黨參中多糖和5種化學(xué)成分的相關(guān)性研究

任 月，陳曉虎，張 毅,

（1. 成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 611137；2. 重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶市藥物過(guò)程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶 401121）

黨參為桔?？浦参稂h參Codonopsis pilosula(Franch.) Nannf.、素花黨參Codonopsis pilosulaNannf. var.modesta(Nannf.) L. T. Shen和川黨參Codonopsis tangshenOliv.的干燥根，具有健脾益肺、養(yǎng)血生津的功效，主要用于脾肺氣虛、咳嗽虛喘、氣血不足等癥[1]，是大宗常用的傳統(tǒng)補(bǔ)益類中藥，常用作人參替代品。研究表明，黨參富含多種成分，包括多糖、苯丙素、生物堿、聚乙炔醇和酚酸等[2-4]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黨參有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗衰老、調(diào)節(jié)血脂或血糖等多種作用?！吨袊?guó)藥典》2020年版一部及各省、市、區(qū)的地方標(biāo)準(zhǔn)中，僅收載有性狀、顯微特征、薄層鑒別、水分、灰分、浸出物等非特異性項(xiàng)目，并未在化學(xué)成分的基礎(chǔ)上對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行有效控制。而黨參質(zhì)量的安全性、有效性是其臨床應(yīng)用的有效保障，黨參有效成分及含量的測(cè)定是制定質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的重要指標(biāo)[5]。近年，張麗芬等[6]采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定黨參中黨參多糖和黨參炔苷的含量；貢東軍等[7]采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測(cè)定黨參中黨參內(nèi)酯和蒼術(shù)內(nèi)酯III的含量；關(guān)琳靜[8]通過(guò)黨參HPLC特征圖譜研究，測(cè)定不同來(lái)源黨參成分含量，進(jìn)行總體定性分析；陳娟等[9]采用HPLC測(cè)定黨參中3種成分含量?？傮w而言，黨參藥效顯著，但成分復(fù)雜，活性指標(biāo)成分不清楚?；瘜W(xué)成分含量測(cè)定較為單一，難以全面評(píng)價(jià)黨參的內(nèi)在質(zhì)量。研究表明，多糖類成分是抗衰老、抗腫瘤的主要藥效成分，主要通過(guò)提高抗氧化酶活性或清除有機(jī)體內(nèi)的自由基發(fā)揮作用。黨參多糖是黨參補(bǔ)脾作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一[10-12]；腺苷被認(rèn)為是補(bǔ)益類中藥共有的物質(zhì)基礎(chǔ)，參與代謝過(guò)程，是生物細(xì)胞維持生命活動(dòng)的重要元素[13]；紫丁香苷作為指標(biāo)性成分可鑒定紋黨參和白條黨參[14]；黨參炔苷對(duì)乙醇所致的胃黏膜損傷有較好的保護(hù)作用[15]。因此，本文通過(guò)比色法建立黨參多糖含量測(cè)定方法，通過(guò)色譜法建立黨參中腺苷、色氨酸、紫丁香苷、綠原酸、黨參炔苷等5種成分的含量測(cè)定方法，對(duì)同一來(lái)源相同時(shí)間采集的黨參樣本進(jìn)行初步對(duì)比分析研究，探索黨參化學(xué)成分與黨參多糖是否具有相關(guān)性，為后續(xù)黨參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高及質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

e2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），HP8453E型紫外-可見分光光度計(jì)（HP公司）；AX-205電子天平（梅特勒公司）；恒溫水浴鍋（上海精密公司）。

1.2 試藥

腺苷（批號(hào)：110879-201703，含量：99.7 %）、色氨酸（批號(hào)：140624-201506，含量：99.9 %）、紫丁香苷（批號(hào)：111574-201504，含量：94.9 %）、綠原酸（批號(hào)：111574-201504，含量：96.2 %）、黨參炔苷（批號(hào)：111732-201607，含量：96.6 %）、無(wú)水葡萄糖（批號(hào)：110833-201908，含量：99.8 %）對(duì)照品均來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜醇（安徽時(shí)聯(lián)特種溶液股份有限公司），濃硫酸為分析純（重慶川東化工有限公司），水由Milli-Q系統(tǒng)（美國(guó)密理博公司）制備。

20批黨參樣品采集自山西壺關(guān)，經(jīng)重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院中藥室張毅副主任中藥師鑒定為桔?？浦参稂h參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖含量測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取葡萄糖對(duì)照品適量，加水制成0.1 mg/ml葡萄糖溶液，分別精密量取0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml，加水至2.0 ml，加入5 %苯酚溶液1.0 ml后搖勻，迅速精密加入濃硫酸5.0 ml并搖勻，置水浴中加熱15 min，取出，立即冷卻至室溫，以相應(yīng)試劑為空白。用紫外-可見分光光度法于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。葡萄糖在10.2～102.1 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好?；貧w方程為A=7.2708X-0.0055，相關(guān)系數(shù)R2=0.9997。

2.1.2 供試品溶液的制備 取黨參細(xì)粉約0.2 g，精密稱定后，精密加入體積分?jǐn)?shù)為80 %乙醇50 ml回流提取2 h，濾過(guò)，殘?jiān)?0 %乙醇熱洗滌后加水60 ml，水浴加熱回流2 h，趁熱過(guò)濾，殘?jiān)盁坑脽崴?0 ml洗滌，分3次洗滌，洗液并入濾液，濃縮至適量，放冷，移入100 ml量瓶，加水定容后搖勻，精密量取供試品溶液0.2 ml，加水至2.0 ml搖勻，加入5 %苯酚溶液1.0 ml搖勻后，迅速精密加入濃硫酸5.0 ml并搖勻，置水浴中加熱15 min后，取出，立即冷卻至室溫，即得。

2.1.3 精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液，于490 nm波長(zhǎng)處重復(fù)測(cè)定6次吸光度，RSD為0.69 %，結(jié)果表明，儀器的精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一黨參樣品，按2.1.2項(xiàng)法制備供試品溶液，分別于0，0.5，1，2，3，4 h于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。其RSD為2.71 %，結(jié)果表明，黨參樣品在4 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一黨參樣品6份，按2.1.2項(xiàng)法制備供試品溶液，分別于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，其RSD為1.35 %，結(jié)果表明，供試品重復(fù)性良好。

2.1.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的供試品0.1 g，共6份，分別稱取葡萄糖對(duì)照品約18 mg，按2.1.2項(xiàng)法制備供試品溶液，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，計(jì)算平均回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

2.1.7 樣品多糖含量測(cè)定 取本品細(xì)粉約0.2 g，按2.1.2項(xiàng)法制備供試品溶液，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知多糖濃度，計(jì)算，即得，結(jié)果見表5。

2.2 黨參中5種成分含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)214，218，257 nm，流動(dòng)相：A相為乙腈溶液，B相為0.1 %磷酸水溶液；梯度洗脫見表2；流速：1 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl。

表2 梯度洗脫程序

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取對(duì)照品腺苷20.22 mg、色氨酸20.22 mg、紫丁香苷18.74 mg、綠原酸9.88 mg和黨參炔苷9.14 mg，用50 %甲醇制成質(zhì)量濃度分別為2.016，2.078，1.778，0.950，0.883 mg/ml單一成分對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.3 供試品溶液制備 精密稱取黨參粉末約1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50 %甲醇25 ml，密塞，稱定重量，超聲處理60 min，放冷，再稱定重量，用50 %甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取腺苷、色氨酸、紫丁香苷、綠原酸和黨參炔苷各單一成分對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0，1.0，0.2，1.0，4.0 ml，置入同一20 ml量瓶，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液及黨參供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖1。

圖1 黨參混合對(duì)照品（A）和黨參供試品溶液（B）的HPLC色譜圖

2.2.6 線性考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液0.1，0.2，0.4，0.5，1，2，5 ml，置入10 ml量瓶，加入50 %甲醇溶液定容，制成系列對(duì)照品溶液。吸取上述對(duì)照品溶液，按2.2.1項(xiàng)法測(cè)定5個(gè)化學(xué)成分的峰面積。以所測(cè)成分質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，色氨酸、紫丁香苷、綠原酸和黨參炔苷的峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，結(jié)果見表3。

表3 5種化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

2.2.7 精密度試驗(yàn) 精密稱取同一黨參樣品，按2.2.3項(xiàng)法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果表明，腺苷、色氨酸、紫丁香苷、綠原酸和黨參炔苷的峰面積的RSD值分別為0.61 %，0.15 %，0.29 %，0.26 %，0.32 %，均小于1.0 %，表明精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一黨參樣品6份，按2.2.3項(xiàng)法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明，腺苷、色氨酸、紫丁香苷、綠原酸和黨參炔苷的RSD分別為2.54 %，0.17 %，1.23 %，1.91 %，0.53 %，均小于2.5 %，表明方法重復(fù)性較好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一黨參樣品，按2.2.3項(xiàng)法制備供試品溶液，分別于制備后0，2，4，8，12，24 h按2.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，腺苷、色氨酸、紫丁香苷、綠原酸和黨參炔苷峰面積的RSD分別為2.60 %，2.13 %，2.00 %，1.06 %，0.30 %，表明黨參樣品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.2.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的黨參樣品粉末約0.5 g，共6份，精密稱定，分別置入具塞錐形瓶，精密加入0.0645 mg/ml腺苷對(duì)照品溶液1.5 ml，0.1293 mg/ml色氨酸對(duì)照品溶液1.0 ml，0.0213 mg/ml紫丁香苷對(duì)照品溶液0.5 ml，0.0570 mg/ml綠原酸對(duì)照品溶液1.0 ml，0.3973 mg/ml黨參炔苷對(duì)照品溶液1.0 ml和50 %甲醇20 ml，按2.2.3項(xiàng)法制備供試品后進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表4。

表4 5種化合物的加樣回收率（n=6）

2.2.11 黨參5種成分含量測(cè)定 取本品細(xì)粉約1 g，按2.2.3項(xiàng)法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見表5。通過(guò)構(gòu)建相關(guān)性系數(shù)圖，以相關(guān)性系數(shù)為指標(biāo)，其絕對(duì)值越接近1，相關(guān)性越強(qiáng)。多糖含量與5種化學(xué)成分含量的相關(guān)性系數(shù)圖見圖2。由圖2可見，黨參腺苷、色氨酸、紫丁香苷、綠原酸和黨參炔苷5個(gè)成分與黨參多糖的相關(guān)性系數(shù)分別為-0.153，-0.024，-0.141，-0.178，-0.145，因此不具明顯相關(guān)性。

表5 含量測(cè)定結(jié)果/mg·g-1

圖2 黨參中多糖和5種化學(xué)成分的相關(guān)性系數(shù)圖

3 討論

3.1 多糖前處理考察

3.1.1 醇除雜考察 取黨參藥材約0.2 g，精密稱定，置入錐形瓶，用80 %乙醇加熱回流提取2 h，取提取液，蒸干，用適量水溶解，濾過(guò)至100 ml量瓶，定容，精密量取濾過(guò)液0.2 ml，加水至2 ml。分別加5 %苯酚溶液1.0 ml，搖勻，迅速精密加入濃硫酸5.0 ml后搖勻，置水浴中加熱15 min，取出，立即冷卻到室溫，進(jìn)行測(cè)定，吸光度值為0，表明該除雜方法可行。

3.1.2 提取考察 通過(guò)考察加水量60，80，100 ml，水浴時(shí)間1，2，3 h等，對(duì)提取進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，對(duì)比60 ml溶劑提取與80 ml溶劑提取相比結(jié)果，多糖含量在增加提取液后并無(wú)明顯變化；每次提取1 h與2 h相比較，多糖含量增加并不明顯。因此，從節(jié)約成本及時(shí)間角度考慮，用水60 ml，每次提取2 h即可。

3.2 黨參炔苷前處理考察

對(duì)于多組分分析，合適的檢測(cè)波長(zhǎng)是重要的參數(shù)[16]。采用波長(zhǎng)范圍為200～400 nm的紫外檢測(cè)器對(duì)黨參中5種成分進(jìn)行掃描，結(jié)果腺苷在257 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，色氨酸在218，278 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，紫丁香苷在219，264 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，綠原酸在218，325 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，黨參炔苷在214，267，283 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，因此選擇腺苷的檢測(cè)波長(zhǎng)為257 nm，色氨酸、紫丁香苷、綠原酸的檢測(cè)波長(zhǎng)為218 nm，黨參炔苷的檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm。通過(guò)5種成分的分離度、峰形、基線等方面對(duì)不同流動(dòng)相體系，如甲醇～水、甲醇～0.1 %磷酸水溶液、乙腈～水、乙腈～0.1 %磷酸水溶液進(jìn)行考察，結(jié)果在乙腈～0.1 %磷酸水溶液時(shí)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，黨參中5種化學(xué)成分峰形、分離度較好，因此，選擇乙腈～0.1% 磷酸水溶液作為流動(dòng)相。根據(jù)黨參5種化學(xué)成分的溶出情況，對(duì)不同提取方式，如超聲、回流等；對(duì)不同提取溶劑，如50 %甲醇、75 %乙醇、甲醇等；對(duì)不同提取時(shí)間，如30，60，90 min等進(jìn)行單因素考察，結(jié)果表明，采用50 %甲醇超聲60 min處理樣品時(shí)，5種成分的溶出情況最好，因此，選擇50 %甲醇超聲60 min處理樣品。

3.3 方法評(píng)價(jià)

本研究采用硫酸-苯酚比色法建立黨參中多糖含量的測(cè)定方法，采用HPLC法建立黨參中腺苷、色氨酸、紫丁香苷、綠原酸和黨參炔苷5種化學(xué)成分的測(cè)定方法，并對(duì)兩種方法進(jìn)行方法學(xué)考察，包括重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性、加樣回收等。比色法操作簡(jiǎn)便、成本低廉；色譜法分離度好，準(zhǔn)確性高，多種方法同時(shí)測(cè)定黨參質(zhì)量，建立中藥整體質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，為黨參質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。同時(shí)，采集山西壺關(guān)20批黨參藥材并測(cè)定其黨參多糖和黨參中特異性成分腺苷、色氨酸、紫丁香苷、綠原酸、黨參炔苷的含量，根據(jù)相關(guān)性系數(shù)圖，甘肅壺關(guān)黨參中5種化學(xué)成分與黨參多糖含量不呈現(xiàn)明顯相關(guān)性。由此可知，評(píng)價(jià)黨參質(zhì)量的優(yōu)劣不應(yīng)僅從單一方面進(jìn)行考察，其質(zhì)量控制不能僅限于一兩種成分，多維度多成分對(duì)黨參進(jìn)行定性定量等質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)尤為重要，黨參內(nèi)在質(zhì)量關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。