食品中兩種沙門氏菌檢測(cè)方法的比較*

顧雨熹 王 錦 陳 帥 李 理 陳晉瑩

(中儲(chǔ)糧成都儲(chǔ)藏研究院有限公司 610091)

沙門氏菌屬(Salmonellaspp.)是一類腸桿菌科的革蘭氏陽(yáng)性菌，需氧及兼性厭氧，是主要的食源性病原體之一[1]，也是一種常見的人畜共患的病原菌，可引起人和動(dòng)物腸炎熱、胃炎熱、敗血癥等[2]。

人類感染沙門氏菌的主要途徑是食用了被沙門氏菌污染的蛋類、禽類肉制品和豬肉[3]。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2015年發(fā)布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，自2010年以來全球發(fā)生了涉及22種不同食源性腸道疾病5.82億例，造成35.1萬人死亡，其中傷寒沙門氏菌造成5.2萬例死亡。近年來報(bào)道顯示，在我國(guó)每年也有900多萬人次因沙門氏菌患病，導(dǎo)致近800人死亡。沙門氏菌也容易成為動(dòng)物源性飼料的主要污染源，其中以骨粉、魚粉、血粉等蛋白質(zhì)飼料最易被沙門氏菌污染[4]。用沙門氏菌污染的飼料飼喂動(dòng)物，是引起禽傷寒、豬霍亂、鼠傷寒沙門氏菌病、豬副傷寒、馬流產(chǎn)沙門氏菌等動(dòng)物疾病的主要途徑，造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大，嚴(yán)重威脅養(yǎng)殖業(yè)健康和可持續(xù)發(fā)展[5]。

沙門氏菌已經(jīng)成為食源性致病菌重點(diǎn)監(jiān)控對(duì)象，但是目前還沒有發(fā)現(xiàn)能有效預(yù)防沙門氏菌傳播的藥物[6]。因此，快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)食品和飼料中的沙門氏菌是有效防控沙門氏菌感染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，重視沙門氏菌的檢測(cè)工作才能最大限度防范沙門氏菌帶來的食品安全隱患。截至2021年9月30日，現(xiàn)行有效的沙門氏菌相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)共28個(gè)，其中國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)6個(gè)，地方標(biāo)準(zhǔn)12個(gè)，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)10個(gè)。

食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4-2016規(guī)定了食品中沙門氏菌的檢驗(yàn)方法，該方法為較為傳統(tǒng)的微生物學(xué)檢驗(yàn)法，檢驗(yàn)鑒定程序復(fù)雜，檢測(cè)周期較長(zhǎng)。隨著近年來細(xì)菌學(xué)研究的持續(xù)深入，細(xì)菌檢測(cè)漸漸從表型判定轉(zhuǎn)向基因鑒定。近年發(fā)展起來的PCR技術(shù)(Polymerase Chain Reaction)其本質(zhì)是在體外大量擴(kuò)增目的DNA片段，該技術(shù)具有檢測(cè)時(shí)間少、特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)[7]。

本次研究對(duì)同一批樣品分別使用微生物學(xué)檢驗(yàn)法和PCR法進(jìn)行檢測(cè)。通過對(duì)比兩種方法在實(shí)際檢測(cè)過程中的差異，為探索沙門氏菌檢測(cè)方法的優(yōu)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品及陽(yáng)性對(duì)照 待測(cè)盲樣3個(gè)，均為白色粉狀樣品，采用西林瓶真空密封包裝，由大連中食國(guó)實(shí)檢測(cè)技術(shù)有限公司提供，分別編號(hào)為N1、N2、N3。

陽(yáng)性對(duì)照：腸沙門氏菌腸亞種(中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號(hào)：CICC21513)，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

陰性對(duì)照：滅菌ddH20。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 培養(yǎng)基：緩沖蛋白胨水(BPW)；四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液；亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液；亞硫酸鉍(BS)瓊脂；木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂；營(yíng)養(yǎng)瓊脂。

試劑：DBI-05沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒(北京產(chǎn))；細(xì)菌DNA提取試劑盒(南京產(chǎn))；2×Rapid Taq Master Mix(南京產(chǎn))；Ultra GelRed Nucleic Acid Stain(南京產(chǎn))；1×TAE緩沖液；DL2000 Plus DNA Marker(南京產(chǎn))。

沙門氏菌特異性引物設(shè)計(jì)參考飼料中沙門氏菌檢測(cè)PCR法中所用引物[8]，本研究所使用的PCR引物及測(cè)序均由成都某公司提供。

表1 PCR引物及測(cè)序

1.1.3 儀器與設(shè)備 高壓蒸汽滅菌鍋(HVE-50)；無菌操作臺(tái)(SW-CJ-1FD)，蘇州產(chǎn)；恒溫培養(yǎng)箱(BD53)；PCR儀(ETC811),北京產(chǎn)；電泳儀(WIX-EP600)，北京產(chǎn)；凝膠成像儀(GenoSens 2100),上海產(chǎn)；純水儀(Direct 16)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 微生物學(xué)檢驗(yàn) 微生物學(xué)檢驗(yàn)方法按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》中規(guī)定的食品中沙門氏菌的檢驗(yàn)方法，依據(jù)其生化特性，通過預(yù)增菌、選擇性增菌、分離、純化培養(yǎng)、生化鑒定5個(gè)步驟對(duì)沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)(圖1)。

圖1 沙門氏菌微生物學(xué)檢測(cè)流程

1.2.1.1 預(yù)增菌 在無菌條件下，將3個(gè)待測(cè)盲樣與225 mL BPW培養(yǎng)基混勻后，置于恒溫培養(yǎng)箱中36±1℃培養(yǎng)8 h～18 h。

1.2.1.2 選擇性增菌 在無菌條件下，分別取預(yù)培養(yǎng)的樣品混合液1 mL加入10 mL TTB培養(yǎng)基與10 mL SC培養(yǎng)基。TTB培養(yǎng)基混合物置于恒溫培養(yǎng)箱中42±1℃培養(yǎng)18 h～24 h，SC培養(yǎng)基混合物置于恒溫培養(yǎng)箱中36±1℃培養(yǎng)18 h～24 h。

1.2.1.3 分離 在無菌條件下，分別取選擇性增菌液一環(huán)，劃線接種于一個(gè)BS平板和一個(gè)XLD平板，置于恒溫培養(yǎng)箱中36±1℃分別培養(yǎng)40 h～48 h(BS平板)和18 h～24 h(XLD平板)。培養(yǎng)后觀察各選擇性平板上生長(zhǎng)的菌落特征(表1)。

表1 沙門氏菌落特征

1.2.1.4 純化培養(yǎng) 從選擇性平板上分別挑取2個(gè)以上典型菌落接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板進(jìn)行純化培養(yǎng)，于36±1℃培養(yǎng)18 h～24 h。

1.2.1.5 生化鑒定 挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板的培養(yǎng)物，按照DBI-05沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒說明書操作進(jìn)行生化鑒定。

1.2.2 PCR法檢驗(yàn) 根據(jù)沙門氏菌特征基因片段的分子生物學(xué)特性，通過預(yù)增菌、選擇性增菌、模板制備、PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)、測(cè)序驗(yàn)證6個(gè)步驟對(duì)沙門氏菌進(jìn)行快速檢測(cè)(圖2)。

圖2 沙門氏菌PCR法檢測(cè)流程圖

1.2.2.1 預(yù)增菌 將3個(gè)待測(cè)盲樣、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，采用1.2.1中的預(yù)增菌方法進(jìn)行預(yù)增菌。

1.2.2.2 選擇性增菌 同1.2.1.2中的選擇性增菌方法。

1.2.2.3 模板制備 使用細(xì)菌DNA提取試劑盒，提取增菌后的3個(gè)待測(cè)盲樣、陽(yáng)性對(duì)照樣品和陰性對(duì)照樣品的DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，待測(cè)盲樣和陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)明亮條帶并且陰性對(duì)照無條帶，則為模板制備成功且模板制備過程中沒有出現(xiàn)人為污染。

1.2.2.4 PCR擴(kuò)增(見表2)

表2 反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)

1.2.2.5 電泳檢測(cè) 將1.5 g瓊脂糖加入100 mL 1×TAE緩沖液中加熱至充分溶化，冷卻至60℃～65℃，加入10 μL GelRed充分混勻。根據(jù)需要在制膠器中放入合適的梳子，制成電泳膠塊，放入電泳槽內(nèi)。取6 μL Marker2000點(diǎn)樣，并將7 μL～9 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣于同一塊膠上。5 V/cm恒壓電泳，至指示劑遷移至凝膠中后部，用成像儀進(jìn)行凝膠成像，觀察在330 bp處是否出現(xiàn)條帶，如有則為疑似陽(yáng)性樣品。

1.2.2.6 測(cè)序 對(duì)于疑似陽(yáng)性樣品，將其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果NCBI網(wǎng)站上用BLAST工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行序列比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種方法檢測(cè)程序?qū)Ρ?/h3>

沙門氏菌微生物檢測(cè)的過程中，預(yù)增菌步驟所需時(shí)間為8 h～18 h，增菌步驟所需時(shí)間為18 h～24 h，純化培養(yǎng)所需時(shí)間為18 h～24 h，微生物學(xué)檢測(cè)在使用較為便捷的沙門氏菌生化鑒定試劑盒的情況下仍需24 h的檢測(cè)時(shí)間，該法的總檢測(cè)時(shí)間為68 h～90 h。

本次試驗(yàn)所使用的沙門氏菌PCR檢測(cè)的過程中，預(yù)增菌和增菌步驟與微生物法一致，但在分子生物學(xué)檢測(cè)中僅需要2 h左右即可完成初步檢測(cè)，總檢測(cè)時(shí)間約為28 h～44 h，如需進(jìn)行測(cè)序則總檢測(cè)時(shí)間再增加8 h～12 h，為36 h～56 h。

PCR法檢測(cè)總時(shí)長(zhǎng)36 h～56 h較微生物學(xué)檢測(cè)總時(shí)長(zhǎng)68 h～90 h，節(jié)約了近一半的檢測(cè)時(shí)間，顯著地提升了檢測(cè)效率。且在前期的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備中，微生物學(xué)法需要準(zhǔn)備6種培養(yǎng)基，PCR法僅需準(zhǔn)備3種培養(yǎng)基，利用PCR法對(duì)沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)成本更低、操作更簡(jiǎn)單。

2.2 檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

2.2.1 微生物學(xué)檢測(cè)法檢測(cè)結(jié)果 檢測(cè)結(jié)果表明(表3)，N2為典型的含沙門氏菌屬的樣品，N1、N3為不含沙門氏菌屬的樣品。

表3 沙門氏菌微生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.2.2 PCR法檢測(cè)結(jié)果 選擇性增菌后提取N1-N3、陽(yáng)性對(duì)照樣品和陰性對(duì)照樣品的核酸，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示模板制備成功且試驗(yàn)過程中沒有出現(xiàn)人為污染。

利用試驗(yàn)設(shè)置的程序和引物對(duì)N1-N3樣品及陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果如圖3，N2和陽(yáng)性對(duì)照在約330 bp處出現(xiàn)明亮條帶。

圖3 PCR法檢測(cè)電泳結(jié)果圖

送測(cè)序后返回的結(jié)果使用NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST功能進(jìn)行序列比對(duì)。結(jié)果顯示，N2擴(kuò)增產(chǎn)物與目的片段的同源性為99%[圖4(a)]，陽(yáng)性對(duì)照與目的片段擴(kuò)增產(chǎn)物的同源性為98%[圖4(b)]，N2與陽(yáng)性對(duì)照中均順利擴(kuò)增出目的片段，說明利用本試驗(yàn)中的方法檢測(cè)沙門氏菌具有可行性，檢測(cè)結(jié)果可靠。

(a)N2擴(kuò)增序列與目的片段(Target)比對(duì)結(jié)果

(b)對(duì)照組(C)擴(kuò)增序列與目的片段(Target)比對(duì)結(jié)果

為了進(jìn)一步了解樣品中沙門氏菌的種屬，將對(duì)照組(C)的擴(kuò)增序列在NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，該序列與腸沙門氏菌腸亞種(Salmonellaentericasubsp.enterica)完全一致，同源性達(dá)到100%[圖5(a)]，該結(jié)果與事實(shí)相符。隨后，我們將N2擴(kuò)增產(chǎn)物序列在NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，該序列與腸沙門氏菌腸亞種的同源性最高達(dá)到99%[圖5(b)]，推測(cè)N2中的沙門氏菌為腸沙門氏菌腸亞種中的一種。

(a)C(對(duì)照組)在基因數(shù)據(jù)庫(kù)中的比對(duì)結(jié)果

(b)N2在基因數(shù)據(jù)庫(kù)中的比對(duì)結(jié)果

通過試驗(yàn)證明，PCR法的檢測(cè)結(jié)果與微生物學(xué)檢測(cè)法的結(jié)果一致，均為：N2為含沙門氏菌的陽(yáng)性樣品，N1、N3為不含沙門氏菌的陰性樣品。

3 分析與結(jié)論

PCR法與傳統(tǒng)微生物學(xué)檢測(cè)法得出的結(jié)果高度一致，結(jié)果均是N2為沙門氏菌陽(yáng)性樣品、N1和N3為沙門氏菌陰性樣品，后經(jīng)大連中食國(guó)實(shí)反饋該檢測(cè)結(jié)果正確。說明兩種方法均能在實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用中得出準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，且PCR法檢測(cè)具有時(shí)間短、特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、成本低的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)[8]。

盡管PCR技術(shù)具有一定的優(yōu)勢(shì)，在現(xiàn)代食品安全檢測(cè)技術(shù)中發(fā)揮著重要作用，但它還存在一些值得關(guān)注的問題。其中最常見的就是外源基因污染問題，由于PCR的靈敏度較高，且該P(yáng)CR的實(shí)質(zhì)是通過體外大量擴(kuò)增DNA片段從而放大信號(hào)。如果檢測(cè)過程中被外源DNA污染，很容易得到假陽(yáng)性結(jié)果，就會(huì)嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[9]。

近年來，PCR技術(shù)在沙門氏菌檢測(cè)中還取得了一些新的進(jìn)展。有研究運(yùn)用多重PCR技術(shù)檢測(cè)沙門氏菌，僅需一次反應(yīng)即可同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌的多個(gè)特異片段，在節(jié)約試劑、減少反應(yīng)時(shí)間、大幅提高靈敏度的同時(shí)減少假陽(yáng)性的出現(xiàn)[10]；多重PCR技術(shù)還可以用于同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌和其它有害菌，如奇異變形桿菌[11]、溶血性大腸桿菌、蘭氏乳桿菌[12]、金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌、霉菌[13]、副溶血性弧菌、霍亂弧菌[14]等。還有研究利用巢式PCR的原理通過使用兩對(duì)不同的引物擴(kuò)增同一條特異性片段，此法的特異性很高可以檢測(cè)到最低4 CFU/25 g的沙門氏菌[15]。劉斌等[16]在PCR反應(yīng)體系中加入人造擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)片段，可以有效排除沙門氏菌PCR檢測(cè)中的假陰性結(jié)果，提高檢測(cè)準(zhǔn)確率。為了進(jìn)一步提高敏感性和特異性，PCR法還可以和其它方法聯(lián)合使用。比如，將PCR和DNA探針法相結(jié)合，該體系可以檢測(cè)到30 pg以上的沙門氏菌DNA[17]；將PCR法和ELISA法相結(jié)合，可以檢測(cè)到14 pg以上的沙門氏菌DNA[18]；將PCR技術(shù)與疊氮溴乙錠相結(jié)合，可以避免沙門氏菌檢測(cè)中因死細(xì)菌[19]造成的假陽(yáng)性結(jié)果；將多重PCR技術(shù)檢測(cè)與毛細(xì)管電泳成像技術(shù)相結(jié)合，可以同時(shí)對(duì)五種病原進(jìn)行快速檢測(cè)大幅提高檢測(cè)效率[20]等等。

食品中致病菌的快速檢測(cè)是確保食品安全的前提，PCR法為沙門氏菌的檢測(cè)提供了一種新選擇，該方法的應(yīng)用也為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制修定提供了理論支撐和技術(shù)支撐。由此可以預(yù)見，隨著社會(huì)進(jìn)步和科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，PCR技術(shù)及其衍生出的新技術(shù)與其他諸如生物芯片、免疫磁珠等在食品致病菌檢測(cè)中的聯(lián)合使用，既能大大提高檢測(cè)效率，又能保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，必將在食品微生物檢測(cè)和研究領(lǐng)域開辟一個(gè)新的應(yīng)用時(shí)代。