。

Scheme 8

Scheme 9

Scheme 10

Scheme 11

2.4 3-異氰丁酸腺苷化酶

3-異氰丁酸腺苷化酶(AMP-ligase, SfaB)是二異腈天然產(chǎn)物SF2768生物合成基因簇(sfa)中的一種獨(dú)立的腺苷酸形成酶,能利用腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)激活羧酸底物進(jìn)行胺偶聯(lián)。2020年,He等[19]重新利用SfaB通過(guò)酶促反應(yīng)和自發(fā)親核進(jìn)攻實(shí)現(xiàn)酰胺化或硫酯化,從而提供了一種新的酶學(xué)方法用以制備相應(yīng)的酰胺和硫酯(Scheme 8)。

3 脂肪酶

3.1 南極假絲酵母脂肪酶

南極假絲酵母脂肪酶(Candida antarctica lipase, CAL)分為A型和B型[20],而CAL-B被認(rèn)為是一種比CAL-A具有更多功能的生物催化劑,能夠接受大范圍的底物,并且在一些反應(yīng)中表現(xiàn)出了更好的選擇性[21-23]。因此,CAL-B作為許多底物的首選酶,目前已被廣泛地應(yīng)用于合成α-羥基酰胺、脂肪酰胺、生物聚合物等。2006年,Baldessari等[24]描述了一種由CAL催化制備N(xiāo)-羥基烷基丙烯酰胺的方法。該方法在CAL-B和CAL-A催化下,通過(guò)烷醇胺與丙烯酸乙酯的氨基水解反應(yīng)合成N-羥烷基丙烯酰胺。當(dāng)使用CAL-B時(shí),底物轉(zhuǎn)化率高(Conv.=89%～96%),但使用CAL-A時(shí)僅以低轉(zhuǎn)化率(Conv.=7%)獲得酰胺N-(2-羥乙基)丙烯酰胺(Scheme 9)。

Scheme 12

Scheme 13

Scheme 14

Scheme 15

3.2 柱狀假絲酵母脂肪酶

柱狀假絲酵母脂肪酶(Candida cylindracea lipase, CCL)可以催化水解、醇解和酯化等多種反應(yīng),還被廣泛應(yīng)用于生物傳感器、生物材料和生物識(shí)別等領(lǐng)域中。1985年,Gotor等[25]提供了一種獲得丙炔酰胺的簡(jiǎn)便方法(Scheme 10)。該方法指出丙酸乙酯與胺反應(yīng)可以得到相應(yīng)的加成產(chǎn)物,而有趣的是,在CCL作用下,丙酸乙酯還可以與芳香胺反應(yīng)形成酰胺。

3.3 豬胰脂肪酶

豬胰腺脂肪酶(Porcine pancreas lipase, PPL)與其他脂肪酶相比更便宜,且對(duì)非天然底物的生物轉(zhuǎn)化具有高穩(wěn)定性和較好的特異性[26]。它可以通過(guò)對(duì)映選擇性水解,分解外消旋醇和羧酸為相應(yīng)的酯來(lái)合成重要中間體[27-29],因此在精細(xì)化學(xué)品和商品的生產(chǎn)中應(yīng)用越來(lái)越廣泛。Abell等[30]以叔戊醇為溶劑,利用PPL催化底物異丙基氨基酸酯的環(huán)化反應(yīng),生成轉(zhuǎn)化率高達(dá)80%的內(nèi)酰胺(Scheme 11)。

3.4 洋蔥假單胞菌脂肪酶

洋蔥假單胞菌脂肪酶(Pseudomonas cepacia lipase, PCL)因具有很強(qiáng)的酯交換能力和高對(duì)映體選擇性而被廣泛應(yīng)用于諸多領(lǐng)域。Adamczyk等[31]認(rèn)為脂肪酶介導(dǎo)的芐基酯向酰胺的轉(zhuǎn)化具有重要的實(shí)際意義,并發(fā)現(xiàn)了從洋蔥假單胞菌中分離的PS-30是一種能介導(dǎo)芐基酯向酰胺轉(zhuǎn)化的酶,且該酶在7 d內(nèi)實(shí)現(xiàn)了較好的轉(zhuǎn)化率(Scheme 12)。

3.5 淀粉假單胞菌脂肪酶

Pelt等[32]已經(jīng)證明了淀粉假單胞菌脂肪酶(Pseudomonas stutzeri lipase, PSL)是一種有用的氨基分解催化劑,具有相對(duì)廣泛的底物范圍(Scheme 13)。且PSL在各種甲酯和胺的氨基分解反應(yīng)中的催化能力優(yōu)于Novozym?435(固定化的CAL-B, NOV435)。

3.6 鞘氨醇單胞菌脂肪酶

研究發(fā)現(xiàn),鞘氨醇單胞菌脂肪酶(Sphingomonas paucimobilis lipase, SpL)來(lái)自鞘氨醇單胞菌HXN-200,是第一個(gè)可以催化酯或酸的氨基分解反應(yīng)產(chǎn)生酰胺的胞內(nèi)酶。它能直接從酸中高效合成酰胺,而不需要制備酯作為底物。此外,SpL具有較廣的底物范圍,能夠接受相對(duì)較大的底物進(jìn)行氨基解反應(yīng)得到相應(yīng)高產(chǎn)量的酰胺。還可以催化外消旋酯或外消旋胺的高對(duì)映選擇性反應(yīng),為高ee值條件下合成手性酰胺提供了一種新的方法(Scheme 14)[33]。

Scheme 16

Scheme 17

Scheme 18

鹵醇脫鹵酶也叫鹵醇-鹵化氫裂解酶(Halohydrin dehalogenases, HHDHs),能夠可逆地作用于鄰羥基鹵化物,從而形成環(huán)氧化物及其開(kāi)環(huán)產(chǎn)物。2008 年,Janssen課題組[34]在鹵醇脫鹵酶HheC的催化作用下,利用親核試劑氰酸鈉對(duì)環(huán)氧化物進(jìn)行β-位開(kāi)環(huán),產(chǎn)生的β-取代醇進(jìn)一步自發(fā)環(huán)化,實(shí)現(xiàn)了手性5-取代噁唑烷酮的合成(Scheme 15)。

2019年,本課題組探究了在親核試劑NaOCN作用下,利用HheG催化消旋環(huán)氧苯乙烷的α-開(kāi)環(huán)反應(yīng),得到了4-芳基噁唑烷酮類(lèi)化合物,并首次實(shí)現(xiàn)了通過(guò)酶催化環(huán)氧化物合成4-芳基噁唑烷酮,但該方法ee值較低(ee最高52%)(Scheme 16a)[35]。隨后在2020年,本課題組發(fā)現(xiàn)當(dāng)HheC作為催化劑催化環(huán)氧苯乙烷對(duì)映和區(qū)域選擇性β-開(kāi)環(huán)反應(yīng)時(shí),能得到手性的5-芳基噁唑烷酮類(lèi)化合物,產(chǎn)率高達(dá)到47%,ee值高達(dá)到90%。該方法開(kāi)發(fā)了一種溫和、綠色的合成手性噁唑烷酮類(lèi)化合物的途徑(Scheme 16b)[36]。同年,本課題組通過(guò)篩選獲得可分別催化2-異丙基環(huán)氧乙烷不對(duì)稱(chēng)開(kāi)環(huán)反應(yīng)的生物催化劑HheG和HheA10,并以超過(guò)99%ee值合成立體選擇性互補(bǔ)的手性5-異丙基-2-噁唑烷酮(Scheme 16c)[37]。

2021年,本課題組進(jìn)一步以廉價(jià)的烯烴和氰酸鹽作為原料,將苯乙烯單加氧酶和鹵醇脫鹵酶相結(jié)合,開(kāi)發(fā)了一種用于烯烴不對(duì)稱(chēng)氨基羥基化的一鍋法生物催化級(jí)聯(lián)反應(yīng),該雙酶級(jí)聯(lián)SMO-HheG反應(yīng)兼容性好,能使不同烯烴轉(zhuǎn)化為具有良好立體和區(qū)域選擇性的對(duì)映體噁唑烷酮,產(chǎn)率37%～70%,ee值94%～>99%,區(qū)域選擇性94%～>99%。此外,通過(guò)該生物催化級(jí)聯(lián)方法可以制備出含有兩個(gè)手性中心的4,5-二取代噁唑烷酮(Scheme 17)[38]。

5 其他酶

5.1 P450酶

細(xì)胞色素P450 (Cytochrome P450, CYP450)屬于單加氧酶,是一類(lèi)擁有多種催化功能的酶,可以實(shí)現(xiàn)不同底物的羥基化、氨基化等。2015年,Fasan等[39]利用P450BM3的突變體P411BM3有效地催化碳酸鹽疊氮化物的環(huán)化反應(yīng),并成功合成4-取代噁唑烷酮(Scheme 18)。

Scheme 19

Scheme 20

Scheme 21

5.2 酰基轉(zhuǎn)移酶

?；D(zhuǎn)移酶(Acyl transferase, AT)能催化酰基轉(zhuǎn)移形成酯或酰胺[40-41],而其中需要依賴(lài)復(fù)雜且昂貴的?；w,如酰基輔酶A硫酯等。自1993年以來(lái),水解酶混雜?；D(zhuǎn)移酶被發(fā)現(xiàn)[42],它可以作為一種理想的生物催化劑應(yīng)用于水酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)中,特別是對(duì)于幾乎不溶于有機(jī)溶劑的親水底物的酰化反應(yīng)。

2007年,Richard等[43]從恥垢分枝桿菌(Mycolicibacteriumsmegmatis)中分離出一種新型的酰基轉(zhuǎn)移酶MsAcT,并進(jìn)一步證明了該酶可以催化醇解反應(yīng)。2016年,Berglund等[44]利用MsAcT與來(lái)自硅酸桿菌(Silicibacterpomeroyi)的胺轉(zhuǎn)氨酶(Sp-ATA)開(kāi)發(fā)了一種高效的“一步一鍋”級(jí)聯(lián)反應(yīng)形成酰胺,并得到轉(zhuǎn)化率高達(dá)97%的N-芐基-2-甲氧基乙酰胺(Scheme 19a),再次證明了水解酶混雜?；D(zhuǎn)移酶在級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的潛力。2018年,Paradisi等[45]證明了MsAcT具有非常廣的底物范圍,能接受不同的胺和?；w在水中制備N(xiāo)-乙酰衍生物。其中醋酸乙烯基是最好的供體,在反應(yīng)20 min后得到具有較好產(chǎn)率(85%～99%)的酰胺類(lèi)化合物(Scheme 19b)。

5.3 青霉素?；?/h3>

青霉素?；?Penicillin acylase, PA)又稱(chēng)為青霉素酰胺酶或青霉素氨基水解酶[46],根據(jù)其底物特異性不同可以分為:青霉素G?；?、青霉素V?；负桶逼S西林?；?。1960年,Kaufman和Bauer首次證實(shí)了青霉素?；缸鳛樯锎呋瘎┰诤铣煞矫娴膽?yīng)用(Scheme 20)[47]。從那以后,該酶主要用于工業(yè)上制備6-氨基青霉酸和半合成β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素[48]。

5.4 環(huán)狀假單胞菌

2016年,本課題組[49]證實(shí)了環(huán)狀假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)ZMU-T04作為生物催化劑可以對(duì)1,2,3,4-四氫喹啉進(jìn)行對(duì)映選擇性芐位C—H鍵氧化。研究發(fā)現(xiàn),芐基羥基化過(guò)程不僅產(chǎn)生了主要的(R)-1,2,3,4-四氫喹啉-2-醇,而且還產(chǎn)生了少量的3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮(Scheme 21a)。基于這一發(fā)現(xiàn),本課題組實(shí)現(xiàn)了利用ZMU-T04對(duì)胺進(jìn)行α-氧化,并成功制備了內(nèi)酰胺類(lèi)化合物。更重要的是,該反應(yīng)還為抗抑郁藥生物活性分子的合成提供了潛在的應(yīng)用前景(Scheme 21b)[50]。

許多生物活性分子和藥物都含有酰胺鍵結(jié)構(gòu),酰胺鍵形成反應(yīng)是藥物合成過(guò)程中重要的反應(yīng)之一。本文歸納了腈水合酶、ATP依賴(lài)型酶、脂肪酶和鹵醇脫鹵酶等生物酶參與的酰胺合成反應(yīng)。與傳統(tǒng)化學(xué)法相比,酶促酰胺合成反應(yīng)展現(xiàn)出反應(yīng)條件溫和、處理方式安全、具有化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性和立體選擇性等優(yōu)點(diǎn),在酰胺類(lèi)醫(yī)藥中間體綠色合成方面已有諸多應(yīng)用。但有些生物催化酰胺合成策略的工業(yè)應(yīng)用還面臨一些瓶頸,如ATP依賴(lài)型酶介導(dǎo)的酰胺合成反應(yīng)過(guò)程需使用昂貴的ATP試劑。隨著對(duì)這些酶催化反應(yīng)特性和酶自身催化性能的深入探究,有望創(chuàng)制出更多高活性和高穩(wěn)定性的生物催化劑,用于結(jié)構(gòu)多樣酰胺類(lèi)化合物的綠色高效合成。