基于SRAP 標(biāo)記的大別山薯蕷群體結(jié)構(gòu)分析

李仁學(xué) ，江 玲 ，顧 欽 ，李世升，李竟才

（1.黃岡師范學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)資源學(xué)院/大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心/湖北省經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃岡 438000；2.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院/廣西高校植物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530004；3.嶺南師范學(xué)院附中東方實(shí)驗(yàn)學(xué)校，廣東 湛江 440800）

薯蕷（Dioscorea alata）是薯蕷科（Dioscoreaceae R. Br.）薯蕷屬（Dioscorea）單子葉植物［1，2］。目前已知薯蕷科在全球共有10 個(gè)屬，大約650 個(gè)種，在中國(guó)只有 1 個(gè)屬，約 80 個(gè)種［3］。大多數(shù)薯蕷能在地下形成肉質(zhì)塊根，可作為蔬菜食用，口感獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富，也可作為中藥材，具有降糖降脂，抗衰老等功效［4］。因薯蕷具較高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值，人們對(duì)薯蕷的消費(fèi)需求逐年上升。湖北省大別山地區(qū)具有獨(dú)特的地理和氣候優(yōu)勢(shì)，種植薯蕷有300 多年的歷史，在薯蕷資源開發(fā)上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和良好的市場(chǎng)前景［5，6］。薯蕷的人工種植面積在大別山地區(qū)逐年擴(kuò)大，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益，其中尤以佛手山藥最為出名。該地區(qū)于2009 年獲國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志認(rèn)證（中華人民共和國(guó)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量控制技術(shù)規(guī)范編號(hào)AGI2009-04-00165），地域保護(hù)范圍為湖北省大別山地區(qū)武穴市梅川鎮(zhèn)、余川鎮(zhèn)2 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)現(xiàn)轄行政區(qū)域，地理坐標(biāo)為東經(jīng) 115°22′—115°49′，北緯29°50′—30°13′［7］。盡管大別山地區(qū)的薯蕷能產(chǎn)生較高的經(jīng)濟(jì)效益，但育成的薯蕷品種遺傳背景相對(duì)狹窄，血緣關(guān)系相近，常年單一品種連作導(dǎo)致品種種性退化嚴(yán)重，利用遺傳背景寬廣的薯蕷種質(zhì)資源選育出綜合性狀優(yōu)良的品種顯得尤為重要。目前，利用分子標(biāo)記對(duì)作物種質(zhì)資源的選擇鑒定已成為研究熱點(diǎn)之一［8］。分子標(biāo)記能對(duì)目標(biāo)個(gè)體進(jìn)行全基因組選擇，快速篩選出目標(biāo)單株，縮短育種周期。此外，群體結(jié)構(gòu)分析也是判斷品種間遺傳關(guān)系的重要途徑之一。在大別山地區(qū)，薯蕷的遺傳多樣性豐富，外來種的引入和一些栽培種的培育使分類和鑒定工作難度加大［9］，因此需要運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，對(duì)該地區(qū)的薯蕷品種進(jìn)行分子水平的研究，得到不同品種之間的親緣關(guān)系。

薯蕷的遺傳關(guān)系及其相關(guān)性狀形成的分子機(jī)理較為復(fù)雜，有許多學(xué)者利用SRAP、ISSR、SSR 等標(biāo)記做過相關(guān)方面的研究，如李齊向等［10］利用SRAP 和ISSR 分子標(biāo)記對(duì)90 份薯蕷材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)SRAP 標(biāo)記的多態(tài)性條帶和多態(tài)性條帶比率（PPB）比ISSR 標(biāo)記高，更適合分析薯蕷的遺傳多樣性；華樹妹等［11］用系統(tǒng)聚類法構(gòu)建遺傳距離樹狀圖將34 份薯蕷材料分為2 個(gè)類群，判斷出形態(tài)標(biāo)記和分子標(biāo)記都能將薯蕷的相關(guān)性狀區(qū)分開；張文芳［12］利用SSR 分子標(biāo)記對(duì)37 個(gè)品種的薯蕷進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)其品種資源的遺傳距離和遺傳分化系數(shù)基本保持一致；趙容等［13］對(duì)穿龍薯蕷的遺傳多樣性進(jìn)行分析，從分子水平研究不同薯蕷居群內(nèi)及居群間的遺傳多樣性關(guān)系，了解不同居群薯蕷的遺傳差異。

使用分子標(biāo)記來研究薯蕷遺傳多樣性的研究試驗(yàn)較多，但大多是通過分子標(biāo)記進(jìn)行聚類分析［12-15］，而通過SRAP 分子標(biāo)記對(duì)中國(guó)地方薯蕷種質(zhì)資源進(jìn)行的群體結(jié)構(gòu)分析鮮有報(bào)道。本研究以大別山地區(qū)搜集到的48 份薯蕷種質(zhì)資源為材料，運(yùn)用SRAP 分子標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，為大別山地區(qū)薯蕷資源保護(hù)、遺傳研究和品種改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選取的薯蕷材料包括Df2019200、Df2019202、Df2019203 等共計(jì) 48 份（表 1），具有廣泛的遺傳背景，均采自大別山地區(qū)，由湖北省經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（黃岡師范學(xué)院）提供。

表1 材料編號(hào)及來源

1.2 儀器和主要試劑

1.2.1 儀器 GR60DF 型高壓蒸汽滅菌鍋（廈門致微儀器有限公司）；JY-SCZ2 型垂直電泳槽（深圳至德科技有限公司）；JY-1600E 型垂直電泳儀（常州德杜儀器有限公司）；IM-25 型制冰機(jī)（HOSHIZAKI 公司）；SW-CJ-2FD 型超凈工作臺(tái)（鄭州宏朗有限公司）；Pax-250A 型光照培養(yǎng)箱（華城愛華儀器廠）；PTC-100PCR 儀（BIORAD 公司）；FastPrep-24TM5G核酸蛋白提取儀（AURORA 公司）；H-21 臺(tái)式離心機(jī)（江東儀器有限公司）；KE0012305 型微量移液槍（賽默飛世爾科技有限公司）；HH-2 型恒溫水浴鍋（歐萊博科學(xué)儀器有限公司）；-40 ℃冰箱（海爾集團(tuán)公司）。

1.2.2 主要試劑 瓊脂粉、蔗糖、Ms 培養(yǎng)基（不含瓊脂粉和蔗糖）、0.1% NaOH 溶液、70%乙醇、95%乙醇、礦物油、Tris-base、10%過硫酸銨溶液、二甲苯氫、TBE 溶液（國(guó)藥集團(tuán)）；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺（AMRESCO 公司）；Master Mix、DNA Marker、植物基因組DNA 提取試劑盒DP305（天根生化科技有限公司）；TEMED 催化劑（上海阿拉丁生化科技有限公司）。

1.3 組織培養(yǎng)和基因組DNA 的提取

從大別山地區(qū)收集的材料不易保存，為滿足試驗(yàn)需要，對(duì)其進(jìn)行組織培養(yǎng)處理。經(jīng)無菌操作后將擴(kuò)繁好的材料放入光照培養(yǎng)箱或者光照培養(yǎng)室（25 ℃，光照12 h）。將培養(yǎng)好的薯蕷材料取幼嫩葉片100 mg 左右放入2 mL 的離心管，用核酸蛋白提取儀進(jìn)行破碎處理，得到植物組織的勻漿。用植物基因組DNA 提取試劑盒提取薯蕷的基因組DNA，用分光光度計(jì)測(cè)定DNA 濃度。

1.4 SRAP-PCR 擴(kuò)增

PCR 反應(yīng)體系15.0 μL，包括ddH2O 4.0 μL；Master Mix7.5 μL；上下游引物各1.0 μL；DNA模板1.5 μL；礦物油 1～2 滴。相關(guān)引物的合成參照 Li 等［16］研究。SRAP 引物具有特定的擴(kuò)增程序：首先95 ℃預(yù)變性5 min；第一段循環(huán)5 次，95 ℃變性30 s，退火溫度為35 ℃持續(xù)30 s，72 ℃延伸 1 min；第二段循環(huán)35 次，95 ℃變性30 s，退火溫度為 50 ℃持續(xù) 30 s，72 ℃延伸1 min；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。所使用的引物組合（表2）：em1-Me13h、em2-me1、em3-me2、em4-me3、em6-me5、em7-me6、em8-me7、Em8h-Me9h、em9-me7、em9-me8、Em9h-Me9h、Em9h-Me10h、em10-Me6h、em10-me8、em11-Me6h、em11-Me8h、 Em11h-Me10h、 Em11h-Me11h、 Em12h-Me11h、 Em12h-Me12h、 Em13h-Me12h、 Em13h-Me13h。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測(cè)，用AgNO3銀染顯色［17］。

表2 SRAP-PCR 擴(kuò)增的引物序列

1.5 數(shù)據(jù)分析

將銀染后的聚丙烯酰胺凝膠放在燈箱上觀察并拍照，用Quantity one（Biorad 公司）讀帶分析。觀察聚丙烯酰胺膠不同引物位點(diǎn)的條帶，使用Lane Tools建立泳道并手動(dòng)讀帶。讀帶完后在Match 下面找到Match 匹配，匹配好后在Reports 處輸出結(jié)果。得到的結(jié)果經(jīng)數(shù)據(jù)處理后，相同遷移位置有位點(diǎn)處輸出為 1，無位點(diǎn)處記為0，缺失處記為-9［18］。

將得到的結(jié)果用Excel 輸出為TXT 格式，采用Structure2.3.4 分析軟件對(duì)48 份材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析［19］。使用混合模型，先設(shè)置K范圍為 2～7，5 次重復(fù)，再設(shè)置Run Length，開始時(shí)的不作數(shù)迭代（Length of burnin period）為 100 000 次，不作迭代后的（Number of MCMC Reps of burnin）為 130 000 次。Structure 分析得到的結(jié)果保存在文件“Results”，將“Results”文件壓縮成Zip 格式，用于下一步的Structure Harvester 分析來確定出群體結(jié)構(gòu)的最佳K。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP 引物擴(kuò)增結(jié)果分析

選用22 對(duì)具有明顯多態(tài)性的SRAP 引物，對(duì)48份薯蕷材料的基因組DNA 進(jìn)行特異性擴(kuò)增。22 對(duì)特異性引物總共擴(kuò)增出266 條條帶，其中多態(tài)性條帶為 175 條。根據(jù)江東等［20］、劉湘萍等［21］計(jì)算多態(tài)性條帶比率，多態(tài)性條帶數(shù)/擴(kuò)增總條帶數(shù)×100%，根據(jù)王晉等［22］計(jì)算多態(tài)性信息含量（PIC），其中Pij表示在位點(diǎn)i的第j個(gè)等位變異的概率。計(jì)算可得 22 對(duì)SRAP 引物平均多態(tài)性條帶比率為65.76%（表3）。各引物擴(kuò)增出總條帶的范圍在6.00～16.00 條，多態(tài)性條帶的范圍在 4.00～11.00 條，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出的條帶為12.09 條，平均多態(tài)性條帶為7.95 條。多態(tài)性信息含量（PIC）在0.532 0～0.858 1，平均為 0.727 3。引物組 me2-em3、Me9hem8h 和Me11h-Em11h 的特異性最好，都能得到11.00 條多態(tài)性條帶，而Em9h-Me9h 特異性最差，僅有4.00 條多態(tài)性條帶；引物組Em8h-Me9h 的多態(tài)性條帶比率最高，為84.62%，而引物組em9-me7 多態(tài)性條帶比率最低，為50.00%。

表3 22 對(duì)SRAP 引物多態(tài)性統(tǒng)計(jì)

2.2 群體結(jié)構(gòu)分析

基于SRAP 分子標(biāo)記，利用Structure2.3.4 軟件對(duì)48 份大別山薯蕷材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。先設(shè)置K為 2～7，重復(fù)抽樣 5 次，在 Structure Harvester 軟件上在線分析。首先使用K的最大似然數(shù)法來判斷最佳K，以K為橫坐標(biāo)，以其對(duì)數(shù)lnP（K）為縱坐標(biāo)繪制曲線［23］（圖 1）。結(jié)果表明，隨著K增大，lnP（K）也逐漸增大，盡管lnP（K）的增長(zhǎng)速率逐漸放緩，但并沒有出現(xiàn)拐點(diǎn)，所以該曲線圖并不能直接判斷出最佳K［24］。當(dāng)無法直接找出K的最大似然數(shù)時(shí)，可通過△K（K的差值）的最大似然數(shù)來確定最合適的K［25］，因?yàn)椤鱇同時(shí)考慮了對(duì)數(shù)lnP（K）的變化速率和方差，結(jié)果更準(zhǔn)確［26］。根據(jù)Structure Harvester 的結(jié)果，當(dāng)K取 3 時(shí)，DeltaK達(dá)到最大，并首次出現(xiàn)拐點(diǎn)（圖2）。所以可將48 份薯蕷材料分為3 個(gè)亞群（圖3）。圖中顏色的種類代表亞群的數(shù)目，紅色、綠色和藍(lán)色區(qū)域的個(gè)體代表所有的樣本可以分為3 個(gè)不同的亞群。序號(hào)為 20、21、23～35 的 15 份材料屬于紅色亞群，該亞群中的大部分個(gè)體與另2 個(gè)亞群存在基因交流，且20 號(hào)的個(gè)體雜合度最高，達(dá)到0.5 左右；序號(hào)為36～48 的13 份材料屬于綠色亞群，亞群中的個(gè)體大部分為純合個(gè)體，基因交流較少，基因型較為保守；序號(hào)為 1～19 和 22 的 20 份材料屬于藍(lán)色亞群，該亞群中包含的個(gè)體最多，4、6、7 和 13 號(hào)個(gè)體與另 2個(gè)亞群間基本上沒有基因交流，而其余個(gè)體均存在基因交流，且16、22 號(hào)個(gè)體雜合度較高，雜合度超過0.4。通過以上分析可推測(cè)雜合度較高的個(gè)體可能是外來引入，或者是不同親本間相互雜交產(chǎn)生的。

圖1 K 與 lnP（K）曲線

圖2 K 與 Delta K 曲線

圖3 大別山薯蕷群體結(jié)構(gòu)分組

2.3 亞群劃分

根據(jù)采集地點(diǎn)（表1）和群體結(jié)構(gòu)（圖3）分析，大致確定3 個(gè)亞群的范圍。亞群1 主要分布于高頭灣、余川小學(xué)、田慶二村、彭家灣、毛家灣、鼓嶺、郝家灣、老虎墩、蛤蟆壟和毛栗尖；亞群2 主要分布于方細(xì)灣、蘇家鋪、徐灣、梅家灣和王坦；亞群3 主要分布于肖家灣和塘凹。其中22 號(hào)個(gè)體在蘇家鋪采集，但卻劃分為亞群1，且個(gè)體高度雜合，可能是該個(gè)體由亞群1 和亞群2 的的親本經(jīng)雜交產(chǎn)生。

3 討論

SRAP 分子標(biāo)記也稱相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性，是評(píng)價(jià)植物遺傳多樣性的一種高效、簡(jiǎn)便的標(biāo)記體系，由 Li 等［16］開 發(fā) ，同 時(shí) 兼 具 了 RAPD 和 AFLP 的 優(yōu)點(diǎn)［27］。通過1 對(duì)獨(dú)特的引物對(duì)開放閱讀框（ORF）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，最終由于物種以及個(gè)體之間的差異導(dǎo)致內(nèi)含子和外顯子的間隔序列不同形成多態(tài)性。近年來，由于SRAP 分子標(biāo)記操作簡(jiǎn)便，引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于高等植物的遺傳多樣性研究、DNA 圖譜的構(gòu)建等方面［28］。相較于其他分子標(biāo)記，SRAP 分子標(biāo)記產(chǎn)生的多態(tài)性位點(diǎn)更多，更適用于復(fù)雜植物基因組的研究。

中國(guó)薯蕷均屬于亞洲類群，目前只發(fā)現(xiàn)二倍體類群，暫未發(fā)現(xiàn)多倍體類群，但染色體及其核型組成較為復(fù)雜，不同亞群之間的染色體數(shù)差異較大，這直接導(dǎo)致了其遺傳結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣。一般分子水平的研究無法準(zhǔn)確定位其遺傳機(jī)制，而分子標(biāo)記技術(shù)的興起為薯蕷遺傳多樣性的研究帶來了便利。十年前，已有學(xué)者開始用分子標(biāo)記開展對(duì)薯蕷遺傳多樣性的研究。李勇慧等［29］用 AFLP 標(biāo)記研究了 5 個(gè)薯蕷亞群的遺傳結(jié)構(gòu)，其多態(tài)性條帶比率高達(dá)85.92%。AFLP 標(biāo)記為第一代分子標(biāo)記技術(shù)，盡管具有較高的多態(tài)性，但操作較為繁瑣，沒有SRAP 標(biāo)記簡(jiǎn)便。SRAP 標(biāo)記基本上具有AFLP 標(biāo)記所有優(yōu)點(diǎn)，并且所需DNA 純度更低。本研究利用22 對(duì)SRAP 引物進(jìn)行基因組DNA 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)生266.00 條條帶，其中多態(tài)性條帶175.00 條，平均多態(tài)性條帶比率為65.76%，最高一組引物組合的多態(tài)性條帶比率甚至達(dá)到84.62%，表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性和較高的多態(tài)性 ，與 其 他 學(xué) 者［3，10，13，15］的 研 究 基 本 一 致 。 因 此 ，SRAP 分子標(biāo)記可適用于薯蕷遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析。

在植物群體遺傳學(xué)的相關(guān)研究中，群體結(jié)構(gòu)分析是最常見也是最初步的分析內(nèi)容，能夠分析植物群體中的基因、基因型頻率的變化情況，從分子水平上揭示植物群體的遺傳關(guān)系、環(huán)境適應(yīng)性等系列問題［30］。群體結(jié)構(gòu)分析最常用的3 種方法是PCA、樹形圖以及 Structure 分析，而 Structure 分析與 PCA、樹形圖相比，除了能分析生物群體的遺傳結(jié)構(gòu)，還可以分析群體間是否存在基因交流以及基因交流的程度有多少。本研究采用的Structure2.3.4 軟件能準(zhǔn)確分析出群體數(shù)目、某個(gè)個(gè)體遺傳以及雜合個(gè)體的鑒定。

其他學(xué)者［31，32］對(duì)薯蕷遺傳多樣性的研究大多是基于相關(guān)性狀的聚類分析。聚類分析的原理是計(jì)算材料之間的遺傳相似系數(shù)，以此來判斷親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，在選擇相似系數(shù)的水平上會(huì)帶有個(gè)人主觀因素而造成誤差［22］，而群體結(jié)構(gòu)分析是根據(jù)貝葉斯模型來模擬計(jì)算亞群的最佳K，避免了人為主觀因素，所以群體結(jié)構(gòu)分析用于薯蕷遺傳多樣性的研究更為可靠。本研究中薯蕷亞群的最佳K為3，表示可將48 份薯蕷材料劃為3 個(gè)亞群。3 個(gè)亞群中的部分個(gè)體并不是單獨(dú)在一個(gè)亞群中存在，而是在3 個(gè)亞群中互相滲透。亞群1 的個(gè)體數(shù)較多且分布分散，與其他亞群基因交流較多，基因和基因型組成較為復(fù)雜，具有豐富的遺傳多樣性；亞群2 的個(gè)體比亞群1的個(gè)體稍少，與其他亞群間也存在基因交流；亞群3個(gè)體數(shù)最少但分布比較集中，基因和基因型相對(duì)保守，與其他類群交流較少。3 個(gè)亞群的劃分與大別山地區(qū)特殊的薯蕷地理分布有關(guān)，該地區(qū)有著豐富的薯蕷資源，并由于地理隔離，從而導(dǎo)致亞群的基因頻率、基因型頻率發(fā)生改變，形成不同的亞群。而同一亞群中的某些個(gè)體與其他個(gè)體基因型相差極大，可能是外來種的引入以及交叉種植等原因造成的。

薯蕷作為大別山地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物，其種質(zhì)資源種類繁多，種植范圍較廣，地理隔離、外來引種和人工選育等原因?qū)е履承┓N群基因型發(fā)生了變化，影響了大別山地區(qū)薯蕷的生產(chǎn)引種和品種改良。所以，首先要保證當(dāng)?shù)貎?yōu)良品種的基因純合，避免與其他外來種隨意交叉種植，造成后代性狀分離嚴(yán)重，不利于種質(zhì)資源的收集和利用，其次，為防止連作導(dǎo)致優(yōu)良品種種性退化，可選擇當(dāng)?shù)貎?yōu)良的推廣品種與外來農(nóng)藝性狀較好的品種通過雜交產(chǎn)生新變異，獲得雜種，并通過選擇與比較鑒定進(jìn)行優(yōu)中選優(yōu)，從而培育出更高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的新品種。在種質(zhì)資源收集和利用中，可以對(duì)遺傳多樣性豐富的地區(qū)進(jìn)行重點(diǎn)保護(hù)，盡可能地多進(jìn)行單株選育，培育出性狀優(yōu)良的種子和幼苗。同時(shí)，可結(jié)合分子標(biāo)記、生物信息學(xué)和高通量測(cè)序技術(shù)，揭露薯蕷的遺傳關(guān)系以及重要農(nóng)藝性狀形成的分子機(jī)理，為大別山地區(qū)薯蕷資源保護(hù)、遺傳研究和品種改良奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

大別山地區(qū)的薯蕷具有豐富的遺傳特性。建議對(duì)大別山地區(qū)的薯蕷資源進(jìn)行重點(diǎn)搜集和保護(hù)，除合理利用當(dāng)?shù)氐姆N質(zhì)資源外，可適當(dāng)引種來進(jìn)一步拓寬其遺傳多樣性，為薯蕷品種改良和生產(chǎn)實(shí)踐提供指導(dǎo)。