林藥猴耳環(huán)無糖組培生根技術(shù)對比研究

王 立，陳祖旭，黃宏健，陳小玲，陳啟民，黃世能

（1.江門市新會區(qū)林業(yè)科學(xué)研究所，廣東 江門 529100；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所，廣州 510520）

猴耳環(huán)［Pithecellobium clypearia（Jack）Benth.］為豆科猴耳環(huán)屬多年生高大喬木，又名圍涎樹、蛟龍木、落地金錢、雞三樹、尿桶公等，廣布中國的浙江、廣東、廣西、福建、臺灣及云南等地區(qū)，具有抗菌消炎、活血散結(jié)等作用，是具清熱解毒、去濕斂瘡功效的藥材來源，已被列入中國中藥保護品種［1，2］。猴耳環(huán)的葉子、果實和嫩枝均可入藥，具有清熱解毒、涼血消腫等功效，主要用于上呼吸道感染，用于治療咽喉炎、急性扁桃體炎、肺炎及急性胃腸炎等［3-5］。猴耳環(huán)單方制劑——猴耳環(huán)消炎片作為抗炎及呼吸道疾病藥已得到廣泛的應(yīng)用，其處方劑型為猴耳環(huán)嫩枝葉的水提浸膏。此外，猴耳環(huán)亦有明顯的抗流感病毒作用，猴耳環(huán)水提物對呼吸道合胞病毒（RSV，Respiratory syncytial virus）有體外抑制作用［6］。

目前，國內(nèi)有不少對猴耳環(huán)的研究報告，如劉欣等［7］探究了水分脅迫對猴耳環(huán)種子萌發(fā)及生理特性的影響，發(fā)現(xiàn)水分脅迫還促進了猴耳環(huán)種子萌發(fā)過程中相對電導(dǎo)率、Pro、MDA 及可溶性蛋白的積累，水分脅迫下種子萌發(fā)過程中SOD、POD 活性均不同程度地表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢。李浩等［8］發(fā)現(xiàn)不同遮陽度對猴耳環(huán)苗木的生長有顯著影響，過高的遮陽度導(dǎo)致較低的苗木存活率，且生長緩慢而植株纖弱，田間培育猴耳環(huán)苗木，遮陽度不宜超過60%。

大部分關(guān)于猴耳環(huán)的研究偏重于藥理及藥用效果，對種植試驗也有不少報道，在傳統(tǒng)育苗方面雖然有部分報道，但在組培新技術(shù)及對照生長方面鮮見詳細報道［9-11］。猴耳環(huán)藥材主要來源于野生資源，過度的開發(fā)采集導(dǎo)致野生藥材蘊藏量急劇下降，無法滿足市場需求［12］。為保證藥材供應(yīng)，保護野生資源，實現(xiàn)藥材資源可持續(xù)利用，本研究開展了對猴耳環(huán)外植體獲取及生根培養(yǎng)的研究和篩選試驗，為其工廠化生產(chǎn)技術(shù)體系的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的野生猴耳環(huán)種子由中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所提供。

1.2 方法

猴耳環(huán)的種子具有共生菌，用種子胚芽消毒污染率較高，因此試驗選取幼苗的腋芽作為外植體。將顆粒飽滿、表形完好的猴耳環(huán)種子在無公害環(huán)境下播種，獲得實生苗后進行腋芽提取。將腋芽提取后的外植體經(jīng)消毒，增殖3 代后轉(zhuǎn)移到不同的組培環(huán)境中進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度均為26 ℃，濕度70%。將2 種方式培植出的猴耳環(huán)馴化后移栽到不同的基質(zhì)中進行種植試驗，共設(shè)7 個處理組（表1），每個處理種植苗木60 株，分4 個小區(qū)重復(fù)，每個小區(qū)種植15 株。

表1 猴耳環(huán)外植體的不同消毒處理

將培植出來的猴耳環(huán)小苗移栽到以黃心土、河沙、泥炭土這3 種基質(zhì)為主的不同配比試驗組中種植，在陰棚內(nèi)育苗，培養(yǎng)60 d 后觀測生長情況，記錄苗高和地徑。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2020 軟件整理，SPSS 22.0軟件進行差異分析與顯著性檢驗（LSD法）進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒劑組合對猴耳環(huán)外植體的消毒影響

在對猴耳環(huán)外植體消毒過程中，不同的消毒劑組合對離體材料有不同的影響（表2），7 種消毒處理方法均有一定的消毒效果。用益培隆消毒的樣品污染較為嚴重，雖然能看到腋芽萌發(fā)，但是材料轉(zhuǎn)接后因為污染多不能使用，用升汞消毒滅菌效果較好，但萌芽率低。處理C、E 和G 的平均污染率較低，均在30.00%以下；褐化率D、E、F 和 G 處理較為接近，分別為32.50%、35.50%、33.50%和35.00%；F 處理雖然萌芽率最高，為77.00%，但污染率高達86.50%；D、F和G 處理萌發(fā)率分別為73.00%、77.00%、76.00%，萌發(fā)效果接近。綜合比較可得，在外植體獲取階段，E和G 處理效果較好。

表2 不同消毒組合對外植體消毒效果的影響

因此，可得出猴耳環(huán)的外植體使用乙醇消毒后，用次氯酸鈣或愛力克處理，二者可獲得低污染率和70.00%以上的高萌發(fā)率，但使用次氯酸鈣的污染率要比愛立克低且更經(jīng)濟，可以得出處理E 為最佳處理。即猴耳環(huán)外植體最適宜的消毒方式是先用75.00%乙醇處理1 min，再用5.00%的次氯酸鈣溶液處理25 min。

上述方法處理后，分別用無菌水沖洗3 次，每次不少于1 min，吸干水接種于萌發(fā)培養(yǎng)基上。

2.2 不同組培方式對猴耳環(huán)生根的影響

將獲得的外植體通過增殖培養(yǎng)后將其分別轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基及無糖組培培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，傳統(tǒng)組培生根經(jīng)培養(yǎng)40 d 后，將瓶苗轉(zhuǎn)移到露天環(huán)境下放置1～2 周。本試驗傳統(tǒng)組培選取1/2 MS 為基本培養(yǎng)基，以空白培養(yǎng)基為對照組，培養(yǎng)40 d。

不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度對猴耳環(huán)傳統(tǒng)組培和無糖組培的生根率和移栽成活率有不同的影響（表3），其中對傳統(tǒng)組培的影響較大，對無糖組培的影響較小。從傳統(tǒng)組培的生根情況可發(fā)現(xiàn)，IBA 0.30 mg/L+NAA 0.05 mg/L 組合的生根率和移栽成活率均為最低，分別為44.10%及79.20%；隨著IBA 和NAA 組合濃度的升高，生根率和移栽成活率稍有上升，在IBA 0.40 m/L+NAA 0.10 mg/L 的組合中生根效果最佳，生根率和移栽成活率分別達70.30%及92.20%。從無糖組培的生根情況可知，無論IBA 和NAA 如何搭配，生根率均為100.00%，而移栽的成活率稍有不同，成活率最高的搭配是IBA 0.40 mg/L+NAA 0.05～0.10 mg/L，均為99.90%，試驗中最低的移栽成活率也達到98.30%，對照組的移栽成活率也能達97.30%，高于傳統(tǒng)組培的最高值92.20%。

表3 不同培養(yǎng)方式下的生長調(diào)節(jié)劑濃度對猴耳環(huán)生根率和移栽成活率的影響

不同組培方式及不同基質(zhì)搭配對猴耳環(huán)植株的生長存在一定差異（表4），不同組培方式下猴耳環(huán)平均根長及根數(shù)存在極顯著差異（P＜0.001），不同的基質(zhì)搭配下不同培養(yǎng)方式的猴耳環(huán)苗高及地徑均存在極顯著差異（P＜0.001）。

表4 參數(shù)指標(biāo)的方差分析

不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度對猴耳環(huán)傳統(tǒng)組培和無糖組培的根系生長有不同的影響（表5），在傳統(tǒng)組培方式下IBA 0.40 mg/L+NAA 0.10 mg/L 組合的平均根長最長，根數(shù)最多，分別達5.55 cm 和7.94 條，但幼苗生長情況一般，IBA 0.30 mg/L+NAA 0.05 mg/L組合的平均根長最短，根數(shù)最少，分別為4.08 cm 和3.24 條，幼苗生長較差。無糖組培方式下，平均根長最長，根數(shù)最多的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度仍然是IBA 0.40 mg/L+NAA 0.10 mg/L 組合且幼苗生長情況較好，根長及根數(shù)分別達7.31 cm 和9.00 條。

表5 不同培養(yǎng)方式下的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度對猴耳環(huán)根系生長的影響

2.3 不同組培方式下猴耳環(huán)的生根情況

試驗過程中發(fā)現(xiàn)，在傳統(tǒng)組培方式下發(fā)現(xiàn)猴耳環(huán)基部在誘導(dǎo)出根時根系表現(xiàn)粗短、膨大、畸形且愈傷組織較多（圖1），不少植株在莖底部出現(xiàn)愈傷組織，生根過程中小苗有出現(xiàn)葉片變黃且提前落葉，而在無糖組培方式下誘導(dǎo)生根的效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)組培且根系發(fā)達整齊、伸展性好、小苗健壯、葉色翠綠（圖2）。

圖1 猴耳環(huán)傳統(tǒng)組培生根苗

圖2 猴耳環(huán)無糖組培生根苗

2.4 不同培養(yǎng)基質(zhì)搭配對猴耳環(huán)苗期生長的影響

不同種植基質(zhì)對猴耳環(huán)苗期生長有不同的影響（表6）。在河沙與泥炭土（1∶1）的基質(zhì)中猴耳環(huán)的苗高最高，傳統(tǒng)組培苗高達10.57 cm，無糖組培苗高達14.61 cm，其次是黃心土+河沙+泥炭土（1∶1∶1），傳統(tǒng)組培苗高為9.98 cm，無糖組培苗高為13.53 cm，而河沙（100%）的苗高最矮，傳統(tǒng)組培苗高為8.68 cm，無糖組培苗高為11.42 cm。在黃心土+河沙+泥炭土（1∶1∶1）的基質(zhì)中，猴耳環(huán)的地徑最寬，傳統(tǒng)組培苗地徑為2.70 mm，無糖組培地徑為3.59 mm，其次是河沙+泥炭土（1∶1），傳統(tǒng)組培苗及無糖組培苗地徑分別為2.47 mm 和3.31 mm，泥炭土（100%）效果也較優(yōu)，傳統(tǒng)組培苗及無糖組培苗地徑分別為2.37 cm和3.36 mm。地徑生長較差的配比是黃心土+泥炭土（1∶1），傳統(tǒng)組培苗及無糖組培苗地徑分別2.15 mm和3.15 mm，以及河沙（100%），傳統(tǒng)組培苗及無糖組培苗地徑分別為2.24 mm 和3.29 mm。

表6 不同的培養(yǎng)基質(zhì)配比對猴耳環(huán)苗期生長的影響

3 小結(jié)

無糖組培方式下的幼苗生長情況優(yōu)于傳統(tǒng)組培方式，表現(xiàn)在無糖組培方式下培養(yǎng)出的幼苗在所有經(jīng)試的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度中，平均根長均長于傳統(tǒng)組培苗，在同一濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度中，根數(shù)也多于傳統(tǒng)組培苗。在植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度使用上，植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度對無糖組培苗的生根情況影響不大，即是在沒有生長調(diào)節(jié)劑的情況下，生根率也能達100.00%，移栽成活率能達97.30%，高的移栽成活率，表明無糖組培苗對環(huán)境的適應(yīng)性強，移栽過程中免去洗苗這一步驟，降低對根系的損傷，對苗的成活也有較大關(guān)系。

在苗期的生長過程中，不同的種植基質(zhì)對猴耳環(huán)生長有較大的影響，最佳的基質(zhì)體積配比為河沙+泥炭土（1∶1）和黃心土+河沙+泥炭土（1∶1∶1），對苗高和地徑的生長都是顯著促進作用；在7 種不同基質(zhì)配比的種植試驗中，無糖組培苗的苗高與地徑都優(yōu)于傳統(tǒng)組培苗，可能是由于無糖組培的移栽省略了傳統(tǒng)組培洗苗和緩苗步驟的原因，縮短了幼苗適應(yīng)新環(huán)境的時間，提高了育苗的效率。

猴耳環(huán)組培生根及移栽是其產(chǎn)業(yè)化、商品化的重要環(huán)節(jié)，本研究結(jié)果表明，運用無糖組培技術(shù)在猴耳環(huán)生根過程中能提高生根率及成活率，不僅操作便捷可行而且能減少使用植物生長調(diào)節(jié)劑的用量，降低育苗成本，適合商品化生產(chǎn)的要求。