頂空氣相色譜法測定替硝唑原料藥中6種有機(jī)溶劑的殘留量

王瑞芬

（濮陽市食品藥品檢驗檢測中心，河南 濮陽 457000）

替硝唑（tinidazole），化學(xué)名2-甲基-1-[2-（乙基磺?；┮一鵠-5-硝基-1H咪唑，是新一代硝基咪唑類抗厭氧菌藥物。該藥由美國Pfizer公司研究開發(fā)，1971年首次在德國上市，1993年獲國家衛(wèi)生部頒發(fā)的新藥證書，并在國內(nèi)上市。該藥對原蟲（溶組織阿米巴、陰道滴蟲等）和厭氧菌有良好活性，可用于治療滴蟲病、賈第鞭毛蟲病、阿米巴病、細(xì)菌性陰道炎和厭氧菌感染；可與抗生素和抗酸藥聯(lián)合應(yīng)用，用于治療與幽門螺旋桿菌相關(guān)的十二指腸潰瘍等，具有療效顯著，療程短，副作用小等優(yōu)點(diǎn)。為保證藥品用藥安全、質(zhì)量可控，根據(jù)人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會（ICH）指導(dǎo)原則和《中國藥典》2020年版四部通則“殘留溶劑測定法”中的有關(guān)規(guī)定，需對本品合成工藝中使用的有機(jī)溶劑殘留量進(jìn)行檢測。根據(jù)文獻(xiàn)報道的替硝唑合成路線[1-6]，在替硝唑原料藥合成過程中可能會用到乙醇、丙酮、異丙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷和二甲苯等6種有機(jī)溶劑，這些溶劑殘留會對人體健康造成安全隱患。目前，有關(guān)替硝唑原料藥中殘留溶劑的研究文獻(xiàn)尚未見報道。本文在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[7-9]，建立了一種氣相色譜同時測定替硝唑原料藥中6種殘留溶劑的方法，有望為替硝唑原料藥的質(zhì)量控制及生產(chǎn)檢測提供必要參考。

1 儀器與試藥

安捷倫 7890B 氣相色譜儀、7697A頂空進(jìn)樣器、氫火焰離子化檢測器（美國Agilent 公司），METTLER TOLEDO XS205DU 電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

替硝唑原料藥（批號：R H 2 4 3 3 1 2，RH243315，RH243318，購自上海），乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷和二甲苯（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為優(yōu)級純，含量：≥99.5 %），異丙醇（上海麥克林生化科技有限公司，分析純，含量 ≥99.5 %），二甲基亞砜（德國默克公司，含量：≥99.9 %）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent DB-624毛細(xì)管柱（30 m×0.53 mm，3.0 μm)；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持8 min，以10 ℃/min速率升溫至150 ℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度：230 ℃；FID檢測器，檢測器溫度：260 ℃；載氣：高純氮?dú)?，流速?.5 ml/min；分流比：10:1；頂空進(jìn)樣量：1.0 ml，平衡溫度：85 ℃，平衡時間：30 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取乙醇250 mg、丙酮250 mg、異丙醇250 mg、乙酸乙酯250 mg、二甲苯108.5 mg置入50 ml量瓶，另精密移取濃度為3 mg/ml三氯甲烷溶液（精密稱取三氯甲烷75 mg置入25 ml量瓶，加二甲基亞砜溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得）1 ml置入同一50 ml量瓶，加二甲基亞砜溶解，定容，搖勻，得混合對照品儲備液。精密吸取混合對照品儲備液1 ml置入20 ml量瓶，用二甲基亞砜稀釋至刻度，得混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取替硝唑原料藥約0.5 g，精密稱定，置頂空瓶中，精密加入二甲基亞砜5 ml，壓蓋密封，振搖使溶解，即得。

2.2.3 空白溶液 精密移取二甲基亞砜5 ml，置頂空瓶中，壓蓋密封，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

吸取混合對照品溶液、供試品溶液和空白溶液各5 ml分別置入相應(yīng)的頂空瓶，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖（見圖1）。由色譜圖分析結(jié)果可見，在該色譜條件下，各有機(jī)溶劑色譜峰均可實現(xiàn)基線分離，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)以丙酮峰計算大于30000，二甲基亞砜對待測成分無干擾，二甲基亞砜峰和各待測組分色譜峰之間分離度良好。

圖1 氣相色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取2.2.1項下混合對照品儲備液0.2，0.5，1.0，2.5，5.0 ml分別置入20 ml量瓶，加二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻，得系列混合對照品溶液。取5 ml上述溶液置入20 ml頂空瓶，按2.1項下色譜條件分析測定，記錄相應(yīng)峰面積，以待測有機(jī)溶劑的濃度X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 6個成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.5 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）

取適量混合對照品溶液，逐級稀釋，得不同濃度的混合對照品稀釋液，分別按2.1項下色譜條件分析測定，以信噪比（S/N）為10時對應(yīng)的濃度為定量限，信噪比（S/N）為3時對應(yīng)的濃度為檢測限，結(jié)果表明：乙醇、丙酮、異丙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷和二甲苯的定量限分別為 1.8437，1.4653，1.9014，1.2063，4.070，2.8786 mg/L，檢測限分別為0.5531，0.4396，0.5704，0.3619，1.221，0.8636 mg/L。

2.6 精密度試驗

取2.2.1項下混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得乙醇、丙酮、異丙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷和二甲苯的峰面積的RSD分別為0.39 %，0.78 %，0.79 %，0.91 %，1.21 %，0.64 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取替硝唑原料藥（批號：RH243318），按2.2.2項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，8，12和24 h后，按2.1項下色譜條件分析測定，得乙醇、異丙醇峰面積的RSD分別為1.47 %，1.23 %（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗

取替硝唑原料藥（批號：RH243318），按2.2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件分析測定，結(jié)果檢出乙醇、異丙醇含量的RSD分別為1.13 %，1.02 %（n=6），該分析方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取替硝唑原料藥（批號：RH243318）約0.5 g，共9份，精密稱定，置入頂空瓶，分別加入5 ml濃度為80 %，100 %，120 % 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度制備3份平行樣。按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率。結(jié)果乙醇、丙酮、異丙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷和二甲苯的平均加樣回收率分別為98.75 %，100.03 %，99.33 %，98.58 %，97.92 %，101.12 %，RSD分別為1.38 %，2.17 %，1.78 %，1.52 %，1.47 %，1.06 %。表明此法用于檢測替硝唑原料藥中6種殘留溶劑準(zhǔn)確度良好。

2.10 樣品中殘留溶劑的測定

取替硝唑原料藥（批號：R H 2 4 3 3 1 2，RH243315，RH243318）約0.5 g，精密稱定，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件分析測定，記錄峰面積，計算有機(jī)溶劑殘留量，結(jié)果見表2。

表2 替硝唑原料藥殘留溶劑測定結(jié)果

3 討論

本研究參考《中國藥典》2020年版（四部）通則中殘留溶劑測定法，采用氫火焰離子化檢測器，頂空進(jìn)樣測定替硝唑原料藥中6種有機(jī)溶劑的殘留。頂空進(jìn)樣法可免除復(fù)雜的樣品前處理過程，規(guī)避原料藥及溶劑中雜質(zhì)對分析測定的干擾，減少難揮發(fā)性物質(zhì)對色譜柱及進(jìn)樣口的污染。因替硝唑微溶于水，本文選用二甲基亞砜溶解樣品，可使待測有機(jī)溶劑在頂空瓶中的達(dá)到一定的氣液平衡，具有較高的靈敏度。

分別考察了頂空平衡溫度和時間對試驗結(jié)果的影響，結(jié)果表明，平衡時間為30 mim時，平衡溫度為70，75，80，85，90 ℃時，隨升高溫度，檢測靈敏度提高，相應(yīng)色譜峰峰面積增大，當(dāng)溫度大于85 ℃ 時，峰面積增大不明顯，同時兼顧溫度升高頂空瓶氣密性變差、樣品熱分解增大，都將對試驗結(jié)果造成不利影響，將平衡溫度設(shè)為85 ℃。在平衡溫度85 ℃時，分別考察平衡時間15，20，30，40 min對待測組分的影響，結(jié)果表明，各待測組分的色譜峰面積在平衡時間30 min后增加趨緩，為節(jié)約檢驗成本，提高分析效率，平衡時間確定為30 min。

試驗過程中，由于二甲苯中兩個甲基存在位置異構(gòu)，為鄰二甲苯、對二甲苯和間二甲苯三種異構(gòu)體的混合物，反應(yīng)在混合對照品色譜圖中，在保留時間18～20 min范圍內(nèi)，出現(xiàn)3個色譜峰，故以3個峰面積之和進(jìn)行定性和定量分析。

本研究考察了分流比為5:1，8:1，10:1，12:1，15:1條件下的試驗情況，結(jié)果表明，隨分流比增加，各待測成分色譜峰峰寬變窄，峰形尖銳，峰面積與峰高均減小。從分析參數(shù)優(yōu)化和滿足不同濃度定量分析的需要出發(fā)，最終確定分流比為10:1。

本研究建立的分析方法可實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、高效的測定替硝唑原料藥中乙醇、丙酮、異丙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷和二甲苯6種有機(jī)溶劑的殘留量，可為替硝唑原料藥及其制劑的標(biāo)準(zhǔn)提升提供參考依據(jù)。