魚藤酮致帕金森病模型的最佳造模方法探討

毛美玲，關銀瑞，閆詠梅，李 濤，王 豆

帕金森病(PD)是一種常見的老年神經系統(tǒng)退行性疾病，一個準確、穩(wěn)定可被復制的模型對研究帕金森病的病因病機及治療藥物的研發(fā)等有重要的意義。目前采用魚藤酮(rotenone)創(chuàng)建帕金森病動物模型尚無統(tǒng)一標準，因此造模成功率差異較大。本研究旨在探尋盡可能全面模擬出帕金森病特征且死亡率較低的最佳魚藤酮造模方案，以供參考。

1 魚藤酮的發(fā)現(xiàn)及其理化特性

魚藤酮分子式為C23H22O6，屬異黃酮家族的一員，最開始是從醉魚豆屬植物毛魚藤(serris)根莖和葉的膠狀液汁魚藤膠中提取分離出的無色化學物質，為魚藤根的主要活性成分，特別存在于魚藤屬、灰葉屬等植物中，同時也存在于一些中草藥如地瓜子、苦檀子、昆明雞血藤根中。由于其具有殺蟲譜廣、不易產生耐藥性、毒性較小、殘留效應時間短和大量存在于自然界等優(yōu)點，一直以來作為一種安全有效的天然植物性殺蟲劑而被廣泛應用于農作物、果樹和藥材等的蟲害防治和魚塘清理[1]。魚藤酮幾乎不溶于水，但易溶于許多有機溶劑，如氯仿、乙醚和丙酮等。因其暴露在光和空氣時容易氧化分解，所以為保持活性穩(wěn)定常在干燥、低溫、避光和密封條件下儲存[2]。

2 魚藤酮的毒性作用機制

魚藤酮常易通過消化道和皮膚被機體吸收，其高強脂溶性使其容易穿透所有生物膜包括血腦屏障，且不需要借助多巴胺轉運體便可直接進入機體的細胞質中[3]。魚藤酮作為一種線粒體復合體Ⅰ抑制劑，其發(fā)揮生物學效應是通過抑制細胞呼吸鏈還原型輔酶Ⅰ(NADH)脫氫酶的活性，損害氧化磷酸化的過程，導致三磷酸腺苷(ATP)生成減少，從而影響呼吸鏈對氧的利用，造成抑制性缺氧而發(fā)揮細胞毒作用[4]。研究顯示，經魚藤酮干預后，參與線粒體功能、內質網功能和自噬的蛋白質有所改變，蛋白質分子分析顯示，30種蛋白質過表達及114種蛋白質表達下調，即觸發(fā)了氧化應激并誘導細胞凋亡，有效模擬了帕金森病的細胞畸變[5]。

3 魚藤酮與帕金森病的聯(lián)系

帕金森病是一種常見于中老年的神經系統(tǒng)變性疾病，臨床以靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢平衡障礙為主要特征，主要的病理改變?yōu)橹心X黑質(substantianigra，SN)致密區(qū)多巴胺(dopamine，DA)能神經元退行性變性死亡、殘存的神經元內形成Lewy小體(lewybodies，LBs)及紋狀體多巴胺含量明顯減少，從而導致帕金森病的核心運動特征，也是目前對癥治療的目標。帕金森病的病因尚未明確，但受到遺傳、環(huán)境等因素影響，業(yè)已證實環(huán)境中的有害物質是帕金森病的重要致病因素之一[6]。種種因素導致細胞功能障礙或產生興奮性神經毒性作用、年齡老化的協(xié)同促進作用而致病。帕金森病病人和魚藤酮長期的慢性暴露均有多巴胺能軸突丟失及最終會致細胞死亡的共同表現(xiàn)[7]。即使魚藤酮一直被視為安全殺蟲劑，但在長期、大量使用及慢性接觸后不僅會污染環(huán)境，而且對機體的神經系統(tǒng)功能有一定影響[8]。復合體Ⅰ在全腦普遍抑制，但僅黑質多巴胺神經元變性，提示黑質多巴胺能神經元對魚藤酮的易損傷性[9]。魚藤酮對中樞神經系統(tǒng)的毒性作用提示二者之間存在病原學關系。已有研究表明，90%以上的帕金森病病人的致病因素都與環(huán)境污染物密切相關，其中殺蟲劑魚藤酮接觸尤為明顯[10]。為了解兩者之間的潛在聯(lián)系，許多研究人員利用魚藤酮成功誘導出各種不同的帕金森病動物模型和細胞模型，該模型復制了大部分相似的運動癥狀和組織病理特點。魚藤酮選擇性地進入腦內后，多巴胺神經元對其高度敏感，導致黑質、紋狀體多巴胺神經元線粒體功能障礙，誘發(fā)變性繼而引起多巴胺能神經元死亡[11]，除此之外還伴隨有Lewy小體樣包涵體形成，相比于其他模型，這是魚藤酮制備帕金森病模型所獨有的。

4 魚藤酮建立帕金森病動物模型

由于魚藤酮可復制帕金森病的部分運動缺陷及病理特征[12-13]，因此，被廣泛用于建立嚙齒動物的帕金森病模型[14]。魚藤酮誘導帕金森病動物模型分為急性、亞急性或亞慢性、慢性動物模型。模型在病原學、病機、病理生化及行為學等多方面的精確程度對研究帕金森病的致病因素、潛在機制、神經保護和恢復治療以及疾病預防等均有寶貴價值。魚藤酮慢性模型不僅造模成功率高，而且在多方面均表現(xiàn)出與帕金森病相關的特征，且其慢性、進行性病程也與帕金森病的發(fā)病過程類似，實驗成本相對較小，故實驗多選擇慢性損耗模型來研究帕金森病的特征[15]。

4.1 皮下注射 目前，采用魚藤酮誘導帕金森病動物模型尚無統(tǒng)一標準，造模成功率也因實驗材料、造模方法等的不同而差異較大。經過查閱大量文獻后，將造模成功的影響因素概括為動物因素和給藥因素兩大方面。動物因素包括種屬、品系、月齡、性別、體質量等；給藥因素包括溶劑、給藥方式、接觸劑量、持續(xù)時間和間隔時間等，不同選擇對血藥濃度的影響也不同。本研究將按給藥方式探討魚藤酮造模的最佳方法。采用不同標準皮下注射魚藤酮建立帕金森病模型的情況詳見表1。

從表1可看出，多數研究選擇雄性大鼠，較少有選擇雌性大鼠者，究其原因可能與雌性大鼠體內的雌激素對實驗結果的準確性會造成一定影響有關。SD大鼠比Wistar大鼠更多用于建立帕金森病動物模型；哺乳動物對魚藤酮的敏感性差異較大[26]。因此，給藥劑量的確定也受鼠體質量大小的影響。實驗大鼠體質量的大小在(200±20)g，盡管體質量稍大(如250～300 g)的大鼠也有成功造模的研究，但在實驗時，大鼠開始需適應性喂養(yǎng)1周，之后至少3周的飼養(yǎng)則可能會使體重過大進而影響行為學評估的結果，且大鼠比小鼠更能耐受刺激，可以降低死亡率，提高生存率，使數據更加豐富。

表1 不同方案皮下注射魚藤酮建立帕金森病模型

關于給藥劑量各實驗研究有所不同，且差異波動較大，每天1～5 mg/kg。賽燕等[27]給予雄性SD大鼠注射魚藤酮(1.0 mg/kg和1.5 mg/kg)，持續(xù)28 d后引起帕金森病病理樣改變，且這種改變在更高的劑量組更明顯，表明相比于1.0 mg/kg劑量，1.5 mg/kg更佳。為確定皮下注射魚藤酮建立帕金森病模型的最佳劑量，Zhang等[28]將魚藤酮按照1.5 mg/kg、2.0 mg/kg或2.5 mg/kg的不同劑量注射給雄性Wistar大鼠，持續(xù)5周。結果證實，每天皮下注射2 mg/kg魚藤酮不僅復制了帕金森病的典型特征和組織病理學特征，且促進了α-syn的形成，并導致黑質酪氨酸羥化酶(TH)陽性神經元和紋狀體多巴胺陽性神經元明顯減少，同時保持了低死亡率。給藥持續(xù)時間各自也有所不同，基本浮動在5～60 d，最常處理的持續(xù)時間為20 d左右。通常在注射給藥7 d大鼠便可出現(xiàn)行為學及病理方面的改變，當持續(xù)2～3周時各方面的變化最明顯[29]。綜合多篇文獻實驗結果發(fā)現(xiàn)，魚藤酮給藥劑量過大時，容易導致急性中毒，增加死亡率；而劑量過少則不易出現(xiàn)帕金森病樣典型癥狀，因此建議使用2 mg/kg作為給藥劑量應當最佳。由于持續(xù)時間的差異也使造模成功率有了高低之分，持續(xù)時間過短則難以解釋環(huán)境毒素因素使人患帕金森病的慢性過程，且病理和行為學改變未達到峰值；而當持續(xù)時間過長，尤其是繼續(xù)用藥3周后大鼠會很快因進食困難死亡，故為使各方面改變最為明顯且降低死亡率，建議持續(xù)時間為3周。

4.2 其他常用給藥方式

4.2.1 腹腔注射 閆雪等[30]連續(xù)21 d通過腹腔按照每天1 mL/kg(溶液配比為3 mg/mL)給雄性Wistar大鼠注射魚藤酮；Bassani等[31]采用此方式連續(xù)28 d給予體質量260～240 g大鼠魚藤酮每天2.5 mg/kg，造模結束后通過行為學測試發(fā)現(xiàn)大鼠的運動遲緩、頻率明顯減少，紋狀體中多巴胺含量也明顯比對照組低，且黑質TH神經元呈現(xiàn)出中度丟失的狀態(tài)；Jagota等[32]持續(xù)48 d給予大鼠腹腔注射魚藤酮2.5 mg/(mL·kg)，結果觀察到模型大鼠的晝夜節(jié)律紊亂且無法恢復，而此種變化在衰老和帕金森病中均有表現(xiàn)；Cheng等[33]給予大鼠腹腔注射魚藤酮每天3 mg/kg(每天1次，連續(xù)3周)，最終顯示魚藤酮導致黑質致密部的運動功能缺損和神經元丟失，均成功制備出帕金森病動物模型。造模成功率的極大提高可能是因為劑量中等、時間長度中等，操作性強。

4.2.2 黑質立體定向注射 常宇濤等[34]將115只2～3月齡SD大鼠(體質量250～300 g)分成模型1～4組，魚藤酮0.5 μg、2.5 μg、5.0 μg、10.0 μg溶于2 μL二甲基亞砜中，通過黑質立體定向注射的方法注入大鼠體內，結果顯示，2.5～5.0 μg的魚藤酮可使大鼠行為學記分在2分以上，即誘導出較可靠的黑質多巴胺能神經元損傷的動物模型。Bai等[35]將魚藤酮(8 μg魚藤酮溶于2μL二甲基亞砜中)，采用立體定向法以1 μL/min的速率注射入大鼠腦中，最終抑制了模型大鼠的細胞生長且促進了細胞凋亡。高膽固醇血癥已成為神經退行性疾病的預后危險因素，甚至導致帕金森病的發(fā)病，F(xiàn)agotti等[36]以0.33 μL/min的速率向體質量為280～330 g雄性Wistar大鼠腦內每個半球注入1 μL魚藤酮，每次持續(xù)3 min，21 d后模型大鼠不但有運動障礙，同時血漿脂蛋白、低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白水平升高，表明魚藤酮也參與了外周早期生物標志物血脂對帕金森病的影響。魚藤酮劑量大小也可引起大鼠明顯的行為學和病理改變差異，低劑量和較高劑量分別使大鼠的表現(xiàn)更接近于帕金森病早期、晚期的特征。

4.2.3 接觸給藥 萬葉等[37]連續(xù)4周以0.1 mg/d的較低劑量使用接觸式給藥方式成功誘導小鼠行為和病理發(fā)生類帕金森病樣表現(xiàn)。這種給藥方式未直接注射入大鼠體內，因此，避免了直接給藥給小鼠造成的外周毒性，可明顯提高造模成功率。

4.2.4 魚藤酮微球誘導大鼠帕金森病模型的建立 王英舟等[38]將魚藤酮按照每天2.5 mg/kg的劑量通過頸部皮下注射法向體質量為200～250 g的每日注射組雄性SD大鼠給藥；于第1天、第8天、第15天、第22天給微球組魚藤酮微球混懸液(采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備)，實驗周期為28 d。兩組大鼠均出現(xiàn)接近帕金森病的典型形態(tài)的特征，如呈弓背狀、動作遲緩、走路步態(tài)不穩(wěn)，行為學記分為3分以上，證明造模成功。相比于每日注射組，28 d的給藥周期微球組僅有4 d需給藥，明顯減低了給藥頻率，人為干預的減少也降低了大鼠死亡率。

4.2.5 鼻內給藥 帕金森病病人常以嗅覺障礙為首發(fā)癥狀。Sasajima等[39]發(fā)現(xiàn)長期經鼻給予魚藤酮能降低小鼠的嗅覺功能且使黑質多巴胺神經元的軸突變性，提示魚藤酮通過鼻腔途徑使大腦多巴胺神經元變性。

4.2.6 灌胃給藥 Liu等[40]連續(xù)6周給予3月齡雄性小鼠灌服魚藤酮(10 mg/kg)；黃玉菊等[41-42]分別給予10周齡、8周齡雄性C57BL/6n小鼠[體重(23±2)g]每天30 mg/kg(每天1次，連續(xù)6 d，共9周)、每天5 mg/kg(每天1次，連續(xù)6 d，共12周)魚藤酮灌胃，測試結果均顯示模型小鼠的轉頭時間、爬桿時間均延長，在棒時間縮短，多巴胺、多巴胺代謝產物高香草酸(HVA)及二羥苯乙酸(DOPAC)含量均明顯降低，符合帕金森病的行為學和病理學改變。

每一種給藥途徑都在不同程度上再現(xiàn)了帕金森病的主要特征，并具有一定的優(yōu)缺點。腹腔注射和灌胃給藥可行性強，造模成功率也較穩(wěn)定；黑質立體定向注射的操作復雜，且需熟練的技術，造模的成功與否對操作手法有一定的要求并造模成功率的大小也與之密切相關，因此，在實際應用中難以被推薦使用；鼻腔給藥造模方式的復制也較少，且不夠成熟；微球給藥作為一種替代性的皮下給藥載體，允許藥物在數周到數月的時間被控制釋放，因其給藥頻率的縮短也明顯減少了研究人員的工作量，但這種優(yōu)勢也同時被質疑是缺點，因其與人帕金森病慢性致病的病因有所相悖，且其重現(xiàn)性仍需其他實驗室的確認。接觸給藥是一種不同于其他給藥方式的做法，其使動物間接吸收魚藤酮的方式不但與人長期通過皮膚、誤吸魚藤酮的病因相似，且不使大鼠產生外周毒性，降低了死亡率，也是值得反復驗證造模成功率并加以推廣的造模方法。

5 小 結

帕金森病是繼阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease)之后第二常見的神經退行性疾病[43]，已成為中老年人“第三殺手”。為盡快找出帕金森病的致病原因，研究發(fā)病機制和病程變化，以及研發(fā)出有效的治療藥物，一個準確、穩(wěn)定可被復制的理想模型則必不可少。一個精確的帕金森病實驗模型應該重現(xiàn)該病中的緩慢致病進程、典型運動癥狀的改變、進行性和選擇性黑質紋狀體多巴胺能變性等從病因病機至行為病理的不同層面。目前，魚藤酮模型因各種優(yōu)勢被普遍應用，但也存在一些局限和問題：①魚藤酮的注射劑量和持續(xù)時間并沒有一個確定的標準，推薦大鼠頸背部皮下注射魚藤酮每天2 mg/kg，持續(xù)3周的給藥方案；②雖然這種類似的給藥方式造模成功率高，但實驗中所用樣本量較少，且存在易感和不敏感個體，削弱了結果的可信度；③在日常生活中不會發(fā)生毒素給藥的腹腔注射或皮下注射途徑，這些給藥途徑繞過了機體的生理和代謝防御。除了最常用的皮下注射方式，接觸給藥的優(yōu)點也相當值得關注，因此，在之后的研究中，希望能夠著重解決關于魚藤酮皮下注射造模的現(xiàn)存問題，同時驗證接觸給藥的可行性和重現(xiàn)性。