植物乳桿菌CY1-2 對(duì)粉紅單端孢體外和番茄體內(nèi)的抑菌活性及可能機(jī)制研究

張晨陽，侯佳寶，程 園，李燦嬰,2，葛永紅,2,*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121013；2.生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013）

粉紅單端孢（Trichothecium roseum）是重要的采后致腐真菌之一，會(huì)導(dǎo)致鱷梨[1]、芒果[2]、甜瓜[3-4]、蘋果[5]、葡萄[6]、番茄[7]、黃瓜[8]等果蔬的采后腐爛。該病原菌不僅由果實(shí)表面的傷口侵染進(jìn)入體內(nèi)而引起果實(shí)腐爛，而且還會(huì)在寄主體內(nèi)產(chǎn)生具有致癌作用的單端孢霉烯毒素[5]。生產(chǎn)中主要應(yīng)用人工合成的殺菌劑控制由T.roseum 引起的病害，但存在殘留、環(huán)境污染、誘導(dǎo)病原物產(chǎn)生抗藥性等問題[9]。研究表明，離體條件下，核黃素、ε-聚賴氨酸、硝普鈉、磷酸鈉對(duì)T.roseum的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)有顯著抑制效果[10-13]。此外，香菜精油對(duì)T. roseum 菌絲生長(zhǎng)也有明顯的抑制效果[14]。體內(nèi)試驗(yàn)表明，采后使用苯并噻重氮、康壯素、硅酸鈉、草酸、硫胺素進(jìn)行處理，能夠抑制甜瓜果實(shí)由T.roseum 引起的粉霉病[15-18]。

利用拮抗菌控制采后病害是果蔬病害防治的新方法之一，其以微生物之間的寄生、拮抗作用為理論基礎(chǔ)[19]。乳酸菌是一類無芽孢的革蘭氏陽性細(xì)菌，具有廣譜抑菌特性，廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)[20]。研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌LH-B02、NR115605.1、IMAU10014 可以改善蓮藕的貯藏性能，抑制采后木瓜、芒果和卷心菜等果蔬的炭疽病[21-23]。Fang 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，保加利亞乳桿菌F17 對(duì)葡萄灰霉病具有良好的抑制作用，并能延緩葡萄的成熟和衰老。此外，植物乳桿菌PTCC1058結(jié)合羧甲基纖維素能夠抑制草莓果實(shí)表面酵母和霉菌的生長(zhǎng)[25]。Lü 等[26]報(bào)道，植物乳桿菌C10 顯著抑制了T.roseum 的生長(zhǎng)，并且嚴(yán)重破壞了T.roseum 的孢子結(jié)構(gòu)。然而，尚未見植物乳桿菌CY1-2 對(duì)番茄紅粉病的控制及其抑菌機(jī)理的研究報(bào)道。

本文以T.roseum 為對(duì)象，研究植物乳桿菌CY1-2（Lactobacillus plantarum CY1-2）在體內(nèi)和體外條件下對(duì)T.roseum 生長(zhǎng)的影響，并初步探討了L.plantarum CY1-2 抑制T.roseum 生長(zhǎng)的機(jī)制，以期為開發(fā)新的生物防腐保鮮劑奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

粉紅單端孢：渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院采后試驗(yàn)室保存菌種，使用前用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基以24 ℃活化培養(yǎng)5～7 d；植物乳桿菌CY1-2：渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物課題組提供，分離自朝陽傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜，使用前在莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良乳酸菌（MRS）液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h；番茄果實(shí)，購買自錦州市當(dāng)?shù)嘏l(fā)市場(chǎng)。

馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，上海廣銳生物科技有限公司；MRS 液體培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；乙酸乙酯、蒽酮，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250，北京瑞爾欣德科技有限公司；2-硫代巴比妥酸（TBA），上海源葉生物科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

UV-2250 紫外可見分光光度計(jì)，山東奧秘科技有限公司；JEM-1230 型透射式電子顯微鏡，美國(guó)GATAN 公司；H1650 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；HZQ/THZ 恒溫振蕩器、HZQ-X300C 恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DDSJ-308A 電導(dǎo)率儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Accuri C6 流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD 有限公司。

1.2 方法

1.2.1 孢子懸浮液制備

參照Ge 等[27]的方法。將培養(yǎng)7 d 的T.roseum PDA平板用5～10 mL 無菌蒸餾水清洗，經(jīng)無菌紗布過濾后配制成濃度為1.0×106CFU/mL 的孢子懸浮液。

1.2.2 不同濃度L.plantarum CY1-2 對(duì)T.roseum 孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的影響

參照Ge 等[28]的試驗(yàn)方法并修改。在分別含有0、1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107CFU/mL L. plantarum CY1-2 的PDA 平板中央放置培養(yǎng)5 d 的T. roseum 菌餅（直徑5 mm），26 ℃恒溫培養(yǎng)，從第4 天開始每2 d 測(cè)量菌落直徑，直至對(duì)照菌絲長(zhǎng)至邊緣。每個(gè)濃度制作10 個(gè)平板，重復(fù)3 次。

將制備的1.0×106CFU/mL 的T.roseum 孢子懸浮液分別與含有0、1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107CFU/mL 的L. plantarum CY1-2 等體積混合，然后分別向PDA 平板中接入100 μL 混合液，用涂布棒涂抹均勻后于26 ℃恒溫培養(yǎng)。從接種后14 h 開始每2 h 在電子顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)狀態(tài)，每個(gè)濃度每次統(tǒng)計(jì)300 個(gè)孢子。對(duì)照組（未添加L.plantarum CY1-2）孢子萌發(fā)率大于80%時(shí)停止觀察計(jì)數(shù)。

1.2.3 番茄果實(shí)損傷接種

參照Ge 等[29]的方法并作修改。番茄果實(shí)用75%乙醇進(jìn)行表面消毒，然后用直徑3 mm 無菌鐵釘在果實(shí)赤道部位均勻刺4 個(gè)傷口（2 mm×3 mm）。自然晾干后，每個(gè)傷口接種10 μL T.roseum 孢子懸浮液（1×106個(gè)孢子/mL）。室溫下干燥4 h 后，將10 μL 不同濃度（0、1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107CFU/mL）的L.plantarum CY1-2 接種于同一傷口，自然干燥后，于（25±1）℃、相對(duì)濕度65%±5%條件下貯藏，接種培養(yǎng)3 d 后用十字交叉法測(cè)定病斑直徑，每2 d 測(cè)量1 次。每個(gè)濃度使用30 個(gè)果實(shí)。

綜合以上結(jié)果篩選能夠顯著抑制T.roseum 生長(zhǎng)的最低L.plantarum CY1-2 濃度。

1.2.4 細(xì)菌液體培養(yǎng)

分別取2.0mLT.roseum 孢子懸浮液和L.plantarum CY1-2 懸浮液加入到MRS 液體培養(yǎng)基中（T. roseum培養(yǎng)2 瓶，L.plantarum CY1-2 培養(yǎng)1 瓶），置于恒溫振蕩器中（26 ℃、120 r/min）振蕩培養(yǎng)3 d，在其中1 瓶T.roseum 培養(yǎng)液中加入L.plantarum CY1-2，使終濃度為1.0×105CFU/mL。每2 h 分別取4 mL 菌液，于4 ℃下離心（12 000 r/min）10 min，收集各個(gè)時(shí)間段的上清液及沉淀進(jìn)行電導(dǎo)率、丙二醛和胞外泄漏物含量的測(cè)定。

1.2.5 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.5.1 相對(duì)電導(dǎo)率

參考Wei 等[11]的方法并稍作修改。將“1.2.4”所述沉淀用無菌水清洗3 次，加至含有30 mL 無菌水的三角瓶中，25 ℃保溫30 min，測(cè)定電解質(zhì)滲漏值（D1），隨后將三角瓶于95 ℃保溫30 min，測(cè)量菌體被殺死后電解質(zhì)滲漏值（D2）。相對(duì)電導(dǎo)率計(jì)算公式如下：

相對(duì)電導(dǎo)率（%）=D1/D2×100

1.2.5.2 MDA、胞外蛋白和可溶性糖含量

參照Wei 等[11]的方法進(jìn)行測(cè)定。胞外蛋白含量取“1.2.4”所述上清液0.5 mL 放入試管中，加入2.5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250 溶液，充分混合，放置2 min 后在595 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值。可溶性糖含量取“1.2.4”所述上清液0.2 mL 于試管中，然后向試管中依次加入1.8 mL 無菌蒸餾水、0.2 mL 蒽酮-乙酸乙酯溶液和0.6 mL 濃硫酸，充分混勻，自然冷卻后在625 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。胞外蛋白和可溶性糖含量參照牛血清白蛋白和蔗糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，以μg/mL 表示。

MDA 含量（μmol/L）=6.45×（OD532-OD600）-0.56×OD450式中：OD450、OD532、OD600分別代表450、532、600 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值。

1.2.5.3 細(xì)胞存活率測(cè)定

參考Li 等[30]的方法并稍作修改。向3 個(gè)錐形瓶中各加入100 mL 100 mmol/L 磷酸緩沖液（pH 7.4，含2.0 g D-葡萄糖）。向其中2 個(gè)錐形瓶中加入2.0 mL T. roseum 孢子懸浮液，最后一個(gè)錐形瓶中加入L.plantarum CY1-2，使終濃度為1.0×105CFU/mL。將L. plantarum CY1-2（1.0×105CFU/mL）加入接種T.roseum 的兩個(gè)錐形瓶中，置于恒溫振蕩器（26 ℃、120 r/min）振蕩培養(yǎng)0、3、6、12、24、48 h 后10 000 r/min離心5 min，用磷酸緩沖液洗滌2 次，使孢子懸浮于500 μL 磷酸緩沖液（10.0 mmol/L，pH 7.4）中。用10 μL 碘化丙啶（5.0 mg/mL）顯色，然后置于黑暗條件下（28 ℃）靜置培養(yǎng)30 min，以10 000 r/min 離心5 min，再用磷酸緩沖液洗滌2 次，使孢子懸浮于500 μL 磷酸緩沖液（10.0 mmol/L，pH 7.4）中。用Accuri C6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)。每個(gè)樣本作3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)選擇10 000 個(gè)孢子。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

全部指標(biāo)進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)，采用Microsoft Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、作圖并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差，采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度L.plantarum CY1-2 處理對(duì)T.roseum菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響

由表1 可知，在對(duì)照和添加1.0×101、1.0×102、1.0×103CFU/mL L. plantarum CY1-2 的PDA 平板上T. roseum 均能生長(zhǎng)，菌落直徑隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，并隨L. plantarum CY1-2 濃度的增加而減小。L. plantarum CY1-2 濃度分別為1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107CFU/mL 時(shí)，T. roseum 的生長(zhǎng)完全受到抑制。培養(yǎng)4 d 時(shí)，1.0×101、1.0×102CFU/mL L. plantarum CY1-2 處理與對(duì)照之間無顯著性差異，但1.0×103CFU/mL L.plantarum CY1-2 處理顯著抑制了T.roseum 菌落的生長(zhǎng)。

表1 不同濃度L.plantarum CY1-2 處理對(duì)T.roseum 菌絲生長(zhǎng)的影響Table 1 Effects of L.plantarum CY1-2 at different concentrations on mycelial growth of T.roseum 單位：mm

由表2 可知，不同濃度的L.plantarum CY1-2 均能顯著抑制T.roseum 孢子萌發(fā)，且隨著L.plantarum CY1-2 濃度的增大，其抑制效果增強(qiáng)。培養(yǎng)20 h 時(shí)，對(duì)照T.roseum 的萌發(fā)率為93.25%，添加1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107CFU/mL L.plantarumCY1-2 的T.roseum 萌發(fā)率分別為86.50%、64.25%、53.50%、42.50%、35.75%、30.75%、24.50%。

表2 不同濃度L.plantarum CY1-2 處理對(duì)T.roseum 孢子萌發(fā)率的影響Table 2 Effects of L.plantarum CY1-2 at different concentrations on conidia germination rate of T.roseum 單位：%

結(jié)合體內(nèi)和體外試驗(yàn)結(jié)果，選擇1.0×105CFU/mL的L.plantarum CY1-2 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 不同濃度L.plantarum CY1-2 對(duì)損傷接種番茄果實(shí)病斑直徑的影響

由表3 可知，與對(duì)照相比，L.plantarum CY1-2 處理能抑制接種T.roseum 番茄果實(shí)的病斑直徑。不同濃度L. plantarum CY1-2 處理的番茄果實(shí)接種的T. roseum 均能生長(zhǎng)，1.0×106、1.0×107CFU/mL 的L. plantarum CY1-2 處理則于培養(yǎng)3 d 后完全抑制了病斑的生長(zhǎng)，而其他濃度處理的病斑直徑隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。培養(yǎng)至第5 天時(shí)，1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105CFU/mL 濃度的L. plantarum CY1-2 處理均顯著抑制了T.roseum 菌絲生長(zhǎng)。在貯藏至第7 天時(shí)，L.plantarum CY1-2 在1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105CFU/mL 濃度下對(duì)番茄果實(shí)病斑的抑制率分別為17.25%、30.46%、44.47%、46.09%、51.21%。1.0×103、1.0×104、1.0×105CFU/mL L.plantarum CY1-2 處理之間番茄果實(shí)的病斑直徑無顯著差異。

表3 不同濃度L.plantarum CY1-2 處理對(duì)損傷接種T.roseum 番茄果實(shí)病斑直徑的影響Table 3 Effects of L.plantarum CY1-2 at different concentrations on lesion diameter of tomato fruit inoculated with T.roseum單位：mm

2.3 L.plantarum CY1-2 處理后T. roseum 相對(duì)電導(dǎo)率和MDA 含量的變化

相對(duì)電導(dǎo)率與細(xì)胞膜透性的大小呈正相關(guān)關(guān)系，即細(xì)胞膜遭到破壞，細(xì)胞內(nèi)部電解質(zhì)會(huì)逐漸向外滲漏，從而引起溶液相對(duì)電導(dǎo)率的上升。由圖1A 可知，在整個(gè)培養(yǎng)期間，單獨(dú)接種T.roseum 培養(yǎng)液及同時(shí)接種T.roseum 和L.plantarum CY1-2 培養(yǎng)液的相對(duì)電導(dǎo)率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。單獨(dú)接種L. plantarum CY1-2 培養(yǎng)液的相對(duì)電導(dǎo)率變化幅度不大；接種T.roseum 和L.plantarum CY1-2 培養(yǎng)液的相對(duì)電導(dǎo)率在0 h 和6～8 h 均高于單獨(dú)接種T. roseum培養(yǎng)液，但在2 h 和4 h 時(shí)差異不顯著。由此說明，L. plantarum CY1-2 在培養(yǎng)后期破壞了T. roseum 細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使菌體內(nèi)部的電解質(zhì)外泄至溶液中，從而使電導(dǎo)率上升。

圖1 L.plantarum CY1-2 處理對(duì)T.roseum 相對(duì)電導(dǎo)率（A）和MDA 含量（B）的影響Fig.1 Effects of L.plantarum CY1-2 treatment on the relative conductivity(A)and malondialdehyde content(B)of T.roseum

MDA 是細(xì)胞膜脂過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，反映生物膜危害程度。由圖1B 可知，單獨(dú)接種T. roseum 培養(yǎng)液、同時(shí)接種T.roseum 和L.plantarum CY1-2 培養(yǎng)液與單獨(dú)接種L. plantarum CY1-2 培養(yǎng)液中MDA 含量在0～6 h 均隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，在6～8 h 時(shí)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。在整個(gè)培養(yǎng)過程中，同時(shí)接種T.roseum 和L.plantarum CY1-2 的培養(yǎng)液中MDA 含量比單獨(dú)接種T. roseum 培養(yǎng)液顯著提高（P＜0.05）。由此說明，L. plantarum CY1-2破壞了T.roseum 細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。

2.4 L.plantarum CY1-2 處理對(duì)T. roseum 胞外可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響

胞外可溶性蛋白含量的高低在一定程度上能夠反映細(xì)胞膜的受損程度。由圖2A 可知，單獨(dú)接種T. roseum 培養(yǎng)液、接種T. roseum 和L. plantarum CY1-2 培養(yǎng)液及單獨(dú)接種L. plantarum CY1-2 培養(yǎng)液中胞外可溶性蛋白質(zhì)含量在0～4 h 均有所增加，在4～8 h 基本不變。在整個(gè)培養(yǎng)過程中（6 d 除外），同時(shí)接種T.roseum 和L.plantarum CY1-2 培養(yǎng)液中胞外可溶性蛋白含量均明顯高于單獨(dú)接種T. roseum 培養(yǎng)液和單獨(dú)接種L. plantarum CY1-2 培養(yǎng)液。

由圖2B 可知，單獨(dú)接種T.roseum 培養(yǎng)液、同時(shí)接種T.roseum 和L.plantarum CY1-2 培養(yǎng)液及單獨(dú)接種L. plantarum CY1-2 培養(yǎng)液中可溶性糖含量在培養(yǎng)過程中呈上升趨勢(shì)。與單獨(dú)接種T.roseum 培養(yǎng)液和單獨(dú)接種L.plantarum CY1-2 培養(yǎng)液相比，同時(shí)接種T. roseum 和L.plantarum CY1-2 培養(yǎng)液中胞外可溶性糖含量顯著提高（P＜0.05）。

圖2 L.plantarum CY1-2 處理對(duì)T.roseum 胞外可溶性蛋白含量（A）和可溶性糖含量（B）的影響Fig.2 Effects of L.plantarum CY1-2 treatment on the extracellular soluble protein(A)and soluble sugar(B)contents of T.roseum

2.5 L.plantarum CY1-2 處理對(duì)T. roseum 細(xì)胞存活率的影響

圖3 表明，在T. roseum 孢子懸浮液中添加L.plantarum CY1-2 后，0～24 h T.roseum 細(xì)胞存活率總體呈下降趨勢(shì)，24～48 h 呈上升趨勢(shì)，12 h 存活率顯著低于單獨(dú)接種T. roseum 培養(yǎng)液（P＜0.05），0～6 h和24～48 h 的細(xì)胞存活率無明顯差異。

圖3 L.plantarum CY1-2 處理對(duì)T.roseum 細(xì)胞存活率的影響Fig.3 Effects of L.plantarum CY1-2 treatment on the cell survival rate of T.roseum

3 討論

將乳酸菌添加到食品中作為生物防腐劑使用能有效地避免由化學(xué)防腐保鮮劑帶來的不利影響[31]。本研究表明，不同濃度的L.plantarum CY1-2 可以抑制體外條件下T.roseum 的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)，且抑制率與濃度呈正相關(guān)。此外，L.plantarum CY1-2 對(duì)損傷接種T.roseum 番茄果實(shí)的病斑直徑有顯著的抑制作用。Li 等[32]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌XCT1-10 對(duì)灰霉病菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均有抑制作用，且呈劑量依賴關(guān)系。Lü 等[26]研究表明，植物乳桿菌C10 在體外條件下能顯著抑制T.roseum 菌絲生長(zhǎng)。T.roseum 是一種堿性真菌，會(huì)在高pH 值環(huán)境下引起果蔬腐爛[33]。乳酸菌發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，主要產(chǎn)物乳酸可通過降低生長(zhǎng)環(huán)境的pH 值直接抑制菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)，從而降低其致病性。然而，要全面了解乳酸對(duì)T. roseum 致病性的影響，還需要進(jìn)一步的研究。

細(xì)胞膜在細(xì)胞生命中起著至關(guān)重要的作用，細(xì)胞膜的破壞會(huì)擾亂細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[34]。相對(duì)電導(dǎo)率和相對(duì)電解質(zhì)滲漏通常用來表示細(xì)胞膜的通透性和細(xì)胞膜的受損傷程度。培養(yǎng)4 h 后，添加L. plantarum CY1-2 培養(yǎng)液的相對(duì)電導(dǎo)率高于單獨(dú)接種T.roseum 的培養(yǎng)液。黃玉琴等[35]研究發(fā)現(xiàn)，Bacillus pumilus HN-10 發(fā)酵液蛋白粗提物顯著提高了T.roseum 液體培養(yǎng)條件下的電導(dǎo)率，主要原因是細(xì)胞膜完整性被破壞，從而打破了菌體的保護(hù)屏障。Wei 等[11]發(fā)現(xiàn)，使用ε-聚賴氨酸處理對(duì)T. roseum 生長(zhǎng)的抑制及相對(duì)電導(dǎo)率的變化與電解質(zhì)滲漏有關(guān)。本研究表明，L.plantarum CY1-2 處理破壞了T. roseum孢子胞內(nèi)外電解質(zhì)的平衡，提高了T.roseum 細(xì)胞膜的透性。

MDA 是細(xì)胞膜中膜脂過氧化反應(yīng)的主要產(chǎn)物之一，可引起蛋白質(zhì)、多糖、核酸和其他大分子的交聯(lián)反應(yīng)。本研究表明，L.plantarum CY1-2 處理僅在6 h 提高了膜脂過氧化產(chǎn)物MDA 的含量，其他時(shí)間沒有顯著性差異，說明L.plantarum CY1-2 處理在一定程度上促進(jìn)了T.roseum 細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化。有研究表明，離體條件下，磷酸鈉、ε-聚賴氨酸處理與抑制T. roseum 生長(zhǎng)、破壞其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、提高其胞外MDA含量密切相關(guān)[11-13]。

細(xì)胞內(nèi)容物滲漏是細(xì)胞膜損傷的一個(gè)重要指標(biāo)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種L.plantarum CY1-2 后，T. roseum胞外蛋白質(zhì)含量均明顯高于單獨(dú)接種T. roseum 或L.plantarum CY1-2 的培養(yǎng)液（6 d 除外），可溶性糖含量明顯高于單獨(dú)接種T.roseum 或L.plantarum CY1-2 的培養(yǎng)液。由此說明，L. plantarum CY1-2 破壞了T. roseum 細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白向外滲漏增多，同時(shí)導(dǎo)致了T.roseum 新陳代謝水平降低甚至紊亂，致使其分泌的胞外可溶性糖含量升高，嚴(yán)重影響了其正常生長(zhǎng)和代謝。本研究結(jié)果與植物乳桿菌XCT1-10 對(duì)灰霉病菌的抑制結(jié)果一致[32]。Niu 等[36]研究表明：經(jīng)硅酸鈉處理后，T.roseum 的可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量高于對(duì)照；此外，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)T.roseum 孢子細(xì)胞膜完整性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)L. plantarum CY1-2 處理12 h 時(shí)，T.roseum 的細(xì)胞存活率顯著低于對(duì)照，但除12 h 外，對(duì)照與L. plantarum CY1-2 處理的細(xì)胞存活率無顯著差異，表明L.plantarum CY1-2破壞了T. roseum 孢子的細(xì)胞膜并影響其代謝，但并沒有直接殺死T.roseum。

對(duì)微生物細(xì)胞膜進(jìn)行破壞是一些化學(xué)物質(zhì)作為潛在殺菌劑的作用方式。本研究表明，L. plantarum CY1-2 能夠通過破壞T. roseum 細(xì)胞膜來抑制其生長(zhǎng)，該結(jié)論將為乳酸菌尤其是植物乳桿菌作為一種潛在的生物防腐劑提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

L. plantarum CY1-2 能顯著抑制T. roseum 的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)，并能明顯抑制接種T.roseum 番茄果實(shí)的病斑直徑。1.0×105CFU/mL 的L.plantarum CY1-2 對(duì)T.roseum 的抑制作用與破壞其細(xì)胞膜而使其正常生理代謝受到影響有關(guān)。