CGRP和白藜蘆醇對膿毒性腎損傷大鼠的治療作用

楊美宇，劉赫迪，孫 蕾，孫源博，于建渤

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;2.黑龍江省腫瘤疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011)

膿毒癥主要由細(xì)菌感染，導(dǎo)致的急性腎損傷(Acute kidney injury,AKI)死亡率高達(dá)28%～90%[1]。脂多糖(Lpopolysaccharide,LPS)是一種由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素，廣泛用于構(gòu)建AKI模型，膿毒癥炎性因子產(chǎn)生及釋放、腎血流動力學(xué)改變和細(xì)胞凋亡都參與AKI的發(fā)生[2]。降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin gene related peptide,CGRP)一種生物活性肽，其具有明顯抗炎作用[3-4]。白藜蘆醇是一種天然非類黃酮多酚，其也具有抗氧化、抗炎、抗癌及心血管保護(hù)等作用[5]。SIRT1(Sirtuin1)可調(diào)節(jié)多種蛋白質(zhì)的功能，并證實(shí)其在多種腎臟疾病例如AKI中具有保護(hù)作用[6]。并有研究顯示，CGRP在AKI中可通過增加SIRT1的表達(dá)發(fā)揮其抗炎作用[7]。而白藜蘆醇經(jīng)證實(shí)也是SIRT1有效的化學(xué)激動劑[5]。NLRP3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)是炎性小體中研究最多的，其在缺氧、細(xì)菌毒素等刺激下會促進(jìn)Caspase-1、IL-1β炎性因子釋放并促進(jìn)AKI進(jìn)展，而SIRT1具有抑制NLRP3的作用[8]。本研究通過構(gòu)建LPS膿毒性腎損傷大鼠模型，檢測CGRP和白藜蘆醇兩種藥物對大鼠模型治療效果;同時(shí)研究兩種藥物是否通過影響SIRT1/NLRP3的表達(dá)調(diào)節(jié)炎性因子釋放，從而起到治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動物 6周齡SPF級雄性SD大鼠，共40只，體重(180～200)g，購于遼寧長生生物有限公司，恒溫恒濕[(22±1)°C、(50±1)%]，在實(shí)驗(yàn)室動物護(hù)理設(shè)施中進(jìn)行12 h光照/黑暗循環(huán)，可自由獲取食物和水。

1.1.2 試劑與儀器 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)購自美國Thermo公司;電熱鼓風(fēng)恒溫烘干箱購自上海新苗醫(yī)療器械公司;移液器購自德國Eppendorf公司;SpectraMax M3多功能酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices公司;LPS、CGRP、白藜蘆醇、鼠白細(xì)胞介素1β酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒、Western及IP細(xì)胞裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;RNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司;引物購自上海生工生物工程股份有限公司;八連管、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo公司;兔抗鼠β-actin單克隆抗體、SIRT1、NLRP3及Caspase-1購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建立動物模型 40只大鼠自由攝取食物和水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為四組：以正常飼養(yǎng)未處理大鼠作為對照組;向大鼠腹腔內(nèi)注射LPS 10 mg/kg建立AKI大鼠模型，即LPS組;CGRP+LPS治療組：注射LPS前1周及后1 d腹腔注射CGRP 1 nmol/kg;白藜蘆醇+LPS治療組：注射LPS后6 h、12 h分別腹腔注射白藜蘆醇15 mg/kg。在所有藥物注射完畢后6 h，腹主動脈取血后過量麻醉處死大鼠。

1.2.2 計(jì)算腎臟系數(shù)及影像學(xué)測量腎動脈阻力指數(shù) 在大鼠清醒狀態(tài)下，使用動物超聲儀器并選擇高頻探頭，同時(shí)利用彩色多普勒超聲觀察腎內(nèi)動脈的血流信號及流速情況，測出收縮期峰速(PSV)和舒張末期血流速度(EDV)，并計(jì)算出腎動脈阻力指數(shù)：(PSV-EDV)/PSV。處死大鼠后取出腎臟組織并計(jì)算腎臟系數(shù)。腎臟系數(shù)是指腎臟的濕重與單位體重的比值，通常是每100 g體重中腎臟所占的質(zhì)量，表為臟器重量(g)/體重(100 g)。

1.2.3 HE染色 取大鼠腎臟組織，將其置于4%多聚甲醛溶液中放置24 h，石蠟包埋，切片5 μm,脫蠟，常規(guī)逆梯度乙醇脫水，蘇木素-伊紅染色，再次順梯度乙醇浸泡，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察并拍照。切片機(jī)制作石蠟切片，并將石蠟切片放在37 ℃的培養(yǎng)箱中放置24 h。

1.2.4 ELISA IL-1β、肌酐和尿素氮水平使用ELISA試劑盒進(jìn)行檢測。使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測量吸光度。

1.2.5 Western blot 使用RIPA裂解緩沖液裂解腎組織。使用BCA試劑盒定量蛋白質(zhì)濃度。通過10%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，蛋白上樣跑電泳，分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入稀釋后的一抗(β-actin、SIRT1、NLRP3及Caspase-1)4 °C冰箱孵育過夜，用TBST液漂洗3次，每次5 min，ECL顯影。每個(gè)樣本重復(fù)3次。應(yīng)用Image J軟件分析條帶灰度值，計(jì)算蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 22.0軟件、GraphPad Prism軟件通過單因素方差分析和LSD多重檢驗(yàn)分析結(jié)果，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠腎阻力指數(shù)、計(jì)算腎臟系數(shù)情況與對照組相比，LPS組腎臟系數(shù)及腎動脈阻力指數(shù)增高(P<0.01);與LPS組相比，CGRP+LPS治療組、白藜蘆醇+LPS治組腎臟系數(shù)及腎動脈阻力指數(shù)減低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見l圖1、表1。

圖1 各組大鼠超聲影像

表1 四組大鼠腎臟系數(shù)、腎動脈阻力指數(shù)情況

2.2 四組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)變化情況對照組腎小球結(jié)構(gòu)完整;LPS處理的腎組織中腎小球上皮細(xì)胞腫脹、間質(zhì)水腫，腎小管水腫;CGRP和白藜蘆醇處理顯著減輕LPS 誘導(dǎo)的腎小球和腎小管損傷,見圖2。

圖2 各組大鼠腎臟HE染色(×200)

2.3 四組大鼠血清肌酐和尿素氮情況結(jié)果顯示(如表2)，與對照組相比，LPS組血肌酐及尿素氮明顯升高(P<0.01);與LPS組相比，使用白藜蘆醇治療組，血清肌酐及尿素氮較LPS組有所降低(P<0.05);使用CGRP治療組血清肌酐及尿素氮較LPS組也有所降低(P<0.01)。

表2 四組大鼠腎血肌酐、尿素氮情況

2.4 IL-1β在四組大鼠血清及腎組織中表達(dá)情況結(jié)果顯示(如表3)，與對照組相比，LPS組血清及腎組織IL-1β表達(dá)升高(P<0.05);與LPS組相比，白藜蘆醇+LPS治療組血清及腎組織IL-1β表達(dá)降低(P<0.05);CGRP+LPS治療組血清及腎組織IL-1β表達(dá)降低(P<0.01)。

表3 四組大鼠血清、腎臟組織中IL-1β(pg/mL)表達(dá)情況

2.5 SRIT1、Caspase-1和NLRP3在四組大鼠腎組織中的表達(dá)結(jié)果顯示(如圖3、表4)，與對照組相比，LPS組中SRIT1表達(dá)降低，NLRP3、Caspase-1表達(dá)升高;與LPS組相比，CGRP+LPS組和白藜蘆醇+LPS組SRIT1表達(dá)升高，NLRP3、Caspase-1表達(dá)降低。以上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。

圖3 Western blot檢測各組SIRT1、NLRP3及Caspase-1蛋白表達(dá)情況

表4 四組大鼠腎臟組織SRIT1、NLRP3、Caspase-1表達(dá)情況

3 討論

膿毒血癥是由感染引起全身性炎癥反應(yīng)。腎臟是受攻擊靶器官之一。膿毒癥所致AKI發(fā)病機(jī)制與腎血流動力學(xué)異常、炎癥損傷、細(xì)胞凋亡和適應(yīng)性反應(yīng)密切相關(guān)[9]。本研究使用LPS處理大鼠模擬AKI。通過計(jì)算大鼠腎臟系數(shù)、腎阻力指數(shù)以及HE檢測發(fā)現(xiàn)LPS組腎臟系數(shù)及腎動脈阻力指數(shù)增高、肌酐和尿素氮明顯升高、HE染色顯示LPS組腎小球和腎小管水腫損傷。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)LPS作用大鼠能夠較好模擬AKI。

CGRP參與許多生理和病理生理事件[10]。炎癥介質(zhì)和環(huán)境因素可以直接刺激CGRP釋放。Beihua等發(fā)現(xiàn)CGRP預(yù)處理可顯著改善缺血/再灌注誘導(dǎo)急性腎損傷。CGRP是目前已知最強(qiáng)血管擴(kuò)張劑，其改善LPS所致急性腎損傷可能是與增加腎血流量、改善腎臟缺血缺氧狀態(tài)有關(guān)。白藜蘆醇是一種多酚植物抗毒素并具有抗炎特性，經(jīng)證實(shí)，其對腎臟具有保護(hù)作用。本研究通過查閱文獻(xiàn)，分別選取CGRP和白藜蘆醇的最佳給藥方式，旨在研究兩種藥物是否對AKI大鼠模型起到治療效果，及可能機(jī)制。同時(shí)經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，腎阻力指數(shù)無論升高還是降低均不利于腎臟灌注，AKI大鼠模型經(jīng)CGRP和白藜蘆醇作用后，腎臟系數(shù)及腎動脈阻力指數(shù)減低、肌酐和尿素氮降低、HE染色顯示腎小球和腎小管水腫損傷情況得到改善。結(jié)果提示，CGRP和白藜蘆醇能夠?qū)KI起到治療效果，我們推測兩者的治療作用通過緩解急性腎損傷所致的腎臟灌注不足介導(dǎo)的。

SIRT1在多種腎臟疾病(如AKI)中具有保護(hù)作用?？赏ㄟ^抑制促炎性細(xì)胞因子釋放抑制腎臟疾病進(jìn)展[11]。NLRP3炎性體是一種新發(fā)現(xiàn)的機(jī)制，可觸發(fā)各種炎癥反應(yīng)。SIRT1具有抑制NLRP3炎性體作用[12]。IL-1β是腎臟疾病中重要促炎指標(biāo)[13]，NLRP3炎癥小體激活可通過激活Caspase-1后促進(jìn)IL-1β成熟和分泌。在本研究中，AKI大鼠模型中SIRT1表達(dá)降低，NLRP3、IL-1β及Caspase-1表達(dá)升高，而使用CGRP和白藜蘆醇后逆轉(zhuǎn)上述情況。

綜上所述，經(jīng)過研究證實(shí)，CGRP和白藜蘆醇對AKI大鼠模型可以起到治療作用，提示CGRP和白藜蘆醇對緩解AKI炎性損傷可能有效。

除此，白藜蘆醇和CGRP對AKI治療作用可能通過調(diào)節(jié)SIRT1/NLRP3的表達(dá)，抑制炎性因子釋放，減少炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的。另外，本實(shí)驗(yàn)有局限性，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，CGRP治療效果似乎優(yōu)于白藜蘆醇，但由于給藥時(shí)間不統(tǒng)一而無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，因此無法得知其原因是由于CGRP預(yù)防性給藥還是CGRP對于AKI治療效果本身就優(yōu)于白藜蘆醇，這是值得進(jìn)一步探討。