完全弗氏佐劑誘導(dǎo)大鼠慢性骨盆疼痛綜合征炎性痛模型的制備*

徐 暢，吳曉玲，程 凱，李 娜

(北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京100029)

慢性骨盆疼痛綜合征(chronic pelvic pain syndrome,CPPS)是男性泌尿生殖系統(tǒng)中的常見病和多發(fā)病，約占到前列腺炎的90%以上，主要是由于前列腺受到某些非感染因素刺激而發(fā)生的炎癥反應(yīng)[1]。CPPS典型的臨床特征為尿頻、尿急、排尿困難等排尿異常以及腰、骶神經(jīng)所支配的會陰部、外生殖器、膀胱及尿道等部位的疼痛不適，嚴重者還可影響正常性功能，給患者帶來極大的精神負擔(dān)[2]。CPPS的病因、發(fā)病機制及病理生理過程十分復(fù)雜，可能與自身免疫異常、氧化應(yīng)激、內(nèi)分泌失調(diào)等多種因素有關(guān)[3，4]。因此，為了更好地了解CPPS的發(fā)病機制以及找到有效的診治方法，建立可靠的實驗動物模型尤為重要。

基于不同的研究目的，國內(nèi)外研究者已建立的前列腺炎模型包括自身免疫誘導(dǎo)模型，老齡動物自發(fā)模型，激素和去勢誘導(dǎo)模型以及化學(xué)物質(zhì)刺激模型等，這些方法的操作難度、成功率以及炎癥能維持的時間各不相同，且對模型的檢測方法和評價標準也不統(tǒng)一?；瘜W(xué)物質(zhì)刺激法是將角叉菜膠、完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant,CFA)、福爾馬林等物質(zhì)直接注射到動物前列腺組織，其操作方便，使用相對廣泛。且化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的前列腺炎模型不僅能引起無菌性炎癥，還可成功模擬盆腔疼痛[5]。因此，本研究采用向大鼠前列腺組織注射化學(xué)物質(zhì)的方法建立CPPS炎性痛模型。炎癥性疼痛有急性和慢性之分，如角叉菜膠、福爾馬林誘發(fā)的炎性反應(yīng)可在一周后消失，所以多用于制備急性和亞急性炎癥模型[6]。CFA誘導(dǎo)的炎癥性疼痛可持續(xù)2～3周(1～2周以上相當(dāng)于人類患者的慢性期)，且與臨床癥狀最為相關(guān)，所以是誘導(dǎo)慢性炎癥疾病最經(jīng)典、穩(wěn)定的造模藥[7，8]。因此，本實驗通過向大鼠前列腺腹側(cè)葉注射CFA原液，以建立并評估CPPS慢性炎性痛模型，為CPPS的發(fā)病機制及抗炎鎮(zhèn)痛治療提供可靠的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(200±20)g，(由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號[SYXK(京)2016-0006])。大鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)良鄉(xiāng)校區(qū)動物房(23±2)℃，濕度45%～55%，光照/黑暗循環(huán)12 h，自由攝食飲水。

1.2 主要儀器與試劑

CFA、青霉素鈉(北京百諾威生物科技有限公司)；水合氯醛(上海源葉生物科技有限公司)；4%固定液(北京酷來搏科技有限公司)；蘇木精-伊紅染色試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；熱刺痛儀(PL-200，成都泰盟科技有限公司)；正置顯微鏡(德國Leica)；EG1150H石蠟包埋機、切片機、攤片機(德國Leica)。

1.3 分組與模型制備

60只SD雄性大鼠按隨機數(shù)字表法分為空白組，假手術(shù)組和模型組，每組20只。參考洪志明[9]等的方法，向大鼠前列腺腹側(cè)葉注射CFA原液0.1 ml以制備CPPS模型。具體操作為：60只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，將假手術(shù)組和模型組大鼠稱重，以0.35 ml/100 g 10% 水合氯醛溶液腹腔注射麻醉。麻醉滿意后，將大鼠仰臥位固定于動物手術(shù)臺，剃除右下腹部毛發(fā)，用75%酒精消毒皮膚，于大鼠腹正中線右側(cè)旁開1 cm的位置做一縱向切口，長約2 cm。分離肌肉、腹膜，先找到膀胱，然后沿著膀胱頸部找到前列腺組織并充分暴露。用鑷子固定前列腺腹側(cè)葉，在兩側(cè)前列腺腹側(cè)葉分別注射0.05 ml CFA原液，且分離多個注射部位。假手術(shù)組以同樣的方法注射等量無菌生理鹽水溶液。用可吸收縫合線逐層縫合肌肉、皮膚，碘伏消毒傷口(圖1)。術(shù)后將大鼠放置于毛絨毯上等待蘇醒，單籠飼養(yǎng)，連續(xù)3 d用碘伏消毒傷口并腹腔注射青霉素鈉溶液1.6×106U，以防止傷口化膿感染[10]。

Fig. 1 The process of surgical operation to inject CFA solution into the ventral prostate lobes

1.4 大鼠一般情況觀察

觀察各組大鼠的一般狀況，包括活動度、排尿量、毛發(fā)光澤度等。

1.5 熱刺激疼痛閾值測定

參考Hargreaves[11]等的熱痛閾值測定方法，分別于造模第7，14，21，28,35日測定各組大鼠足底和陰囊熱刺激疼痛閾值。設(shè)置熱刺痛儀(PL-200，成都泰盟科技有限公司)實驗參數(shù)為光照強度為50%，照射停止時間為30 s。然后將大鼠用密閉可拆卸的透明有機玻璃盒子隔開，適應(yīng)實驗環(huán)境30 min，待大鼠不再四處張望、走動后開始測量。移動熱刺痛儀控制桶，使其中心刺激光源分別對準大鼠后肢足底中心正下方及陰囊部位。當(dāng)大鼠出現(xiàn)閃躲、抬腿、舔腳以及舔陰囊時則標記為陽性反應(yīng)(圖2)。機器自動記錄的時間為熱刺激疼痛閾值(以s為單位)。每只大鼠重復(fù)測定3次，每次測量中間至少間隔10 min，以防止散熱不夠?qū)Υ笫笤斐蓚σ约坝绊憸y定結(jié)果，以3次測定的平均值為熱刺激疼痛閾值。

1.6 大鼠前列腺濕重以及前列腺指數(shù)觀察

熱刺激疼痛閾值測定結(jié)束后，大鼠稱重，麻醉處死?？焖俜蛛x前列腺組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗去除附著的血液和脂肪組織，吸水紙吸干水分后稱重，分析前列腺指數(shù)。前列腺指數(shù)計算公式：前列腺指數(shù) = 前列腺質(zhì)重(mg)/大鼠體質(zhì)量(g)。

Fig. 2 Measurement of pain threshold of heat stimulation

1.7 大鼠組織學(xué)切片觀察

取大鼠前列腺組織部分右側(cè)腹側(cè)葉，4%多聚甲醛溶液中固定2 d，乙醇梯度脫水(75%、80%、90%、95%、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ)，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋后進行切片，片厚4 μm，蘇木素-伊紅染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組前列腺組織的結(jié)構(gòu)形態(tài)變化。參考文獻[12]，半定量法評價前列腺組織損傷程度，根據(jù)前列腺組織病理學(xué)改變的嚴重程度進行記分制：前列腺腺體形態(tài)正常，腺泡內(nèi)分泌物均勻充盈，間質(zhì)無纖維增生，無炎性細胞浸潤或僅有極少量炎性細胞，記為0分；腺腔輕度萎縮，腺泡內(nèi)分泌物減少，間質(zhì)有輕度纖維增生、少量炎性細胞浸潤記為1分；腺腔嚴重萎縮，腺泡內(nèi)分泌物明顯減少，間質(zhì)纖維增生嚴重，有大量炎性細胞浸潤記為2分；腺腔嚴重萎縮至破壞，上皮細胞破壞，腺泡內(nèi)分泌物完全消失，間質(zhì)纖維增生嚴重，有大量炎性細胞浸潤記為3分。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況觀察

空白組和假手術(shù)組大鼠的精神狀態(tài)、活動度、毛發(fā)光澤度以及排尿量均正常，無死亡。與空白組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠精神萎靡，活動度降低，食欲減退。毛發(fā)光澤度降低，且術(shù)后3 d呈現(xiàn)暗黃色。排尿量顯著增加(同等時間內(nèi)墊料濕度增加)，尿道口偶見乳白色異常分泌物。造模期間3只模型組大鼠出現(xiàn)腹脹、腹瀉、消瘦甚至死亡，考慮與術(shù)后腸蠕動減緩及CPPS伴發(fā)腸易激綜合征有關(guān)。

2.2 大鼠各時期熱刺激疼痛閾值比較

對大鼠足底和陰囊不同時期的熱刺激疼痛閾值進行測定，數(shù)據(jù)顯示(圖3)，空白組大鼠足底和陰囊熱刺激疼痛閾值基本恒定。與空白組比較，假手術(shù)組大鼠足底和陰囊熱刺激疼痛閾值在造模第7日明顯降低(P<0.01)，后逐漸提高并趨于穩(wěn)定。與空白組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠各個時期足底和陰囊熱刺激疼痛閾值均顯著降低(P<0.01)，并在實驗期間維持穩(wěn)定。同實驗階段，大鼠陰囊熱痛閾值稍低于足底熱痛閾值，但二者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

Fig. 3 Thermal stimulation pain threshold were assessed at each time point (7,14,21,28,35 day after modeling) n=15)

2.3 大鼠前列腺濕重和前列腺指數(shù)比較

如圖4所示，與空白組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠前列腺濕重和前列腺指數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

Fig. 4 Comparison of prostate wet weight and prostate index in n=15)

2.4 大鼠前列腺組織病理觀察

肉眼觀察(圖5)，空白組和假手術(shù)組大鼠前列腺組織呈粉紅色，質(zhì)地均勻、柔軟、光滑，無水腫，無硬結(jié)，與周圍膀胱等組織無粘連。與空白組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠前列腺組織呈暗紅色，水腫明顯，組織表面有較多結(jié)節(jié)，質(zhì)地較硬，與周圍組織粘連明顯，不易剝離。

Fig. 5 Anatomy of prostate tissue in control,sham operation and model group

顯微鏡下觀察(圖6)，空白組和假手術(shù)組大鼠前列腺組織結(jié)構(gòu)完整，可見大小不一呈類圓形的腺泡，腺泡上皮呈柱狀，形成許多復(fù)雜的乳頭嵴突向腺管腔。腺腔內(nèi)充滿均勻的粉紅色分泌物，腺泡周圍包繞有大量平滑肌束，間質(zhì)無水腫，無炎性細胞或僅有散在的炎性細胞分布。模型組大鼠前列腺腺腔萎縮、折疊，腔內(nèi)分泌物減少甚至完全消失。部分腺泡上皮細胞由柱狀變成矮柱狀或扁平狀，間質(zhì)內(nèi)有大量炎性細胞浸潤，纖維組織增生，病變嚴重處前列腺腺泡完全為炎性細胞及纖維組織所替代。經(jīng)秩和檢驗，模型組大鼠前列腺炎性反應(yīng)高于空白組和假手術(shù)組，組織病理學(xué)分值有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01，表2)。

Fig. 6 Histology of prostate in control,sham operation and model groups (Scale bar=250 μm),arrows represent inflammatory cell infiltration and atrophic glandular cavity

Tab. 2 Pathological changes of prostate tissues(n=15)

3 討論

慢性盆腔疼痛是CPPS最突出的癥狀表現(xiàn)，由于疼痛部位廣泛且遷延難愈，給患者帶來巨大的身體痛苦和精神負擔(dān)[13]。疼痛通常與炎癥有關(guān)，炎性痛是由感染、創(chuàng)傷、化學(xué)物質(zhì)等引起外周組織損傷，刺激炎癥細胞和神經(jīng)末梢釋放炎性因子導(dǎo)致炎癥反應(yīng)所發(fā)生的疼痛，以痛覺過敏和痛覺超敏為主要臨床特征，同時可伴有局部紅腫熱痛和功能障礙，是臨床中最常見的疼痛類型[9]。研究表明，在CPPS患者前列腺液中通常可以檢測到促炎性細胞因子表達的上調(diào)，證實CPPS患者機體常處于炎癥狀態(tài)[14]。而病灶局部釋放的炎性介質(zhì)可持續(xù)刺激傷害性感受器，傷害性信號的持續(xù)或反復(fù)刺激還可增加中樞神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，引起脊髓內(nèi)感覺神經(jīng)元興奮性發(fā)生改變，這些可能是炎癥驅(qū)動下導(dǎo)致機體痛覺敏感性提高的重要原因[15，16]。因此，為了進一步明確CPPS慢性炎癥性疼痛的病因、發(fā)病機制以及探索有效的治療方法，本研究采用向大鼠前列腺組織注射CFA原液建立CPPS慢性炎性痛模型。

CFA是由結(jié)核分支桿菌、液體石蠟、羊毛脂等在高溫下滅活而成的一種混合油劑，可能導(dǎo)致注射部位局部炎癥和肉芽腫性反應(yīng)，慢性炎癥，局部膿腫或組織脫落，關(guān)節(jié)炎等，多用于各種炎性痛疾病模型的制備[17]。根據(jù)CFA注射指南，參考大鼠肌肉注射方法，本研究確定的注射劑量為0.1 ml，注射部位為大鼠前列腺腹側(cè)葉，且分離注射部位以避免聚結(jié)炎性病變。盡管有文獻指出前列腺背側(cè)葉效果更好，但由于背側(cè)葉體積小，且位于精囊內(nèi)側(cè)，不易操作，所以將腹側(cè)葉作為首選注射部位[18]。另外，本研究考慮到后期需要對大鼠關(guān)元穴、中極穴進行針刺，為了避免穴位的損傷，我們在大鼠下腹部前正中線旁開1 cm做切口，保證大鼠生存率不受影響。

前列腺組織學(xué)改變是判斷炎癥是否發(fā)生以及嚴重程度最直觀的指標，研究結(jié)果顯示，CPPS模型組大鼠前列腺組織受損嚴重，前列腺濕重及前列腺指數(shù)顯著增加，組織間質(zhì)內(nèi)大量炎性細胞浸潤，腺腔萎縮嚴重，組織病理評分提高，提示CFA成功誘發(fā)前列腺組織的炎癥反應(yīng)。

急性炎癥性疼痛是對組織損傷或感染的自然生理反應(yīng)，對于機體來說具有積極意義，并且有一定的自愈能力。而慢性炎癥性疼痛往往由急性炎癥性疼痛發(fā)展而來，疼痛可持續(xù)數(shù)月甚至數(shù)年，甚至造成嚴重的功能障礙[19]。據(jù)以往的研究發(fā)現(xiàn)，由于不同的造模藥能維持的成模時間不同，因此，疼痛持續(xù)時間是本研究關(guān)注的重點。臨床中對CPPS疼痛的評估多采用NIH-CPSI量表，但實驗動物無法用語言來表達其感受到的傷害性刺激，所以需通過行為學(xué)表現(xiàn)如探索行為減少、反射縮足行為、搔抓嘶叫等來間接評價其疼痛程度。利用熱刺痛儀對熱痛閾值進行測定是動物模型中常用的定量衡量疼痛的方法之一，測痛部位常根據(jù)疾病性質(zhì)和疼痛部位而定[20]。結(jié)合CPPS的疼痛部位以及測痛儀器的限制，我們首先對大鼠陰囊進行測痛實驗。結(jié)果顯示，造模第7日時，假手術(shù)組大鼠陰囊熱痛閾值降低，提示手術(shù)損傷可能會引起大鼠痛閾值的短暫性波動，而隨著傷口恢復(fù)，大鼠痛閾值提高并趨于平穩(wěn)。與同時期的空白組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠陰囊的痛閾值顯著降低并可穩(wěn)定維持5周以上，提示CFA可成功誘導(dǎo)大鼠慢性疼痛，且疼痛維持時間較長，模型較為穩(wěn)定。

同樣，我們在大鼠足底也檢測到痛覺敏感性的提高，這可以從神經(jīng)傳導(dǎo)與反射來分析。從神經(jīng)解剖學(xué)來看，大鼠坐骨神經(jīng)主要由L3-6、S1-2神經(jīng)根參與匯合成腰骶神經(jīng)叢，向下延續(xù)為坐骨神經(jīng)干。其先在骶髂關(guān)節(jié)前走行，后繞過股骨大轉(zhuǎn)子進入股骨后方，發(fā)出3大分支，腓總神經(jīng)、脛神經(jīng)和腓腸神經(jīng)。其中脛神經(jīng)為坐骨神經(jīng)的主要終末支，發(fā)出分支支配腓腸肌和屈趾肌群，并沿其下行至足底支配足內(nèi)側(cè)皮膚及肌肉[21]。因此，大鼠足底痛敏也可以反映其盆腔部位的痛覺敏感性，且操作性更強。

綜上所述，向大鼠前列腺腹側(cè)葉注射0.1 ml CFA原液可成功制備較持久、穩(wěn)定的CPPS慢性炎癥性疼痛模型，該建模方法可為后期CPPS的機制研究及鎮(zhèn)痛治療提供良好的工作基礎(chǔ)。但上述方法仍存在不足之處，如實驗中注射造模藥物僅采用一個劑量，缺少不同劑量之間的比較，因此還需后期不斷完善。